Dio 2: Efluks magnezija iz ćelija Drosophila Kenyon je kritičan za normalno i dugotrajno pamćenje poboljšano ishranom
Mar 17, 2022
za više informacija:ali.ma@wecistanche.com
Kliknite zaCistanche tubulosa prah za pamćenje
Uloga za uex u tijelima gljiva
Da bismo lokalizirali uex u mozgu, prvo smo iskoristili prednosti VT23256-GAL4 transgenih muva, u kojima GAL4 pokreće sekvenca od 853 bp iz prvog introna uexa (Kvon et al., 2014). UAS-EGFP vođen VT23256- otkrio je ograničenu ekspresiju u ab KC sa posebno jakom oznakom u ab core (abc) neuronima (slika 3A). Također smo koristili CRISPR da ubacimo oznaku HA-epitopa C-terminala u otvoreni okvir za čitanje uex (Slika 3—dodatak slike 1A). Ove mušice su bile održive kao homozigoti što ukazuje da rezultirajući UEX::HA fuzioni protein zadržava funkciju. Imunobojne muhe koje nose ovaj uex:: HA lokus sa anti-HA antitijelom otkrile su istaknuto obilježavanje svih glavnih klasa KC u MB, pored niže ekspresije u cijelom mozgu (Slika 3B). Ovaj profil ekspresije uex-a je takođe podržan analizama sekvenciranja jedne ćelije (Slika 3—dodatak slike 1B; Croset et al., 2018; Davie et al., 2018). S obzirom na utvrđenu ulogu ab KC u olfaktornom LTM (Pascual i Pre´at, 2001; Yu et al., 2006; Krashes et al., 2007; Krashes i Waddell, 2008), zaključili smo da mnemonička uloga za UEX može uključivati izraz u KC.
Zatim smo koristili GAL4-usmjerenu ekspresiju RNAi da testiramo da li je 24 hmemorijapotrebne performanse uex u MB. Muhe koje eksprimiraju uexRNAi (Perkins et al., 2015) u svim ab KC (c739-GAL4; Yang et al., 1995; Perisse et al., 2013) ili samo u abc KC (NP7175- GAL4; Tanaka et al., 2008.) pokazao je normalan odmahmemorijaali značajno oslabljen 24h memorije (Slika 3C). Nasuprot tome, ekspresija uexRNAi na ab površini (abs, 0770-GAL4; Parisse et al., 2013) ili a0 b0 KCs (c305a-GAL4; Krashes et al., 2007) nije značajno promijenila neposredne ili dugotrajne performanse. Normalan apetit 24 satamemorijaperformanse su stoga posebno osjetljive na ekspresiju uex u abc neuronima. Da bismo smanjili vjerovatnoću da je defekt memorije povezan s uexRNAi posljedica razvojne posljedice, također smo ograničili ekspresiju UAS-uexRNAi na odraslu dob koristeći GAL80ts posredovanu vremensku kontrolu (McGuire et al., 2003). Na dozvoljenim 18˚C, GAL80ts se vezuje za GAL4 i potiskuje njegovu funkciju aktivatora transkripcije. Na restriktivnim 30˚C, GAL80ts se više ne može vezati za GAL4, što oslobađa GAL4 za direktnu ekspresiju UAS-uexRNAi transgena. Muve su odgajane tokom razvoja na 18˚C i premještene na 30˚C nakon eklozije. Ograničavanje ekspresije UAS-uexRNAi na ab KCs kod odraslih muva korištenjem c739-GAL4 sa GAL80ts rezultiralo je sličnom specifičnom za 24 satamemorijadefekt u odnosu na onaj uočen kada je UAS-uexRNAi eksprimiran bez vremenske kontrole (Slika 3D-F). Procijenili smo efikasnost UAS-uexRNAi nokdauna koristeći naš označeni uex::HA lokus. Mozak heterozigotnih uex::HA muva koje eksprimiraju uexRNAi u ab i g KC sa MB247-GAL4 (Zars et al., 2000) su imuno obojeni korištenjem anti-HA antitijela. Poređenje intenziteta imunooznačavanja u mozgu iz uex::HA; MB247-GAL4/uexRNAi leti s tim od uex::HA; MB247-GAL4/ plus muhe su pokazale da ekspresija uexRNAi značajno smanjuje anti-HA signal u ab i g KCs (Slika 3G i H). Ovaj rezultat pokazuje efikasnost uexRNAi transgena i korisnost CRISPR/Cas9 uređenog uex::HA lokusa.
