Dio 2:Verbaskozid štiti ćelije pankreasa od ER-stresa
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 i Carla Perego 1,*
Molimo kliknite ovdje nazad na 1. dio
3.4 Verbaskozid modulira -ćelije Mitohondrijalna aktivnost i dinamika
MTT testovi održivosti ukazuju na mogući uticajverbascosidedirektno na mitohondrije što osigurava spajanje sekrecije inzulina s nutritivnim stanjem i opstanak ćelije u ovom tipu ćelije. Oblik i membranski potencijal su markeri zdravlja mitohondrija [42]. Prvo smo procijenili potencijal mitohondrijalne membrane označavanjem stanica s MitoSpyw Orange CMTMRos, propusnom bojom čija koncentracija ovisi o potencijalu unutrašnje mitohondrijske membrane, dok je MitoSpyw Green FM korišten za normalizaciju podataka na mitohondrijalnu masu (Slika 4A, B). Membranski potencijal mitohondrija uverbascoside-tretirane ćelije su povećane u poređenju sa kontrolom iu bazalnim i u stresnim uslovima. Zanimljivo,verbascosidemetaboliti su imali različite efekte. Kafe kiselina nije poboljšala mitohondrijski potencijal, dok je hidroksitirosol uzrokovao dozno-zavisno oštećenje mitohondrijalne funkcije, u skladu sa podacima o vitalnosti ćelija, takav efekat je bio očigledniji nakon izlaganja H2O2 (Slika S3).
Budući da je funkcija striktno povezana s morfologijom, izmjerili smo Feretov promjer, površinu i kružnost mitohondrija. Akutni oksidativni stres potiče ekstenzivnu mitohondrijsku fisiju, što rezultira manjim, kružnim mitohondrijama [42]. U uslovima H2O2 stresa, mitohondrije ćelija tretiranih verbaskozidom bile su izduženije i pokazale su povećanu površinu od kontrolnih (Slika 4C,D i Slika S4). Kružnost mitohondrija bila je niža u ćelijama tretiranim verbaskozidom nego u kontrolama, a razlike su bile očiglednije u ćelijama tretiranim H2O2 (Slika S3), ponovo potvrđujući zaštitnu ulogu polifenola.
Sposobnost ovih organela da modifikuju svoj oblik kao odgovor na stanja ishrane ili stresne uslove je pod kontrolom događaja fuzije i fisije i zahteva pokretljivost mitohondrija [39]. Praćenje kretanja mitohondrija dovelo nas je do izračunavanja kumulativne pređene udaljenosti i analiza je otkrila značajno povećanje dinamike mitohondrija u ćelijama tretiranim verbaskozidom u poređenju sa kontrolom, već u bazalnim uslovima (Slika 4E, F i video snimci S1-S4). Efekat je bio izraženiji nakon tretmana s H2O2, zaista je predtretman verbaskozidom gotovo u potpunosti poništio utjecaj oksidativnog stresa na dinamiku mitohondrija.
Uzeti zajedno, ovi podaci snažno podržavaju ključnu ulogu verbaskozida u osiguravanju dinamike mitohondrija koja je ključna za promicanje brze adaptacije ove organele na stresne uvjete.
3.5 Langerhansov utjecaj verbaskozida na preživljavanje i funkciju ljudi
S obzirom na translacijski potencijalverbascosideprimjenu u ljudskom zdravlju, potvrdili smo njegov utjecaj na izolovane Langerhansove otočiće kod ljudi, relevantniji model za fiziopatološke i farmakološke studije na -ćelijama. Izolovana otočića tretirana su sa 16 uM verbaskozida 5 dana i procijenjen je potencijal mitohondrijalne membrane. Kao što je prikazano na slici 5A, dok je potencijal organela bio ugrožen u kontrolnim ljudskim otočićima nakon izlaganja H2O2, potencijal unutrašnje membrane mitohondrija u otočićima prethodno tretiranim verbaskozidom nije se značajno smanjio, podržavajući hipotezu o zaštitnoj ulozi verbaskozida protiv ROS-induciranih - disfunkcija ćelija. Analiza ekspresije ER-stres markera pokazala je značajno smanjenje frakcije P-eIF2 u dva različita preparata otočića održavana u 16 uM verbaskozida, potvrđujući smanjenje ovog puta i kod ljudskih uzoraka (Slika 5D). Blagotvorni efekti tretmana polifenolom potkrijepljeni su povećanim sadržajem inzulina uočenim u otočićima tretiranim verbaskozidom u poređenju sa kontrolama (Slika 5B). Disperzija podataka u našim eksperimentima nije omogućila da se pokaže bilo kakva značajna razlika u lučenju insulina stimulisanom glukozom (GSIS) u otočićima tretiranim verbaskozidom, iako se čini da je pozitivan trend očigledan i pod bazalnim i pod stresnim uslovima (Slika 5C).
