Dio 2:Epigenetska regulacija cirkadijalnog gena Per1 doprinosi promjenama u hipokampalnom pamćenju vezanim za starenje

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Kliknite ovdje do 1. dijela

Obaranje Per1 dugoročno narušavamemorijakod mladih miševa.Zatim, da se testira da li je povećanje regulacije Per1 u dorzalnom hipokampusu potrebno dugoročnomemorijaformiranje, mi smo infuzirali siRNA ciljanu na Per1 u dorzalni hipokampus mladih miševa 48 h prije 10-min OLM treninga. Infuzija Per1 siRNA je dovela do značajnog smanjenja PER1 proteina u dorzalnom hipokampusu, mjereno 2 h nakon završne testne sesije (Slika 4d, Dodatna slika 5). Ovo relativno skromno smanjenje PER1 proteina (~30 posto) dovelo je do ozbiljnog oštećenjamemorijaformiranje za OLM; miševi kojima je infuzirana Per1 siRNA nisu pokazali značajno povećanje DI između treninga i testiranja i pokazali su značajno manju sklonost prema pokretnom objektu tokom testiranja nego kontrolni miševi (slika 4e) bez utjecaja na ukupno istraživanje objekta na testu (slika 4f) i nema razlike u kretanju tokom sesija navikavanja prije treninga (dopunska slika 8c). Ovo pokazuje, po prvi put, da lokalni poremećaj gena jezgra cirkadijalnog sata selektivno unutar hipokampusa može narušitimemorijaformiranje.

Per1 prekomjerna ekspresija se poboljšavamemorijakod ostarjelih miševa. konačno,kako bi se utvrdilo da li je prekomjerna ekspresija Per1 u dorzalnom hipokampusu dovoljna za poboljšanje starostimemorijaoštećenja, lokalno smo povećali Per1 koristeći dvije komplementarne metode. Prvo smo koristili lentivirus koji eksprimira divlji tip Per1 s oznakom epitopa v5 (pLVX-v5Per1) (slika 5a, dodatna slika 6a). Da bismo potvrdili da ovaj plazmid prekomjerno eksprimira Per1, transficirali smo HT22 ćelije sa pLVX-v5Per1 ili pLVX-EV i izmjerili ekspresiju Per1 mRNA. I 24 i 48 h nakon transfekcije, Per1 mRNA je značajno povećana u ćelijama transficiranim sa pLVX-v5Per1 u odnosu na ćelije transficirane kontrolnim plazmidom (slika 5b). Transfekcija pLVX-v5Per1 je također dovela do značajnog povećanja mRNA za Per2 (član porodice Period clocka koji je u interakciji sa Per1) nakon 24 h (dopunska slika 6b), iako je ovo povećanje bilo daleko manje od uočenog povećanja Per1 (na 24 h, Per1: 466- puta povećanje u odnosu na EV, Per2: 1.6- puta povećanje u odnosu na EV). Međutim, prekomjerna ekspresija Per1 nije utjecala na transkripciju najbližeg nizvodnog gena Hes7 (dopunska slika 6c).

Da biste utvrdili da li se per1 prekomjerna ekspresija poboljšavamemorijaperformanse kod ostarjelih miševa, pLVX-v5Per1 je infundiran u dorzalni hipokampus 18-mo miševa 2 sedmice prije ponašanja. pLVX-v5Per1 miševi su pokazali značajno poboljšanjememorijaza OLM na testu u odnosu na kontrole pLVX-EV (prazan vektor) (slika 5c). Samo pLVX-v5Per1 miševi su pokazali značajno povećanje sklonosti prema pokretnom objektu u mirovanju u odnosu na trening bez uočenih grupnih razlika u ukupnom istraživanju na testu (slika 5d) ili u kretanju tokom navikavanja (dopunska slika 8d).

Nakon ponašanja, tkivo hipokampusa iz podskupine životinja obrađeno je za sekvenciranje RNK da bi se potvrdilo prisustvo transkripata pLVX-EV i pLVX-v5Per1 u odgovarajućim grupama in vivo (dodatna slika 7a, b, f, g).