Zatim smo testirali da li se ekspresija u specifičnim KC transgena UAS-uex može obnoviti 24 satamemorijakapacitet za uexMI01943 leti.Memorijaperformanse uexMI{{10}}1943 muhe koje izražavaju UAS-uex u ab i g KC (MB247-GAL4; Zars et al., 2000) ili samo u ab KC (c{{5 }}GAL4) je značajno poboljšan u odnosu na uexMI01943 muhe i statistički se nije razlikovao od kontrole s intaktnim uex lokusom (slika 4A). Nasuprot tome, UAS-uex ekspresija u a0 b0, abc ili abs KC nije obnovilamemorijaperformanse za uexMI01943 muhe, a prekomjerna ekspresija uex u ab KC muva divljeg tipa nije povećala 24-satnu memoriju (Slike 4A i B). Normalno 24 satamemorijaperformanse bi se također mogle vratiti na uexMI01943 muhe ako je ekspresija UAS-uex bila ograničena na c739-GAL4 neurone (svi ab KC) u odrasloj dobi korištenjem temporalne kontrole posredovane GAL80ts (Slike 4C i D). Zajedno, ovi eksperimenti RNAi gubitka funkcije i restauracije pokazuju da UEX igra važnu ulogu kod odraslih
Slika 3. Smanjenje ekspresije uex u ab Kenyon ćelijama (KC) narušava LTM. (A) Uex promotorski fragment-GAL4 usmjerava ekspresiju GFP u abc KC. Anti-GFP imuno obojen uex-GAL4 (VT23256); UAS-EGFP linija. (B) Anti-HA imunobojenje mozga koji sadrži CRISPR/Cas9-uređeni uex::HA lokus
pokazuje snažno označavanje UEX-a u svim glavnim pododjeljcima tijela gljive (MB). Skala bar 20 mm. (C) RNAi rušenje uex-a u svim ab (c739- GAL4) ili samo abc (NP7175-GAL4) KC-ima posebno oštećenim 24 satamemorija. abs ({{0}}GAL4) ili a0 b0 (c305a-GAL4) KC izraz nije imao efekta (p<0.05, figure="" 3="" continued="" on="" next-figure="" 3="">
ANOVA, n=6–10 za trenutnu i n=8–14 za 24 satamemorija). (D) Defektni LTM je primijećen ako je ekspresija uexRNAi bila ograničena na ab KC odraslih muva korištenjem temporalne kontrole posredovane GAL80ts. (E) LTM performanse nisu utjecale ako je uexRNAi održavan potisnutim tijekom cijelog vremena i (F) LTM performanse su vraćene na normalne nivoe ako je ekspresija uexRNAi ponovo potisnuta 3 dana (p<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" for="" 24="" hr="" memory).="" (g)="" immunostaining="" shows="" the="" effectiveness="" of="" uexrnai.="" fluorescence="" intensity="" in="" the="" ab="" and="" globes="" of="" uex::ha="" flies="" decreased="" significantly="" when="" uas-uexrnai="" was="" expressed="" with="" mb247-gal4.="" scale="" bars="" 20="" mm.="" (h)="" quantification="" of="" fluorescence="" intensity="" in="" g=""><0.05, t-test,="" n="6–8)." the="" online="" version="" of="" this="" article="" includes="" the="" following="" figure="" supplement(s)="" for="" figure="">
Dodatak slike 1. Šema konstrukcije za uex::HA liniju i tSNE grafikone uex izraza.
ab KCs. Pronalaženje da abc RNAi rušenje uexa proizvodi amemorijadefekt (Slika 3C), ali UAS-uex ekspresija u abc ne spašava uexMI01943 mutantni defekt (Slika 4A) sugerira da je UEX funkcija u abc KC ključna za apetitivni LTM, dok i abc i abs KC moraju imati funkcionalni UEX za podršku LTM. Osim toga, sposobnost UAS-uex-a da vrati performanse na uexMI0194 muhe pruža dodatnu podršku da je uex odgovoran zamemorijaoštećenje muva uexMI01943.
uex izraz u MB podržava Mg2 plus -poboljšanmemorija
Zatim smo istražili da li bi hranjenje Mg2 plus (4 dana sa 80 mM MgCl2) moglo poboljšatimemorijaperformanse u mušicama s kompromitovanom uex funkcijom. Muhe koje nose alel uexMI01943 (slika 4F) ili one koje eksprimiraju UAS-uexRNAi u ab KC sa c739-GAL4 (slika 4E) nisu pokazale poboljšanememorijakada su hranjene sa 80 mM MgCl2, u poređenju sa muhama hranjenim sa 1 mM MgCl2. Štaviše, memorija poboljšana Mg2 plus pronađena je u uexMI01943 mutantnim muvama kada je ekspresija uex vraćena u ab KCs (slika 4F). Sve kontrolne mušice (c739-GAL4, UAS-uexRNAi i UAS-uex) sa neometanom uex ekspresijom pokazale su značajno poboljšanumemorijakada se hrani sa 80 mM u poređenju sa 1 mM MgCl2. Prekomjerna ekspresija UAS-uex u ab KC sa c739-GAL4 kod muva s genetskom pozadinom divljeg tipa niti pojačana redovna 24 satamemorija(Slika 4B), ili kod muva hranjenih 4 dana sa 40 ili 80 mM MgCl2 (Slika 4G). Također smo testirali da li su 4 dana suplementacije od 80 mM MgCl2 poboljšala performanse pamćenja od 24 sata nakon treninga s averzivnim razmakom. Opet, thememorijadivljeg tipa, ali ne uexMI01943 mutantnih muva, pokazalo je poboljšanje (Slika 4—dodatak slike 1). Zajedno ovi rezultati ukazuju da je optimalnomemorijapoboljšanje sa Mg2 plus hranjenjem zahteva, i može biti u potpunosti podržano, UEX funkcijom u ab KC-ovima.