4. Diskusija
Oksidativni stres i upala su osnova disfunkcije ćelija koja se javlja tokom T2D [43,44], kao takva, funkcionalna hrana, nutraceutici i fitokemikalije su istraženi kao alati za prevenciju dijabetesa tipa 2 [45]. U ovom radu fokusirali smo se na verbaskozid, za koji je poznato da ima protuupalno i antioksidativno djelovanje u neuronima [18]. Uprkos visokoj strukturnoj složenosti, verbaskozid i izoverbaskozid su pronađeni u krvnoj plazmi štakora hranjenih ekstraktom Lippia citriodora zajedno sa nekim metabolitima [20]. Osim toga, akumulacija verbaskozida i verbaskozida u ćelijama je otkrivena u ćelijskoj liniji raka dojke SKBR3 [23], a studije provedene na Caco-2 stanicama pokazuju da umjerene količine verbaskozida i izoverbaskozida ostaju netaknute i biodostupne nakon in vitro digestije proces. Nadalje, Caco{13}} može preuzeti oba molekula brzim i linearnim transportom u opsegu od 10 do 100 uM [22]. Nisu prijavljeni podaci o bioraspoloživosti verbaskozida kod ljudi, ali gore navedene studije sugeriraju da je moguće da nemetabolizirani verbaskozid prođe crijevnu barijeru, cirkulira u krvnoj plazmi i ispoljava antioksidativne efekte na endokrine stanice. pankreas.
Pronašli smo dozno zavisnu (0.8–16 uM) zaštitnu ulogu verbaskozida na klonske i ljudske ćelije, kako u bazalnim tako i pod stresnim uslovima. Ovaj učinak je posljedica samog verbaskozida, a ne njegovih metabolita kofeinske kiseline i hidroksitirozola, koji se u koncentraciji od 16 uM zapravo čine citotoksičnim. Koncentracije koje su dokazano aktivne u našim eksperimentima su u skladu s onima opisanim kod životinja hranjenih verbaskozidom [20].
Iako ne znamo da li verbaskozid djeluje ekstracelularno vezivanjem na membranski receptor ili se internalizira endocitozom i djeluje intracelularno, naši podaci potvrđuju da verbaskozid ima antioksidativna i protuupalna svojstva, te štiti stanice od ER-stresom povezanih disfunkcija smanjujući disfunkcije. UPR i promicanje mitohondrijalne dinamike.
Zaista, otkrili smo značajno smanjenje sadržaja ROS u ćelijama tretiranim verbaskozidom, što je dalje potvrđeno smanjenjem lipidne peroksidacije mjerene preko HNE i ekspresije akroleina. Za razliku od većine biljnih polifenola, aktivnost uklanjanja ROS verbaskozida uglavnom slijedi indirektne (putem regulacije enzima koji uklanjaju ROS), a ne direktne puteve. U stvari, povećava transkripciju gena nekih antioksidativnih enzima kroz aktivaciju Nrf2 (NF-E2-povezanog faktora 2) puta i putem mehanizma ovisnog o AhR (aril ugljovodonični receptor) [24,29]. Kao takvi, otkrili smo povećanu ekspresiju SOD1 u ćelijama tretiranim verbaskozidom.
ROS homeostaza je izuzetno relevantna u patologiji ćelija. Zbog nedostatka antioksidativnih enzima, povećana proizvodnja ROS-a ne može se neutralizirati i inducira se ER stres koji potiče pogrešno savijanje proteina. ER stres dovodi do smanjenja transkripcije i translacije inzulina kroz aktivaciju UPR-a [44,46]. Ovaj put ima glavnu svrhu obnavljanja funkcije ER kroz reprogramiranje ekspresije gena, međutim, kada je pretjerano stimuliran, pokreće apoptozu. Naši podaci sugeriraju da je važno djelovanje verbaskozida ublažavanje UPR-a, omogućavajući modifikacije potrebne za popravku disfunkcije ER, bez izazivanja apoptoze. Prema ovoj mogućnosti, ekspresija BIP, HSP70 i PERK proteina je smanjena u ćelijama tretiranim verbaskozidom, a aktivacija PERK puta je oslabljena kao odgovor na ER stres izazvan tunikomicinom. Slično djelovanje je prijavljeno za tirozol u ćelijskoj liniji insulinoma NIT-1 [47].
Posebno je zanimljiva sposobnost verbaskozida da modulira aktivaciju PERK ogranka UPR-a. U -ćelijama ovaj put je neophodan za održavanje bazalne sekretorne homeostaze i preživljavanja -ćelija, a kod dijabetesa je ozbiljno deregulisan [41,48]. Još intrigantnije, uobičajene varijante PERK-a doprinose riziku od predijabetesa, a recesivne mutacije u genu EIF2AK3 (koji kodira PERK) leže u osnovi osjetljivosti na Wolcott-Rallisonov sindrom karakteriziran trajnim neonatalnim dijabetesom zavisnim od inzulina [49,50].