Da bismo upotpunili ovaj pristup, također smo koristili CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) sistem33 da pokrenemo transkripcijsku aktivaciju Per1 u dorzalnom hipokampusu. Ovaj sistem se sastoji od tri lentivirusne komponente: katalitičkeneaktivni Cas9 (dCas9) fuzionisan sa domenom aktivacije transkripcije VP64 sa GFP oznakom (dCas9-VP64-GFP), modifikovanom RNK sa jednim vodičem (sgRNA) koja cilja na Per1 sa dva MS2 RNA aptamera koji mogu regrutirajte treću komponentu, MS2- dvostruki transkripcijski aktivator (MS2-p65-HSF1) fuzijski protein(Sl. 5e). Kontrolne životinje su primile kontrolnu sgRNA kojoj nedostaje sekvenca od 20 nukleotida koja je potrebna za ciljanje SAM sistema na Per1 (koji se naziva ctrl sgRNA). Sastavljanje ovih komponenti na Per1 promotoru omogućava tri domena efektora (VP64, p65 i HSF1) da upravljaju transkripcijom Per1. Da potvrdimo, efikasnost slike 5. Prekomjerna ekspresija Per1 u dorzalnom hipokampusu ublažava oštećenja povezana sa starenjem na lokaciji objektamemorija. Šema lentivirusne konstrukcije koja se koristi za prekomjernu ekspresiju v{{0}}označenog Per1 (pLVX-v5Per1) u poređenju sa kontrolom praznog vektora (pLVX-EV). b Per1 mRNA je značajno povećana 24 i 48 h nakon transfekcije pLVX-v5Per1 u HT22 ćelijama u poređenju sa ćelijama transficiranim sa EV (dvosmjerna ANOVA: Grupa x interakcija vremenske tačke (F(1,8)=52.8, p < {{20}}.0{{40}}1),="" sidakovi="" post="" hoc="" testovi,="" ***p="">< 0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-mo="" miševa="" koji="" su="" dobili="" hipokampalne="" infuzije="" plvx-v5per1="" pokazali="" su="" značajno="" bolju="" memoriju="" za="" olm="" nego="" miševi="" kojima="" je="" dat="" kontrolni="" virus="" plvx-ev="" (dvosmjerna="" anova:="" interakcija="" virus="" x="" sesija,="" (f(1,29)="" {{34)="" }}.15,="" p="">< 0,05),="" sidakovi="" post="" hoc="" testovi,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" n="16," 15,="" svi="" muškarci).="" d="" ukupno="" istraživanje="" je="" bilo="" slično="" za="" obje="" grupe="" na="" testu="" (t(29)="0.57," p="0.57)." e="" šema="" crispr/dcas9="" synergistic="" activation="" mediator="" (sam)="" sistema="" koji="" se="" koristi="" za="" pokretanje="" transkripcije="" per1.="" vrh:="" pojedinačne="" komponente="" sam-a.="" dole:="" komponente="" sastavljene="" na="" per1="" promotoru,="" pokrećući="" per1="" transkripciju.="" f="" per1="" mrna="" je="" značajno="" povećana="" 48="" h="" nakon="" transfekcije="" crispr-sam="" komponenti="" u="" ht22="" ćelijama="" u="" poređenju="" sa="" ćelijama="" transficiranim="" kontrolnom="" sgrna="" (dvosmjerna="" anova:="" grupa="" x="" interakcija="" vremenske="" tačke="" (f(1,8)="14.77" ,="" p="">< 0,01),="" sidakovi="" post="" hoc="" testovi,="" **p="">< 0,001,="" n="3,3,3,3)." g="" 18-mo="" miševa="" kojima="" su="" date="" hipokampalne="" infuzije="" crispr-sam="" sistema="" sa="" sgrna="" ciljanjem="" per1="" pokazale="" su="" se="" značajno="">memorijaza OLM u poređenju sa EV kontrolnim miševima sa kontrolnom sgRNA (dvosmjerna ANOVA: interakcija virusa x sesije (F(1,30)=5.83, p < 0.05)="" ,="" sidakovi="" post="" hoc="" testovi,="" ***p="">< 0,001,="" n="17," 15,="" svi="" muškarci).="" h="" ukupno="" istraživanje="" je="" bilo="" slično="" za="" obje="" grupe="" na="" testu="" (t(30)="0.41," p="0.68)." podaci="" su="" predstavljeni="" kao="" srednja="" vrednost="" ±="" sem="" u="" sistemu="" crispr-sam,="" transficirali="" smo="" ht22="" ćelije="" sa="" sva="" tri="" plazmida,="" sakupili="" ćelije="" 24="" ili="" 48="" h="" kasnije="" i="" izmerili="" ekspresiju="" per1="" mrna.="" do="" 48="" h="" nakon="" transfekcije,="" per1="" mrna="" je="" značajno="" povećana="" u="" grupi="" kojoj="" je="" data="" per1="" sgrna="" u="" poređenju="" sa="" kontrolama="" (slika="" 5f),="" potvrđujući="" da="" crispr-sam="" sistem="" efikasno="" pokreće="" ekspresiju="" per1="" mrna.="" nismo="" primijetili="" promjenu="" u="" ekspresiji="" ni="" za="" per2="" mrna="" (dopunska="" slika="" 6e)="" niti="" za="" hes7="" mrna="" (dopunska="" slika="" 6f),="" što="" ukazuje="" da="" crispr-sam="" sistem="" pokreće="" selektivnu="" prekomjernu="" ekspresiju="" ciljnog="" gena,="">

Zatim, 18-mo miševima su date intrahipokampalne infuzije lentivirusa CRISPR-SAM (dopunska slika 6d) i obučeni su u OLM 2 sedmice kasnije. Kao što je uočeno s našom prekomjernom ekspresijom pLVX-v5Per1, prekomjerna ekspresija Per1 posredovana CRISPR-SAM-om značajno je poboljšanamemorijaperformanse kod miševa sa infuzijom Per1 sgRNA u odnosu na kontrolne životinje (slika 5g) bez uticaja na ukupno istraživanje (slika 5h) ili kretanje tokom navikavanja (dopunska slika 8e). Samo miševi kojima je data Per1 sgRNA pokazali su značajno povećanje sklonosti prema pokretnom objektu u mirovanju u odnosu na trening, što ukazuje na netaknutumemorijaza lokacije objekata (slika 5g). Nakon ponašanja, hipokampalno tkivo iz podskupine životinja je obrađeno za sekvenciranje RNK kako bi se potvrdilo prisustvo CRISPR transkripata u odgovarajućim grupama in vivo (dodatna slika 7c–g). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da je prekomjerna ekspresija Per1 u dorzalnom hipokampusu dovoljna za ublažavanje oštećenja vezanih za starenje u dugotrajnoj memoriji lokacije objekata. Per1 je, dakle, ključni gen koji je kritičan za formiranje dugotrajnog pamćenja, reguliran je HDAC3 i oštećen je u mozgu koji stari.