UEX je funkcionalno očuvan transporter magnezijuma
S obzirom na snažnu konzervaciju sekvence UEX-a sa CNNM2/4 sisara, testirali smo da li CNNM2 može funkcionalno zamijeniti UEX i vratiti LTM defekt muva uexMI01943. Nekoliko točkastih mutacija u CNNM2 identificirano je kod ljudi s hipomagnezemijom, koja je povezana s malformacijom mozga i intelektualnim invaliditetom (Arjona et al., 2014). Uvođenje ekvivalentnih mutacija u CNNM2 miša (CNNM2E357K, CNNM2T568I, CNNM2S269W i CNNM2E122K) pokazalo je da ove lezije uzrokovane pacijentima ometaju transport magnezija (Arjona et al., 2014). Konstruisali smo mušice koje nose divlji tip i ovu mutantnu varijantu UAS-CNNM2 transgene (slika 5A). Bojenje za pridruženu C-terminalnu HA-oznaku otkrilo je jasnu ekspresiju svih UAS-CNNM2::HA varijanti u ab neuronima kada se pokreće sa c739-GAL4 (Slika 5—slika dodatak 1). Međutim, samo ekspresija divljeg tipa CNNM2, a ne i tačkasto-mutantnih oblika, u ab KC-ovima uexMI01943
mute mutacije obnovljene 24 hmemorijaperformanse (Slika 5B).
Također smo testirali da li UEX može posredovati u ekstruziji Mg2 plus. UEX eksprimiran u ćelijama HEK293 lokaliziranim na plazma membrani i ćelijama napunjenim Mg2 plus i Mg2 plus indikatorom Magnezijsko zeleno pokazalo je brz efluks Mg2 plus (slika 5—slika dodatak 2 i video 1), u poređenju sa stanicama transficiranim praznim vektorom. Ekstruzija Mg2 plus koju pokreće UEX bila je primjetno manje efikasna nego u ćelijama koje eksprimiraju ljudski CNNM4 (Slika 5—slika dodatak 2), za koji se zna da ima sličnu efikasnost kao CNNM2 (Hirata et al., 2014). Međutim, ne znamo da li su UEX i CNNM4 izraz ekvivalentni. Ipak, demonstracija komplementarnosti među vrstama i aktivnosti efluksa Mg2 plus definira UEX kao funkcionalni homolog CNNM2/4 sisara.
Slika 4. Spašavanje LTM defekta u uexMI01943 mušicama. Obnavljanje ekspresije UAS-uex u ab i g (MB247-GAL4) ili ab Kenyon ćelije (KCs) spašeno 24 satamemorijaperformanse uexMI01943 leti, dok izraz u abc, abs ili a0 b0 KCs nije (p<0.05, anova="" and="" t-test,="" n="8–12)." (b)="" overexpression="" of="" uas-uex="" in="" ab="" kcs="" did="" not="" enhance="" 24="" hr="">memorijaperformanse kod muva divljeg tipa (ANOVA, n=8–12). (C) Neispravan LTM je spašen ako je ekspresija UAS-uex bila ograničena na ab KC odraslih muha korištenjem vremenske kontrole posredovane GAL80ts (p<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" figure="" 4="" continued="" on="">
za 24 hmemorija), ali (D) je ostao neispravan ako UAS-uex izraz nije bio pušten. (E)Memorijapoboljšanje sa dijetalnim Mg2 plus je podržano od strane UEX u ab KC. Memorija muva koje eksprimiraju UAS-uexRNAi u ab KC ne može se poboljšati hranjenjem Mg2 plus (t-test, n=8). (F) Memorija uexMI01943 mutiranih muva ne može se poboljšati hranjenjem Mg2 plus, ali je poboljšanje obnovljeno ekspresijom UAS-uex u ab KCs (p<0.05, t-test,="" n="8–12)." (g)="" the="" memory="" of="" wild-type="" flies="" was="" not="" sensitized="" to="" mg2+="" enhancement="" by="" overexpressing="" uas-uex="" in="" ab="" kcs.="">Memorijaje poboljšana ako su muhe hranjene sa 80 mM MgCl2, ali ne i sa suboptimalnim 40 mM MgCl2 (p<0.05, anova,="" n="">
Internetska verzija ovog članka uključuje sljedeće dodatke za sliku 4:
Dodatak za sliku 1. Mg2 plus hranjenje poboljšano LTM nakon averzivnog razmaknutog treninga kod muva divljeg tipa, ali ne i uexMI01943.
Netaknut CNBH domen je potreban zamemorija
S obzirom na uspostavljenu ulogu cAMP signalizacije umemorija-relevantna plastičnost kod beskičmenjaka i sisara (Kandel, 2012), testirali smo važnost CNBH domene na UEX-u. Konstruisali smo muhe koje nose tačkasto mutirani CNBH UAS-uexR622K transgen (Slika 6A). Ekvivalentna R622K aminokiselinska supstitucija ukida cAMP vezivanje u regulatornoj podjedinici cAMP zavisne protein kinaze, PKA (Bubis et al., 1988). Ekspresija UAS-uexR622K u ab neuronima sa c739-GAL4 nije vratila performanse memorije od 24 sata, niti promijenila trenutnememorijaperformanse uexMI01943 mutantnih muha (Slika 6B).