Smanjenje regulacije IKB-NFKB inflamatornog puta je takođe otkriveno u našem sistemu u prisustvu verbaskozida. NFKB predstavlja glavni inflamatorni put u -ćelijama i njegova trajna aktivacija pokreće kaskadu događaja koji kulminiraju -ćelijskom smrću. U ćelijama pod stresom, smanjenje ekspresije NFKB štiti ćelije pankreasa od dijabetogenih agenasa [27,51], dodatno podržavajući primenu verbaskozida u prevenciji dijabetesa. Zanimljivo je da PERK signalizacija aktivira faktore transkripcije NFR2 (upletene u redoks homeostazu) i NFKB, objašnjavajući tako antioksidativne i antiinflamatorne efekte verbaskozida [40,52].
Naši podaci također otkrivaju važnu ulogu verbaskozida na mitohondrijalnu aktivnost i dinamiku.
Marker operativnog kvaliteta mitohondrija je njihova dinamika, proces koji karakterišu koordinirani ciklusi događaja fuzije i fisije koji regulišu mitohondrijski broj, distribuciju, morfologiju i membranski potencijal [39]. U skladu sa ovom mogućnošću, verbaskozid poboljšava potencijal tc3 mitohondrijalne membrane kako u bazalnim tako i pod stresnim uslovima. Opet, učinak je posljedica verbaskozida, a ne njegovih metabolita, jer kofeinska kiselina ne poboljšava funkciju mitohondrija, a hidroksitirosol značajno smanjuje potencijal organela. Povećana dinamika mitohondrija i promjene u njihovoj morfologiji uočene su praćenjem kretanja mitohondrija, što sugerira da verbaskozid promovira program mitomorfoze. Preoblikovanje ćelijske mitohondrijalne mreže utiče na sklapanje superkompleksa respiratornog lanca, menjajući tako ne samo metabolizam ćelije već i njeno redoks stanje i omogućavajući ćelijama da se bolje suprotstave oksidativnom stresu i upali [5,37,39].
Iako je molekularni mehanizam još uvijek nepoznat, možemo pretpostaviti da verbaskozid, kao i drugi polifenoli, štiti mitohondrijsku DNK smanjenjem koncentracije ROS [53] i sprječava otvaranje prelaznih pora mitohondrijalne permeabilnosti [54], osiguravajući fiziološku mitohondrijalnu aktivnost. Još jedna intrigantna mogućnost je da je modifikacija dinamike i aktivnosti mitohondrija ponovo posredovana djelovanjem verbaskozida na UPR. Zaista, nedavno istraživanje na polju mitohondrija ukazuje da mjesta interakcije ER-mitohondrija igraju ključnu ulogu u kontroli dinamike i aktivnosti mitohondrija kao odgovor na oksidativni stres i PERK je uključen u fenomen [55]. Većina in vitro studija sa polifenolima izvedena je na ćelijskim linijama, često tumorskog porekla, koje se razlikuju od originalnih ćelija u smislu metabolizma i proizvodnje ROS. Ovdje pružamo dokaze da verbaskozid ima zaštitni učinak i na izolovana Langerhansova otočića ljudi, krajnju metu intervencije kod dijabetesa. Zanimljivo je da polifenol ublažava PERK signalnu aktivaciju već u bazalnim uvjetima, čime se povećava sadržaj inzulina i sprječavaju mitohondrijalne disfunkcije posredovane oksidativnim stresom. Ostaje da se razjasni da li efekat polifenola na sadržaj insulina odražava sposobnost jedinjenja da spreči smrt ćelija, da ublaži ER stres ili da direktno kontroliše ekspresiju inzulinskog gena, kao što je pokazano za druga polifenolna jedinjenja [56]. Ovi podaci su posebno relevantni s obzirom na moguću primjenu verbaskozida kao komplementarne terapije u liječenju dijabetesa.
5. Zaključci
Ovdje objavljene in vitro studije na klonskim i ljudskim stanicama pokazuju da verbaskozid ispoljava zaštitne efekte protiv disfunkcija povezanih sa ER stresom, ublažavajući aktivaciju PERK grane UPR-a i poboljšavajući dinamiku mitohondrija. Kako poremećaj homeostaze ER izaziva oštećenje ćelija i dijabetes, ovi podaci daju obrazloženje za moguću upotrebu verbaskozida kao nutraceutika u prevenciji i liječenju bolesti. Ipak, potrebno je riješiti mnoga pitanja za efikasnu kliničku primjenu verbaskozida. Uprkos obilju laboratorijskih studija, pouzdane kliničke studije koje potvrđuju zdravstvene efekte verbaskozida in vivo su ograničene. Nadalje, povećanje njegove stabilnosti i bioraspoloživosti je obavezno za buduću primjenu ovog spoja u ljudskom zdravlju. S ove tačke, verbaskozid je zanimljiva molekula jer njegova skela ima različita reaktivna mjesta koja se mogu modificirati kombinatornom hemijom. Očekujemo da će informacije koje proizilaze iz ovih studija otvoriti puteve za terapeutsku modulaciju oksidativnog stresa i upala u patološkim stanjima korištenjem prirodnih spojeva.