Diskusija

Naši rezultati pokazuju da brisanje ili poremećaj represivne histon deacetilaze HDAC3 može dugoročno poboljšati oštećenja povezana sa starenjem.memorijai sinaptičku plastičnost. Nadalje, delecija HDAC3 obnavlja ekspresiju cirkadijalnog gena Per1 izazvanu iskustvom u dorzalnom hipokampusu. Kako je ekspresija PER1 hipokampusa kritična za formiranje dugotrajnog pamćenja (slika 4) i prekomjerna ekspresija Per1 u hipokampusu ublažava oštećenja pamćenja vezana za starenje (slika 5), ​​PER1 je potencijalni mehanizam kroz koji se poboljšava brisanje HDAC3memorijai sinaptička plastičnost kod ostarjelih miševa. U širem smislu, poremećaj Per1 povezan sa godinama može povezati oštećenja vezana za starost iu dugoročnoj memoriji i cirkadijalnom ritmiku, ovisno o strukturi.

Jedan ključni nalaz iz trenutne studije bio je da se oštećenja hipokampalnog LTP-a povezana sa starenjem mogu poboljšati brisanjem ili poremećajem HDAC3. Ovo je u skladu s nedavnim radom iz laboratorije Sajikumar koji pokazuje da farmakološka blokada HDAC3 također može ublažiti oštećenja povezana sa starenjem u asocijativnom hipokampalnom LTP34. Zanimljivo je da smo otkrili da kriške starih HDAC3flox/flox i HDAC3(Y298H) životinja nisu uspjele postići isti nivo potenciranosti kao kriške mladih HDAC3flox/flox ili HDAC3(Y298H) životinja (slika 2c, f), što sugerira da stariji mozgovi mogu imati niži plafon plastičnosti od mladih mozgova. Jedno od mogućih objašnjenja za ovu razliku u potenciranju je da gubitak sinaptičkih kontakata u CA122 povezan sa godinama može sniziti plafon plastičnosti u hipokampusu koji stari, jer bi manje dostupnih sinapsi postalo zasićeno brže nego relativno obilne sinapse u mladom DH. Ako je to slučaj, jačanje protokola stimulacije ili pružanje razmaknutih napada stimulacije35 ne bi trebalo dodatno povećati LTP u hipokampusu koji stari, jer dodatne sinapse nisu dostupne. Biće neophodan dalji rad kako bi se utvrdio mehanizam koji leži u osnovi ove razlike.

Naši rezultati sekvenciranja RNK pokazali su da samo mala podskupina gena odgovara kriterijumima obnavljanja u starom mozgu brisanjem HDAC3 (slika 3e). Stoga, umjesto da se rekapitulira profil ekspresije gena mladog mozga, brisanjem HDAC3 u starom mozgu obnovljeno je iskustvom indukovana ekspresija nekoliko ključnih gena koji su kritično važni za formiranje dugotrajne memorije, uključujući Per1. Čini se da je Per1 direktno reguliran od strane HDAC3, jer je fokalna delecija HDAC3 obnovljena iskustvom izazvana Per1 ekspresija i HDAC3 je fizički uklonjen iz Per1 promotora kao odgovor na OLM trening. Nadalje, izraz Per1 je neophodan zamemorija, kao siRNA posredovano uništavanje PER1 proteina u DH dugoročno oštećenomemorijaformiranje kod mladih miševa, a prekomjerna ekspresija se poboljšalamemorijaza OLM kod ostarjelih miševa. Primjetno je da su oba lentivirusna sistema korištena za prekomjernu ekspresiju Per1 transficirala samo mali broj ćelija u CA1b području dorzalnog hipokampusa (dopunska slika 6a, d), zbog čega je bilo potrebno potvrditi prisustvo ovih konstrukta RNA-sekvenciranjem (vidi metode ). Kako je prethodni rad pokazao da je ova precizna regija dorzalnog hipokampusa kritična za OLM36, ovo pokazuje da čak i mala fokalna promjena Per1 unutar strukture relevantne za memoriju može utjecati na formiranje dugotrajnog pamćenja. Ovo proširuje prethodna istraživanja koja pokazuju da nespecifična delecija Per1 u cijelom mozgu može narušiti formiranje pamćenja kod mladih miševa6,28,29. Abnormalna HDAC{12}}posredovana represija Per1 u mozgu starenja je stoga ključni događaj koji može dovesti do oštećenja vezanih za starenje kako u formiranju dugotrajne memorije tako i u cirkadijalnom ritmiku. Iako ova studija jasno pokazuje da je Per1 važan gen putem kojeg HDAC3 regulira dugotrajno pamćenje u mozgu koji stari, drugi geni najvjerovatnije doprinose efektima brisanja HDAC3 koji poboljšavaju pamćenje. Drugi geni za koje je predloženo da posreduju u efektima HDAC3 na sinaptičku plastičnost i pamćenje uključuju NF-κB34, FMRP37 i Nr4a226. U trenutnoj studiji, identifikovali smo dodatna tri gena (Slika 3f:Nr4a1, Egr1, Tsc22d3) koji, kao i Per1, pokazuju oštećenu ekspresiju u mozgu koji stari, što je poboljšano brisanjem HDAC3. Trenutno je nejasno kako ovi različiti geni jedinstveno doprinose efektima brisanja HDAC3 koji poboljšavaju memoriju. Značajno je da se svi ovi geni povezuju sa CBP/CREB putem, koji je kritičan za formiranje dugoročne memorije38,39 i nalazi se i uzvodno i nizvodno od PER16,28. Kako je PER1 uzvodno od CREB fosforilacije6, moguće je da HDAC3-posredovana represija Per1 smanjuje CREB fosforilaciju, na kraju narušavajući transkripciju CREB posredovanih gena poput Fmrp40,41 i članova porodice Nr4a gena Nr4a226 i Nr4a226. Razumijevanje složene dinamike između HDAC3, PER1 i ovih drugih molekularnih igrača bit će važan cilj budućih istraživanja.