Također smo koristili CRISPR da pokušamo uvesti mutaciju R622K u CNBH nativnog uex lokusa (Bassett et al., 2013; Gratz et al., 2013; Yu et al., 2013). Neočekivano, ovaj pristup nije uveo zamjenu R622K, već je umjesto toga zamijenio T626 u CNBH sa NRR. Srećom, muhe homozigotne za ovaj alel uexT626NRR bile su održive kao odrasle osobe, za razliku od onih homozigotnih za uexD, što sugerira da uexT626NRR kodiran UEX zadržava funkciju. Međutim, muhe homozigotne za uexT626NRR ili heterozigotne uexT626NRR/uexMI01943 muhe pokazale su jaku 24 satamemorijakvar (Slika 6C). Odmahmemorijaje također oštećen kod homozigotnih uexT626NRR muva, za razliku od muva koje nose sve druge kombinacije uex alela. Osim toga, thememorijauexT626NRR muha nije moglo biti poboljšano hranjenjem Mg2 plus (Slika 6D). Mutacija uexT626NRR, dakle, razdvaja suštinsko
Slika 5. uex kodira evolucijski konzervirani Mg2 plus transporter. (A) Model strukture proteina CNNM2 koji pokazuje klinički relevantne tačkaste mutacije.
Prilagođeno i modificirano iz Arjona et al., 2014. (B) Prekomjerna ekspresija divljeg tipa, ali ne mutantnog, CNNM2 u ab Kenyon stanicama spašavamemorijadefekt mutanata uexMI01943 (str<0.05, anova,="" n="6–8" for="" immediate="" and="" n="8–12" for="" 24="" hr="">
Internetska verzija ovog članka uključuje sljedeće dodatke za sliku 5:
Dodatak slike 1. Transgenska ekspresija mutantnih varijanti CNNM2.
Dodatak slike 2. UEX zavisan Mg2 plus efluks u HEK293 ćelijama.
uloga za uex iz funkcije umemorijai sugerira da je aktivnost regulirana cikličkim nukleotidom kritična za UEX da podrži normalan i Mg2 plus - poboljšanmemorija. Iako smo pomoću western blotinga potvrdili da je protein pune dužine eksprimiran u uexT622NRR mušicama (slika 6E), naše antitijelo nam nije omogućilo da potvrdimo da se protein UEXT626NRR na odgovarajući način lokalizira u mozgu. Stoga je potreban dalji rad na karakterizaciji stanične lokalizacije, vezivanja cAMP i transportne funkcije Mg2 plus proteina kodiranog ovim slučajnim uexT626NRR alelom.
Hronična cAMP manipulacija mijenja lokalizaciju UEX-a u KC-ovima
Testirali smo da li cAMP može akutno promijeniti UEX aktivnost primjenom forskolina na ćelije HEK293 koje eksprimiraju UEX. Međutim, nije uočena očigledna promjena u dinamici efluksa Mg2 plus ovisno o UEX-u (podaci nisu prikazani). Stoga smo testirali da li je KC ekspresija UEX::HA promijenjena kod muva s kroničnim promjenama
cAMP metabolizam, uvođenjem mutacija koje su relevantne za učenje u Ca2 plus stimulisanoj adenilat ciklazi, ili cAMP-specifičnoj fosfodiesterazi kodiranoj od rutabage. Anti-HA imunobojenje mozga iz rut2080; uex::HA i dnc1; uex::HA muhe su otkrile upečatljivu promjenu u UEX lokalizaciji (Slike 7A i B i video snimci 2–4). Dok se UEX::HA obično detektuje u režnjevima svih KC na otprilike ekvivalentnom nivou kod muva divljeg tipa, označavanje je bilo niže u MB g režnju i izraženije u abc KC u mutantnoj pozadini rut2080 i dnc1 (slika 7C) , iako je ukupna MB ekspresija UEX::HA slična između divljih i mutantnih muva (slika 7D). Pored toga, Western blot analize proteina ekstrahovanih iz glava ovih muva nisu otkrile značajnu razliku u ukupnim nivoima ekspresije UEX::HA (podaci nisu prikazani). Ovi podaci su stoga u skladu s cAMP-om koji reguliše UEX funkciju i možda njegovu ćelijsku lokalizaciju u KC.