Dodatni materijali: Sljedeće je dostupno na mreži na http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1. Slika S1: Efekti kofeinske kiseline i hidroksitirozola na vitalnost ćelija. Slika S2: Efekti verbaskozida na ER stres izazvan tunikamicinom. Slika S3: Efekti kofeinske kiseline i hidroksitirozola na potencijal mitohondrijalne membrane. Slika S4: Kvantitativne analize slike mitohondrija u ćelijama tretiranim kofeinskom kiselinom i hidroksitirozolom. Video S1, S2 Video zapisi: dinamika mitohondrija snimljena u bazalnim uslovima, u odsustvu (S1) ili prisustvu (S2) verbaskozida. Video S3, S4: Dinamika mitohondrija snimljena u uslovima oksidativnog stresa, u odsustvu (S3) ili prisustvu (S4) verbaskozida.
Doprinosi autora: Konceptualizacija, AG, PM i CP; kuriranje podataka, AG i PM; formalna analiza, AG i PM; pribavljanje sredstava, CP; istraga, MC; metodologija, AM i SG; resursi, FB, RR i ADG; nadzor, CP; validacija, AM, SG i MC; vizualizacija, AG i AM; pisanje—originalni nacrt, AG; pisanje—recenzija i uređivanje, PM, AM, FB, RR, ADG, MC i CP Svi autori su pročitali i pristali na objavljenu verziju rukopisa.
Finansiranje: Ovo istraživanje nije dobilo vanjsko finansiranje.
Zahvalnice: Željeli bismo zahvaliti Carlu Corinu i Mariu Dell'Agliju na reagensima i korisnoj diskusiji.
Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.
Reference
1. Cho, NH; Shaw, JE; Karuranga, S.; Huang, Y.; da Rocha Fernandes, JD; Ohlrogge, AW; Malanda, B. IDF Diabetes Atlas: Globalne procjene prevalencije dijabetesa za 2017. i projekcije za 2045. Diabetes Res. Clin. Prakt. 2018, 138, 271–281. [CrossRef]
2. Leslie, RD; Palmer, J.; Schlott, NC; Lernmark, A. Dijabetes na raskršću: Relevantnost klasifikacije bolesti za patofiziologiju i liječenje. Diabetologia 2016, 59, 13–20. [CrossRef] [PubMed]
3. Tokarz, VL; MacDonald, PE; Klip, A. Ćelijska biologija sistemske funkcije insulina. J. Cell Biol. 2018, 217, 2273–2289. [CrossRef] [PubMed]
4. Perego, C.; Da Dalt, L.; Pirillo, A.; Galli, A.; Catapano, AL; Norata, GD Metabolizam holesterola, funkcija ćelija pankreasa i dijabetes. Biochim. et Biophys. Acta (BBA) Mol. Basis Dis. 2019, 1865, 2149–2156. [CrossRef] [PubMed]
5. Galli, A.; Alžir, M.; Marciani, P.; Schulte, C.; Leonardi, C.; Milani, P.; Mafoli, E.; Tedeschi, G.; Perego, C. Oblikovanje diferencijacije i funkcioniranja ćelija pankreasa: Utjecaj mehanotransdukcije. Ćelije 2020, 9, 413. [CrossRef]
6. Ashcroft, FM; Rorsman, P. Diabetes Mellitus and the Cell: The Last Ten Years. Cell 2012, 148, 1160–1171. [CrossRef] [PubMed]
7. Rosengren, AH; Braun, M.; Mahdi, T.; Andersson, SA; Travers, ME; Shigeto, M.; Zhang, E.; Almgren, P.; Ladenvall, C.; Axelsson, AS; et al. Smanjena egzocitoza insulina u ljudskim ćelijama pankreasa sa varijantama gena povezanim sa dijabetesom tipa 2. Diabetes 2012, 61, 1726–1733. [CrossRef] [PubMed]
8. Polonsky, KS Dinamika sekrecije inzulina u gojaznosti i dijabetesu. Int. J. Obes. 2000, 24, S29–S31. [CrossRef]
9. Roden, M.; Shulman, GI Integrativna biologija dijabetesa tipa 2. Nature 2019, 576, 51–60. [CrossRef]