U trenutnoj studiji koristili smo dvije komplementarne metode za prekomjernu ekspresiju Per1 u mozgu koji stari: prekomjernu ekspresiju per1 cDNK konstrukta pune dužine korištenjem pLVX-v5Per1 i transkripcijsku aktivaciju endogenog Per1 korištenjem CRISPR-SAM sistema. Iako je prekomjerna ekspresija posredovana pLVX-om dovela do velikog povećanja Per1 mRNA (slika 5b), ovo je bilo popraćeno povećanjem Per2, drugog člana porodice Perioda (dopunska slika 6b). Ekspresija nizvodnog gena Hes7, međutim, ostala je nepromijenjena od strane pLVX-v5Per1 (dodatna slika 6c). CRISPR-SAM sistem je, s druge strane, proizveo suptilnije povećanje Per1 mRNA koje je izbjeglo izvanciljna poboljšanja ili Per2 ili Hes7 ekspresije (dodatna slika 6e-f). Kako su se oba pristupa na sličan način poboljšala dugoročnomemorijakod ostarjelih miševa, malo je vjerovatno da je povećanje Per2 izvan cilja, uočeno sa pLVX-v5Per1, uzrok uočenog poboljšanja dugotrajne memorije.

Cirkadijalni efekti na dugoročnomemorijatradicionalno se vjeruje da proizlaze iz disregulacije unutar SCN-a, koja zatim pokreće promjene u perifernim strukturama uključenim u formiranje pamćenja, poput dorzalnog hipokampusa. Malo se zna o ulozi pojedinačnih gena cirkadijalnog sata u DH, uprkos jasnoj povezanosti između cirkadijalne ritmičnosti i formiranja dugoročne memorije. Memorija je usko povezana s vremenom u danu, jer kaskade gena povezane s plastikom pokazuju cirkadijalne oscilacije3,6 imemorijamogu se lakše dobiti u određenim periodima cirkadijalnog ciklusa. Na primjer, uslovljavanje konteksta straha se jače stiče tokom dana, kada je nivo fosforilacije MAPK na vrhuncu3. Nadalje, dobro je dokumentirano da je starenje praćeno slomom cirkadijalnih ritmova, vjerovatno zbog promjena u centralnom cirkadijalnom satu, suprahijazmatskom jezgru (SCN) (za pregled1). Kako se ovaj poremećaj u cirkadijalnom satu odnosi na oštećenja povezana sa starenjemmemorijaje otvoreno pitanje. Naši rezultati sugeriraju da HDAC3 ograničava Per1 izazvan iskustvom u hipokampusu koji stari, što možda doprinosi uočenim oštećenjima u dugotrajnoj memoriji. Epigenetska represija Per1 stoga može predstavljati važnu vezu između oštećenja vezanih za dob u cirkadijalnom ritmiku i formiranju dugotrajne memorije.

Od ključnih kanonskih gena cirkadijalnog sata, Per1 je jedinstveno spreman da dramatično utiče na hipokampalni dugoročni periodmemorija. Čini se da je Per1 pretežno uključen u izlazne puteve SCN-a i igra ključnu ulogu u perifernim satovima nizvodno od SCN-a, kao što je hipokampus42. Dalje, nedavni rad sugerira da Per1 može "pretvoriti" prostornu memoriju tokom ciklusa dan/noć kontrolirajući CREB fosforilaciju6,28,29. Zaista, regulacija hipokampalne Per1 mRNA je primijećena nakon konteksta ili prostornog učenja u najmanje tri druge RNA-seq studije, uključujući rad na pacovima, što ukazuje da je Per1 tipično povećan nakon učenja među vrstama20,43,44. Zajedno sa rezultatima tekuće studije, ovaj rad ukazuje da je ekspresija PER1 kritično važna za formiranje hipokampalne dugoročne memorije; smanjenje PER1 koje se javlja noću29 ili sa starenjem može oštetiti hipokampalmemorija. Izlaziti s,