UEX je potreban za održavanje fluktuirajućeg [Mg2 plus ]i u ab KCs
Iako MagFRET može prijaviti [Mg2 plus ], on ne reagira dovoljno brzo da snimi signale izazvane stimulacijom. Stoga smo konstruirali mušice koje sadrže UAS-transgene za dva novija genetski kodirana Mg2 plus senzora, MagIC (ne-FRET baziran; Koldenkova et al., 2015.) i MARIO (baziran na FRET; Maeshima et al., 2018.). Nismo bili u mogućnosti da otkrijemo ekspresiju UAS-MARIO u mozgu muva i stoga smo mogli koristiti samo UAS-MagIC. Prijavljeno je da MagIC najsnažnije reaguje na Mg2 plus, ali iu manjoj meri na Ca2 plus (Koldenkova et al., 2015). Stoga smo prvo potvrdili specifičnost MagIC odgovora u ćelijskom permeabiliziranom ex vivo preparatu mozga muva. Mozak je uklonjen muhama koje eksprimiraju UAS-MagIC u ab KC sa c739-GAL4 (Slika 8A), inkubirani u posudi sa fiziološkim rastvorom (Barnstedt et al., 2016.) i praćene su promjene fluorescencije prije i nakon primjene u kupatilu - cija hemikalija. Dok je primjena MgCl2 izazvala povećanje MagIC odgovora ovisno o dozi, kelacija Mg2 plus sa EDTA je dovela do smanjenja ovisnog o dozi (slika 8B i video snimci 5 i 6). Za poređenje, CaCl2 je samo registrovao blagi porast pri najvišim koncentracijama, dok je više Ca2 plus -selektivni kelator EGTA imao mali efekat (slika 8B). Ovi rezultati pokazuju da UAS-MagIC može pratiti [Mg2 plus ]i u ab KC u mozgu muhe.
Pokazalo se da povećanje intracelularnog cAMP-a izaziva Mg2 plus fluks iz ćelija sisara (Romani i Scarpa, 2000; Vormann i Gu¨nther, 1987; Jakob et al., 1989; Romani i Scarpa, 1990b; Romani i Scarpa, 199 i Scarpa, 199 Gunther, 1987; Gunther et al., 1990; Howarth et al., 1994). Budući da su naši eksperimenti također pokazali da cAMP može regulirati UEX, zatim smo testirali da li stimulacija cAMP sinteze forskolinom (FSK) može promijeniti MagIC signale u ab
Slika 6. Domen ciklične nukleotidne-vezujuće homologije (CNBH) UEX je potreban za memoriju. (A) Šematski prikaz detalja sekvence CNBH domene u UEX, i promjene aminokiselina napravljene u uexR622K i uexT626NRR. (B) Ekspresija UAS-uexR622K transgena u ab Kenyon ćelijama nije spasila LTM defekt mutanata uexMI01943 (p<0.05, anova,="" n="8)." immediate="" memory="" was="" also="" unaffected.="" (c)="" flies="" homozygous="" for="" uext626nrr="" have="" defective="" short-="" and="" long-term="" memory,="" while="" trans-heterozygous="" uext626nrr/uexmi01943="" flies="" only="" exhibit="" impaired="" ltm=""><0.05, anova,="" n="8)." figure="" 6="" continued="" on="" next="">
Slika 6 se nastavlja
(D) Dijetetski Mg2 plus nije poboljšao pamćenje homozigotnih uexT626NRR/uexT626NRR muva (p<0.05, t-test,="" n="8)." (e)="" western="" blot="" analysis="" of="" uex="" protein="" expression="" in="" fly="" head="" extracts.="" genotype="" from="" left="" to="" right:="" wild-type,="" uext626nrr/uext626nrr,="" uext626nrr/+,="" uext626nrr/uexmi01943,="" uexmi01943/+.="" the="" blot="" was="" first="" probed="" with="" anti-uex="" antibody="" (upper="" panel),="" and="" then="" stripped="" and="" re-probed="" with="" anti-tubulin="" antibody="" (lower="" panel)="" as="" a="" loading="">
KCs. Za ove eksperimente ponovo smo koristili ex vivo preparat za mozak, ali ovoga puta ćelije nisu bile permeabilizovane. Pokazalo se da 30 mM FSK izaziva vršno povećanje cAMP u KC koje je približno onom uočeno nakon kondicioniranja apetita (Louis et al., 2018). Primjena 30 mM FSK na c739-GAL4; UAS-MagIC mozgovi su izazvali dosljednu dinamiku MagIC fluorescencije. Nakon naglog početnog porasta, odgovori su polako opadali natrag prema osnovnoj liniji prije nego što su ponovo polako rasli do tačke u kojoj je signal počeo da fluktuira. (Slika 8C i D i Video 7). Ključni potpisi ovog odgovora zabilježeni su samo u Mg2 plus -osjetljivom Venerinom signalu (slika 8D). Nasuprot tome, mCherry fluorescencija nije fluktuirala, već se stalno smanjivala tokom snimanja (vjerovatno je rezultat foto-izbjeljivanja), pokazujući da fluktuacija u signalu Venere nije artefakt kretanja (Slika 8E). Važno je da su FSK inducirani MagIC odgovori bili veći od onih nakon primjene fiziološke otopine (Slika 8—slika dodatak 1A). Međutim, fluktuirajući odgovor se također razvio nakon primjene fiziološkog rastvora (Slika 8—slika dodatak 1B) što sugerira da ritmički MagIC signal može biti opći odgovor na povećanje [Mg2 plus ]i koje slijedi nakon ćelijske perturbacije.
Ranije je prijavljeno da Drosophila MB pokazuje spore (0.004 Hz) Ca2 plus oscilacije u ex vivo mozgovima, dok mnogo brže oscilacije od 20 Hz izazivaju mirisi u MB skakavca (Laurent i Naraghi, 1994; Rosay et al., 2001). Iako je naša početna karakterizacija MagIC-a u mozgu muva ukazala na preferencijalni odgovor na Mg2 plus (slika 8B), mi smo ipak eksplicitno testirali da li FSK inducira fluktuaciju [Ca2 plus ]i ab KC-a, koristeći ekspresiju UAS-GCaMP6f (Chen et. al., 2013). FSK je izazvao odloženo povećanje GCaMP odgovora, ali nije uočena jasna oscilatorna aktivnost (Slika 8—dodatak slike 1C–E).
Na kraju, testirali smo da li su uočeni MagIC odgovori osjetljivi na status uex gena. Generirali smo uexMI01943 muhe koje su također sadržavale c379-GAL4 i UAS-MagIC i uporedili njihove MagIC odgovore izazvane FSK-om i fiziološkom otopinom sa onima muva sa divljim tipom uex lokusa. UexMI01943 mutantne mušice pokazale su povećani FSK odgovor u odnosu na muhe divljeg tipa, dok se odgovori izazvani slanom otopinom nisu mogli razlikovati (Slika 8F i G). Odgovori izazvani neaktivnim FSK analogom, ddFSK, također su bili neosjetljivi na status uex (Slika 8—dodatak slike 1F). Mutacija uexa stoga selektivno povećava srednje FSK izazvane MagIC odgovore.
Također smo primijetili da MagIC tragovi uex mutantnih muva ne pokazuju fluktuirajući signal (slika 8H i slika 8—dodatak slike 1G). Da bismo kvantifikovali ovu razliku, izračunali smo srednju spektralnu gustinu snage (PSD) tragova iz uexMI01943 i divljeg tipa muva tretiranih FSK ili fiziološkim rastvorom. U oba stanja srednji PSD je značajno pomaknut ulijevo prema nižim frekvencijama kod uexMI01943 mutanata u poređenju sa kontrolama divljeg tipa (Slika 8I). Mozak muva divljeg tipa imao je značajno veću oscilatornu aktivnost usredsređenu na 0,015 Hz od mozga uexMI01943 mutanata. Ovi podaci stoga sugeriraju da je UEX potreban za sporo ritmičko održavanje KC [Mg2 plus ]i. Važno je da otkriće da su MagIC signali povišeni i izmijenjeni kod uex mutanata potvrđuje da su opaženi MagIC odgovori zavisni od Mg2 plus. Štaviše, oni sugerišu da je KC izrazio UEX granice Mg2 plus akumulacije, u skladu sa ulogom u ekstruziji.
Diskusija
Primetili smo poboljšanje olfaktorne LTM performanse kada su muhe hranjene 4 dana pre treninga hranom sa dodatkom 80 mM [Mg2 plus]. Ovaj rezultat podsjeća na onaj zabilježen kod pacova, iako su bili potrebni duži periodi hranjenja da bi se mozak [Mg2 plus ] podigao na nivoe koji poboljšavaju pamćenje (Slutsky et al., 2010). Razlika u optimalnom vremenu hranjenja može odražavati veličinu životinje i možda veću bioraspoloživost dijetetskog Mg2 plus u Drosophila. Dok je Mg2 plus -L-treonat (MgT) bio efikasnije sredstvo za isporuku Mg2 plus od magnezijum hlorida kod pacova (Slutsky et al., 2010), primetili smo slično poboljšanje performansi pamćenja kada su muhe hranjene magnezijum hloridom , magnezijum sulfat ili MgT (podaci nisu prikazani).
Slika 7. Ekspresija uex ćelije Kenyon (KC) je promijenjena u muvama rutabaga i dunce mutanta. (A) Anti-HA obojeni mozgovi otkrivaju da je lokalizacija UEX::HA proteina promijenjena u rut2080; uex::HA i dnc1; uex::HA leti, postajući sve istaknutiji u abc KC (strelice). Skala bar 20 mm. (B) Uvećane slike tijela gljiva (MBs) koje ističu ekspresiju abc KC u mušicama rut2080 i dnc1, u poređenju sa mušicama divljeg tipa uex::HA. Skala bar 20 mm. (C) Kvantifikacija intenziteta fluorescencije. Lijevo, mikrosnimka s mjernom linijom kroz vrh režnja i pravokutnim ROI za g režanj i kontrolno područje. Srednji, relativni profili intenziteta fluorescencije preko vrha režnja pokazuju značajno veći signal u mutacijama rut2080 i dnc1 u središnjoj regiji koju zauzimaju ab core KCs (*p<0.05, anova,="" n="6–10)." right,="" the="" relative="" intensity="" in="" the="" g="" lobe="" was="" significantly="" lower="" in="" rut2080="" and="" dnc1="" mutant="" flies,="" as="" compared="" to="" wild-type="" controls=""><0.05, anova,="" n="6–10)." scale="" bars="" 10="" mm.="" (d)="" left,="" micrograph="" showing="" circular="" rois.="" right,="" figure="" 7="" continued="" on="" quantification.="" total="" intensity="" over="" all="" six="" rois="" on="" the="" mbs="" was="" not="" significantly="" different="" between="" the="" rut2080,="" dnc1,="" and="" wild-type="" brains="" (p="">0.13; ANOVA, n=6–10).