istraživanje koje implicira Per1 inmemorijaformacija se isključivo oslanjala na globalne nokaute koji ometaju ekspresiju Per1 u jezgru cirkadijalnog sata i drugim regijama, pored struktura relevantnih za memoriju kao što je hipokampus6,28,29,45,46, čineći nemogućim utvrditi da li je hipokampalni PER1 posebno potreban za formiranje memorije. Zaista, globalno brisanje Per1 utiče na cirkadijalni ritmičnost u nekim izvještajima42. Ovdje po prvi put pokazujemo da smanjenje ekspresije PER1 direktno u dorzalnom hipokampusu može narušitimemorijakod mladih miševa, dok lokalna prekomjerna ekspresija Per1 u dorzalnom hipokampusu može poboljšati pamćenje kod starijih miševa. Kako selektivna delecija HDAC3 (koja regulira Per1) u dorzalnom hipokampusu nije imala utjecaja na cirkadijalne obrasce aktivnosti u trenutnoj studiji (dopunska slika 4), a čak su i elektrolitičke lezije dorzalnog hipokampusa nedovoljne da utječu na cirkadijalni ritam, čini se nevjerovatnim47 Manipulacija Per1 unutar dorzalnog hipokampusa utiče na funkciju centralnog cirkadijalnog sata. Ipak, moguće je da povećanje Per1 izazvano iskustvom ili prekomjerna ekspresija Per1 posredovana virusom može utjecati na cirkadijalne oscilacije drugih molekularnih igrača, kao što su drugi geni sata, unutar hipokampalnih neurona, čak i bez utjecaja na cirkadijalne obrasce aktivnosti. Razumijevanje načina na koji Per1 funkcionira da mijenja formiranje pamćenja, uključujući identifikaciju ovih potencijalnih partnera u interakciji, bit će cilj budućeg rada.

Zajedno, ovi rezultati pokazuju da glavni cirkadijalni gen Per1 igra ključnu ulogu u lokalnimmemorijastrukture za promjenu formiranja memorije, uloga koja je neovisna o njegovoj funkciji u SCN-u. Općenito, ovo dovodi u pitanje tradicionalnu hipotezu da se cirkadijanski mijenjamemorijaformiranje je vođeno promjenama u jezgru cirkadijalnog sata i umjesto toga podržava hipotezu da geni cirkadijalnog sata igraju autonomniju ulogu u ćelijama hipokampusa, moguće da upravljaju formiranjem memorije na osnovu doba dana6.

Metode

Miševi. Mladi odrasli miševi bili su stari između 2 i 4 mjeseca u vrijeme testiranja, a stariji miševi bili su stari između 18 i 20 mjeseci. Svi miševi su bili C57BL/6J ili održavani na pozadini C57BL/6 (HDAC3 plus / plus i HDAC3flox/flox miševi). Miševi su imali slobodan pristup hrani i vodi, a svjetlo je održavano u ciklusu svjetlo/mrak od 12 sati. Sva testiranja ponašanja vršena su tokom svjetlosnog ciklusa. Svi eksperimenti su provedeni u skladu sa smjernicama američkog Nacionalnog instituta za zdravlje za njegu i upotrebu životinja i odobreni su od strane Komiteta za institucionalnu njegu i korištenje životinja Univerziteta Kalifornije, Irvine.

Operacija. Miševi su anestezirani izofluranom (inducirani, 4 posto; održavani 1,5-2{4}} posto) i stavljeni u stereotaksik. Igle za injekcije su spuštene na dorzalni hipokampus brzinom od 0,2 mm/15 s (AP, −2.0 mm; ML, ± 1,5 mm, DV, − 1,5 mm u odnosu na Bregmu ). Dvije minute nakon dostizanja ciljne dubine, 1.0 ul virusa ili siRNA je infundirano bilateralno u DH brzinom od 6 ul/h. Za CRISPR-SAM lentivirusne infuzije, koktel od tri virusa je infundiran do konačnog volumena od 1,5 μL po hemisferi istom brzinom. Igle za injekcije su ostale na mjestu dvije minute nakon injekcije kako bi se virus proširio. Injektori su zatim podignuti 0.1 mm i ostavljeni da stoje još jednu minutu prije nego što su uklonjeni brzinom od 0.1 mm za 15 s. Virusne infuzije su obavljene 2 sedmice prije bihevioralne analize, dok je siRNA knockdown obavljena 2 dana prije treninga13. Za sve eksperimente s injekcijom, životinje su nasumično raspoređene u različite uslove ubrizgavanja (sa izuzetkom HDAC3 plus/plus i HDAC3flox/flox miševa, kojima je svima ubrizgan AAV-CaMKII-Cre). Za sve eksperimente u ponašanju, životinje unutar svakog virusnog stanja nasumično su dodijeljene u kućne kaveze/obučene grupe i svi uvjeti (predmeti, kutije, itd.) su uravnoteženi između grupa.