Povišenje [Mg2 plus ]e u mozgu štakora dovodi do kompenzatorne regulacije ekspresije NR2B podjedinice NMDAR-a i stoga povećanja udjela postsinaptičkih NMDAR-a koji sadrže NR2B. Ova klasa NMDAR-a ima duže vrijeme otvaranja (Chen et al., 1999.; Erreger et al., 2005.) što sugerira da ova promjena u sastavu podjedinica predstavlja mehanizam homeostatske plastičnosti (Turrigiano, 2008.) kako bi se prilagodio povećanom bloku NMDAR koji nameće povećanje [Mg2 plus ]e. Štaviše, prekomjerna ekspresija NR2B u prednjem mozgu miša može poboljšati sinaptičku facilitaciju i učenje imemorijaperformanse (Tang et al., 1999), podržavajući povećanje NR2B kao važan faktor u povećanju Mg2 plusmemorija. Međutim, čak iu originalnoj in vitro studiji sinaptičke plastičnosti pojačane Mg2 plus (Slutsky et al., 2004), uočeno je da NMDAR struje nisu dovoljne da u potpunosti objasne uočene promjene.
Naše studije gubitka funkcije NMDAR podjedinice u Drosophila KC nisu narušile regularne ili Mg2 plus -pojačanememorija. Nadalje, nismo otkrili očiglednu promjenu u nivoima ekspresije glutamatnih receptora podjedinica u cijelom mozgu kod muva hranjenih Mg2 plus. Iako je aktivnost NMDAR-a ranije bila uključena u miris Drosophilamemorija, efekti su se uglavnom pripisivali funkcionisanju izvan MB (Xia et al., 2005; Wu et al., 2007). Osim toga, prekomjerna ekspresija Nmdar1 u svim neuronima, ili posebno u svim KC, nije promijenila STM ili LTM. Ektopična prekomjerna ekspresija u MB verzije NMDARN631Q, koju Mg2 plus ne može blokirati, oslabila je LTM (Miyashita et al., 2012). Međutim, ova mutacija dopušta ulazak Ca2 plus ograničenog ligandom, bez potrebe za koreliranom neuronskom depolarizacijom, koja može poremetiti KC funkciju na neočekivane načine. Možda je najznačajnije da sinaptičku depresiju relevantnu za učenje u MB mogu pokrenuti dopaminergički nastavni signali koji se isporučuju u holinergičke izlazne sinapse od KC-a koji reaguju na miris do specifičnih MBON-ova (Claridge- Chang et al., 2009; Aso et al., 2012. ; Burke et al., 2012; Liu et al., 2012; Owald et al., 2015; Hige et al., 2015; Barnstedt et al., 2016; Parisse et al., 2016; Aso et al., 2014; Owald i Waddell, 2015; Handler et al., 2019). Moguće je da KC primaju glutamat, iz izvora koji tek treba da bude identifikovan, ali trenutno nema očiglednog mesta u MB mreži za plastičnost zavisnu od NMDAR. Dokazi stoga sugeriraju da je normalna i Mg2 plus -pojačana Drosophila LTM nezavisna od NMDAR signalizacije u KC. Osim toga, naša MagFRET mjerenja pokazuju da Mg2 plus hranjenje također povećava [Mg2 plus ]i ab KC za pribl.
50 mM.
Identificirali smo ulogu za uex, ortolog jedne muhe iz evolucijski očuvane porodice Mg2 tipa CNNM plus efluks transportera (Ishii et al., 2016). Postoje četiri različita CNNM gena kod miševa i ljudi, pet u C. elegans i dva u zebrice (Ishii et al., 2016; Arjona et al., 2013). Uex lokus proizvodi četiri alternativno spojena mRNA transkripta, ali svi kodiraju isti 834 aa protein. Precizna uloga CNNM proteina u transportu Mg2 plus je donekle sporna (Funato et al., 2018a; Arjona i de Baaij, 2018; Funato et al., 2018b; Gime´nez-Mascarell et al., 2019). Neki predlažu da su CNNM proteini direktni Mg2 plus transporteri, dok drugi smatraju da oni funkcionišu kao senzori intracelularne koncentracije Mg2 plus [Mg2 plus ]i i/ili regulatori drugih Mg2 plus transportera. Otkrili smo da ektopična ekspresija Drosophila UEX pojačava efluks Mg2 plus u ćelijama HEK293 i da endogeni UEX ograničava [Mg2 plus ]i u ab KCs u mozgu muhe. Stoga, ako UEX nije sam po sebi Mg2 plus transporter, mora biti
sposoban da efikasno interaguje sa ljudskim transporterima Mg2 plus efluksa i da utiče na ekstruziju Mg2 plus u Drosophila. Pošto je UEX jedini CNNM protein u letu, on može služiti svim ulogama četiri pojedinačna CNNM-a sisara. Međutim, sposobnost miša CNNM2 da se vratimemorijasposobnost uex mutantnih muva sugerira damemorija-relevantna UEX funkcija može biti zamijenjena onom CNNM2.