AAV proizvodnja. AAV2.1-CaMKII-Cre je kupljen od Penn Vector Core (titar: 1,81 × 1013 GC/ml). Za AAV2.1-HDAC3(Y298H)-v5, amplificirali smo divlji tip HDAC3 iz hipokampalne cDNK i klonirali proizvod u modificirani pAAV-IRES-hrGFP (Agilent) pod kontrolom CMV promotora i -globinskog introna. 3×-FLAG oznaka, IRES element i hrGFP su uklonjeni iz vektora i zamijenjeni sa V5 oznakom, omogućavajući fuziju C-terminala sa HDAC3 (plazmid MW91). Da bismo stvorili tačkastu mutaciju, promijenili smo nukleotide da kodiraju histidinski ostatak umjesto tirozina na aminokiselini 298 (plazmid MW92). Za kontrolu praznog vektora, HDAC3 kodirajuća sekvenca nije bila prisutna, ali su ostali svi elementi (plazmid MW87). AAV je napravljen pomoću Penn Vector Core, a konačni titri su određeni qPCR (AAV-HDAC3(Y298H): 6,48 × 1012 GC/ml; AAV-EV: 1,35 × 1013 GC/ml).

Proizvodnja lentivirusa. Za CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) sistem, lentivirusni plazmidi su kupljeni od Addgenea za dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) i MS2- P65-HSF1_Hygro (#61426-LVC) konstrukcije (titri veći ili jednaki 8× 106 TU/ml). Za Per1 sgRNA, klonirali smo i ubacili antisens vodeći sekvencu koja odgovara CRE elementu u promotoru Per1 (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) u klonirajuću kičmu Addgene sgRNA(MS2) (#61427). Kontrolna sgRNA je bila identična, osim što nijedna vodička sekvenca nije klonirana u plazmid. Lentiviruse za Per1 sgRNA (titar: 6,8 × 107 IFU/ml) i kontrolnu sgRNA (3,5 × 107 IFU/ml) proizvela je Lentivirusna laboratorija USC School of Pharmacy.

Za pLVX-V5Per1 konstrukt prekomjerne ekspresije, pojačali smo divlji tip Per1 pune dužine iz Addgene pCMV-Sport2-mPer1 plazmida (#16203) i klonirali proizvod u modificirani pLVX-EF1 -IRES-mCherry kičma (Takara, #631987). IRES i mCherry elementi su uklonjeni i zamijenjeni V5 oznakom, omogućavajući fuziju N-terminala sa PER1 (plazmid MW206). Za kontrolu praznog vektora (EV), PER1 kodirajuća sekvenca nije bila prisutna, ali su ostali svi elementi (Plazmid MW93). Lentiviruse za pLVX-v5Per1 (titar: 1,3 × 108 IFU/ml) i pLVX-EV (titar: 1,5 × 108 IFU/ml) proizvela je Lentivirusna laboratorija USC School of Pharmacy. Svi lentivirusni konstrukti su eksprimirani pod EF1 promotorom.

Provjera kulture ćelija pLVX-v5Per1 i CRISPR-SAM. Da bi se potvrdilo da pLVX-v5Per1 proizvodi prekomjernu ekspresiju Per1 mRNA, mišje HT22 ćelije (Salk Institute, La Jolla, CA, #T09031) su transficirane sa pLVX-v5Per1 ili pLVX-EV (slika 5a) korištenjem Lipofectaine LTX (Invitrogen). Slično tome, kako bi se potvrdilo da CRISPR-SAM sistem može efikasno pokretati transkripciju Per1, HT22 ćelije su transficirane sa dCas9-VP64 (lenti MS2-P65_HSF1_Blast je poklon od Feng Zhanga Addgene plazmida #61425), MS2-P65-HSF1 (lenti dCAS-VP64_Blast je poklon od Feng Zhanga, Addgene plazmid #61426), i bilo Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) ili neciljana kontrolna sgRNA (ctrl sgRNA) (lenti sgRNA (MS2)_zeo kičma je poklon od Feng Zhanga, Addgene plazmid #61427) koristeći Lipofectamine LTX (Invitrogen). Ćelije su sakupljene nakon 24 ili 48 h, lizirane i mRNA je izolirana kako je gore opisano. qRT-PCR je izveden kao što je gore opisano korišćenjem Per1, Per2 i Hes7 prajmera i sonde navedene u tabeli S4.

siRNA. Za eksperiment obaranja Per1, male interferirajuće RNK Accell SMARTpool (siRNA; Dharmacon, GE) koje ciljaju Per1 razrijeđene su do konačne ukupne koncentracije od 10 μM u ddH20 i infundirane u DH (1,0 ul/strani). Accell neciljana siRNA je korištena kao kontrola (ukupna koncentracija, 10 μM) i infundirana je na isti način. Za eksperimente sa siRNA, miševi su rukovani i navikavani kako je gore opisano, a operacija je izvedena dan nakon posljednjeg dana navikavanja. Miševi su dobili cijeli dan oporavka nakon operacije i obučeni su sljedećeg dana (~48 h nakon operacije) kako bi se osiguralo maksimalno oborenje mete. Kako bi se osiguralo nokdaun, miševi su žrtvovani ~1 h nakon testa, a udarci iz dorzalnog hipokampusa su obrađeni western blotovima kako bi se osiguralo obaranje PER1 proteina.

Lokacija objekta i prepoznavanje objekatamemorijazadataka. Za zadatke lociranja objekata i memorijskih zadataka prepoznavanja objekata, miševi su držani 2 min/dan 4 dana, a zatim su naviknuti na kontekst 5 min/dan šest uzastopnih dana u odsustvu objekata. Tokom treninga, miševi su bili izloženi dva identična predmeta (čaše od 100 ml, konzerve začina ili stakleni svijećnjaci) i ostavljeni da istražuju 10 minuta. Tokom retencionog testa (24 h kasnije za dugotrajnomemorijaili 60 m kasnije za kratkoročno pamćenje), miševima je dozvoljeno da istražuju 5 minuta. Za lokaciju objektamemorija, jedan od dva poznata objekta je premješten na novu lokaciju. Za prepoznavanje objekatamemorija, lokacije objekata su ostale konstantne, ali je jedan od objekata zamijenjen novom stavkom. Navikavanje na memoriju za prepoznavanje objekata počelo je najmanje nedelju dana nakon završetka OLM testiranja i korišćen je novi kontekst i nepoznati objekti48. Istraživanje je ocjenjivano kada se glava miša orijentirala prema objektu i došla u krug od 1 cm ili kada je nos dodirnuo objekt. Ukupno vrijeme istraživanja je zabilježeno (t), a preferencija za novi predmet je izražena kao indeks diskriminacije (DI=(tnovel -tfamiliar) / (tnovel plus tfamiliar) x 100 posto). Za sesije obuke, objekt koji je određen da se pomjeri na testu korišten je kao novi objekt kako bi se omogućilo direktno poređenje DI za obuku i testiranje. Miševi koji su istraživali oba objekta manje od 2 s tokom testiranja ili 3 s tokom treninga uklonjeni su iz dalje analize. Miševi koji su tokom treninga pokazali sklonost prema jednom objektu (DI > ±20) su također uklonjeni. Sesije navikavanja su analizirane (da bi se odredila pređena udaljenost i brzina) korišćenjem softvera za analizu ponašanja bilo kog lavirinta (Stoelting Co). Sva navikavanja, treninga, testiranja i bodovanja izveli su eksperimentatori zaslijepljeni za eksperimentalne grupe.

Kontekst strah od uvjeta. Za kontekstualno uslovljavanje straha, miševi su prvo tretirani 5 dana. Tokom akvizicije, miševi su bili izloženi kontekstu 2 minute i 28 s, nakon čega je uslijedio šok od 2 s (0.75 mA), protokol koji tipično proizvodi robusnu dugoročnu memoriju12,20. Miševi su ostali u kontekstu dodatnih 30 s prije nego što su uklonjeni. Miševi su žrtvovani 60 m nakon treninga zajedno sa kontrolama u kućnom kavezu kojima se rukuje, ali nisu obučavani. Ponašanje pri smrzavanju je mjereno korištenjem softvera Ethovision 11 (Noldus)12.

Uzdignuti plus-lavirint. Plus-labirint je proveo eksperimentator slijep za eksperimentalne grupe. Sedmicu nakon završetka ORM-a, podskup miševa je testiran na plus-labirintu. Dva kraka lavirinta su bila otvorena (30 × 5 cm), a dva kraka su bila zatvorena (30 × 5 × 15 cm), povezana centralnom platformom (5 × 5 cm). Lavirint je bio uzdignut 40 cm iznad poda. Miševi su testirani 5 minuta na aparatu, koji se sastojao od postavljanja svakog miša na centralnu platformu okrenutu prema jednoj od otvorenih ruku. Između ispitanika, lavirint je očišćen sa 70 posto etanola. Procenat vremena provedenog u zatvorenim i otvorenim rukama se boduje korišćenjem BILO KOGA-lavirint softvera.

Analiza cirkadijanskog ritma. Mladi ({{0}}mj.) i stari (18-mj.) HDAC3 plus/plus i HDAC3flox/flox miševi su uzgajani i smješteni u ciklusu od 12 sati svjetlo/mrak (LD). Dvije sedmice nakon AAV-CaMKII-Cre infuzije (opisane gore), miševi su prebačeni u izolovanu 12 h LD prostoriju za uvlačenje na 7 dana. Miševi su zatim prebačeni u prostoriju za analizu aktivnosti zaštićenu svjetlom, gdje je analizirana lokomotorna aktivnost pomoću optičkih detektora pokreta (Philips Respironics). Aktivnost je praćena tokom 2 sedmice LD ciklusa ulaska u prostoriju zaštićenu svjetlom prije nego što su miševi prebačeni na stalni mrak (DD) na dodatne 3 sedmice. Praćenje aktivnosti se nastavilo tokom DD faze kako bi se utvrdilo da li delecija HDAC3 u DH utiče na endogene cirkadijalne ritmove. Podaci su prikupljeni pomoću Minimitter VitalView 5.0, a softver Clocklab (Actimetrics) je korišten za određivanje početka slobodne aktivnosti. Tau vrijednosti su izračunate dobijanjem nagiba ovog početka i izračunavanjem najmanjih kvadrata koji odgovaraju softveru Clocklab49,50.