Zanimljivo je da nijedna od varijanti CNNM2 relevantnih za bolest nije bila u stanju da dopunimemorijadefekt uex mutantnih muva. CNNM2 T568I varijanta zamjenjuje jednu aminokiselinu u drugom CBS domenu (Arjona et al., 2014). Onkogene protein-tirozin fosfataze iz porodice PRL (fosfataza regenerirajuće jetre) vezuju se za CBS domene CNNM2 i CNNM3 i mogu inhibirati njihovu transportnu funkciju Mg2 plus (Hardy et al., 2015; Gime´nez-Mascarell et al., 20, 20). ; Zhang et al., 2017.). Stoga će biti od interesa testirati ulogu UEX CBS domena i da li fly PRL-1 reguliše UEX aktivnost.
RNA-seq analiza otkriva da je uex snažno izražen u probavnom traktu i nervnom sistemu larve i odrasle muhe, kao i u jajnicima (Gelbart i Emmert, 2010; Croset et al., 2018; Davie et al., 2018) što sugeriše da mnoge uex mutacije će biti pleiotropne. Naš uexD alel, koji briše 272 aminokiseline (uključujući dio drugog CBS-a i cijeli CNBH domen) sa UEX C-terminusa, rezultira razvojnom letalnošću kada je homozigotan, pokazujući da je uex esencijalni gen. CNNM4 sisavaca je lokaliziran na bazolateralnoj membrani intestinalnih epitelnih stanica (Yamazaki et al., 2013). Tamo se vjeruje da funkcionira u transćelijskom transportu Mg2 plus razmjenom intracelularnog Mg2 plus za ekstracelularni Na plus nakon apikalnog ulaska kroz TRPM7 kanale. Smrtonosnost kod drozofile stoga može nastati zbog nemogućnosti apsorpcije dovoljnog Mg2 plus kroz crijeva larve. Međutim, neuronski ograničena ekspresija uexRNAi sa elav-GAL4 također rezultira smrtnošću larvi (podaci nisu prikazani), što sugerira da UEX ima dodatnu ulogu u ranom razvoju nervnog sistema, kao što je CNNM2 kod ljudi i zebrica (Arjona et al., 2014; Accogli et al., 2019.). Možda iznenađujuće, muhe koje nose homozigotne ili trans-heterozigotne kombinacije nekoliko hipomorfnih uex alela imaju defektan apetit i averzivnost.memorijaperformanse, a ipak se čini da inače nisu pogođeni.
Genetski inženjering uex lokusa za dodavanje C-terminalne HA oznake na UEX protein omogućio nam je da lokaliziramo njegovu ekspresiju u mozgu. Označavanje je posebno istaknuto u svim glavnim klasama KC-a. Ograničavanje nokdauna uex ekspresije na sve ab KC odraslih muva, ili čak samo na podskup abc, reproducira LTM defekt. Poremećaj LTM je bio evidentan ako je uexRNAi ekspresija u ab neuronima
Slika 8. UEX ograničava porast [Mg2 plus ]i i podržava spore oscilacije u ab Kenyon ćelijama (KC). (A) Mozak muve eksplantata koji izražava UAS-MagIC pokretan c739-GAL4. Gornji panel, pogled na fazni kontrast širokog polja; srednji paneli, fluorescentni pogledi na kanale Venere i mCherry; donji panel, konfokalni dio na nivou KC somata koji prikazuje kanale Venere i mCherry. Skala bar 20 mm. (B) MagIC selektivno reaguje na promene u [Mg2 plus ]i u KC. Tragovi omjera MagIC nakon primjene u kupatilu 10, 20 ili 40 mM MgCl2 ili CaCl2; 5, 10 ili 20 mM EDTA ili EGTA. (C) Reprezentativni trag slike 8 se nastavlja na sljedećem - Slika 8 se nastavlja
MagIC omjer nakon primjene FSK pokazuje početni val praćen postepenim porastom i razvojem spore oscilacije. (D) Primarni odgovori su rezultat promjena u Mg2 plus -osjetljivom Venerinom signalu. (E) mCherry signal pokazuje stalan pad. (F) MagIC odgovori izazvani FSK su veći kod uex mutantnih muva. Prosječni MagIC odgovori pokazuju da je FSK izazvao značajno veći porast mutanta uexMI01943 nego kod muva divljeg tipa. (G). Prosječni MagIC odgovori izazvani slanom otopinom nisu bili značajno izmijenjeni kod uex mutantnih muva. (H) Individualni tragovi kanala Venere (zeleno) i mCherry (crveni) pokazuju da je spora oscilacija evidentna samo u kanalu Venere muva divljeg tipa, ali ne i uex mutanta. (I) Analiza spektralne gustoće snage (PSD) vremenske serije od 200 do 900 s svih podataka pokazuje da tragovi muva divljeg tipa imaju značajno veću oscilatornu aktivnost, sa centrom oko 0,015 Hz, od onih od uex mutantnih muva.
Internetska verzija ovog članka uključuje sljedeće dodatke za sliku 8:
Dodatak slike 1. Pojedinačni tragovi za MagIC i GCaMP snimanje.