Imunohistohemija. Nakon završetka ponašanja, miševi su eutanazirani dislokacijom vrata maternice, a njihovi mozgovi su uklonjeni i zamrznuti u ledeno hladnom izopentanu. Rezovi od dvadeset mikrometara sakupljeni su kroz dorzalni hip-kampus, postavljeni na stakalce i pohranjeni na -80 stepeni. Slajdovi su fiksirani sa 4 posto paraformaldehida (10-min), permeabilizirano u 0.01 posto Triton X-100 u 0,1 M PBS (5-min) , i blokiran 1 h sa 8 posto normalnog kozjeg seruma (Jackson). Stakalca su inkubirana preko noći (4 stepena) u zečjem antitelu na HDAC3 (1:250, Abcam, klon Y415, ab32369) ili V5 (1:1000, Abcam, ab9116), ili pilećem antitelu na GFP (1:250, Aves Labs, #GFP1010). Sljedećeg dana, stakalca su isprana i inkubirana 1 h na sobnoj temperaturi sa kozjim anti-zečjim Alexa 488 (HDAC3 i V5; 1:1000, ThermoFisher, #A-11008) ili kozjim anti-pilećim Alexa 488 (GFP 1:1000, ThermoFisher, #A-11039) u mraku. Stakalca su zatim isprana PBST-om i inkubirana 50 m u NeuroTrace 530/615 (1:50; ThermoFisher, #N21482), fluorescentnoj nissl bojici. Da bi se ugasila nespecifična autofluorescencija51, kriške su zatim isprane u PBS sa 0,01 posto Tritona, isprane u vodi i inkubirane 10-min u 10 mM CuSO4 u 50 mM amonijum acetatnom puferu. Kriške su ponovo isprane u vodi, oprane u PBS-u i prekrivene VectaShield Antifade medijumom za montažu (Vector Laboratories).

Sve slike su snimljene Olympus skenerom VS110 sa 20x apohromatskim objektivom (numerički otvor 0,75) sa softverom skenera VS110. Sve grupe tretmana bile su predstavljene na svakom slajdu i sve slike na slajdu su snimljene sa istim vremenom ekspozicije u nezasićenim uslovima. Intenzitet imunoobilježavanja je kvantificiran pomoću ImageJ uzorkovanjem optičke gustoće ćelijskog sloja u CA1 i oduzimanjem uzorka pozadinske fluorescencije na istoj slici. Za sve AAV eksperimente, životinje koje nisu uspjele da eksprimiraju virus u području CA1 dorzalnog hipokampusa isključene su iz analiza. Snimanje i kvantifikciju izvršili su eksperimentatori slijepi za eksperimentalne uvjete.

Western blot. Da bi se potvrdilo nokdaun PER1, Per1 siRNA i kontrolni siRNA miševi su žrtvovani 2 h nakon testiranja, a mozgovi su zamrznuti. Mozak je koronalno isječen i 1 mm DH udarci su sakupljeni iz rezova od 500 μm. Udarci su homogenizovani u T-PER puferu (Thermo Fisher) sa Halt proteazom i inhibitorom fosfataze (Thermo Fisher) koristeći Dounce homogenizator. Proteinski lizati su kvantificirani korištenjem modificiranog Bradfordovog testa (BioRad) i 50 ug ukupnog proteinskog lizata je ubačeno u svaku traku 7,5 posto NuPAGE Bis-Tris gela (Thermo Fisher). Gelovi su radili 50 minuta na 200 volti i mrlje su prebačene preko noći na 15 V na 4 stepena na nitrocelulozne membrane (Novexi, LC2001). Sljedećeg dana, membrane su inkubirane u puferu za blokiranje 1 h (5 posto nemasnog mlijeka u Tris puferiranoj fiziološkoj otopini sa 0,01 posto Tween 20), isprane (0,1 posto Tween 20 u TBS) i zatim inkubirane u primarnom antitelu (1:500, zečji anti-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) u primarnom puferu antitijela (3 posto BSA u TBS sa 0,1 posto Tween-a) preko noći na 4 stepena. Membrane su zatim isprane i inkubirane u HRP-konjugovanom mišjem antitelu na zeca (1:10,000, Jackson Laboratories, specifična za laki lanac, #211-032-171) 1 h. Membrane su isprane i razvijene upotrebom Pierce SuperSignal West Pico hemiluminiscentnog supstrata (Pierce, 34077). Višestruke ekspozicije filma korištene su za provjeru linearnosti. Mrlje su isprane i skinute 10 m sa Restore Western Blot puferom za uklanjanje (Thermo Fisher #21059), ponovo isprane, a zatim ponovo ispitane preko noći (4 stepena) sa zečjim antitelom na GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, SC25778 ). PER1 i GAPDH mrlje pune dužine prikazane su na dodatnoj slici 5. Relativna optička gustina izračunata je iz skeniranog filma pomoću ImageJ (Nacionalni institut za zdravlje SAD) od strane eksperimentatora slijepog za eksperimentalne uvjete. Sve vrijednosti su normalizirane na nivoe ekspresije GAPDH.

qRT-PCR. Tkivo je sakupljeno iz DH punčeva (opisanih gore) i zamrznuto na -80 stepeni do obrade. RNK je izolovana korišćenjem RNeasy Minikita (Qiagen, #74104), a cDNK je kreirana korišćenjem kompleta za sintezu cDNK prvog lanca transkriptora (Roche, 04379012001). Prajmeri i sonde su izvedeni iz Roche Universal ProbeLibrary (Tabela S4) i korišćeni su za multipleksiranje u Roche Light-Cycle 480 II mašini (Roche). Sve vrijednosti su normalizirane na Gapdh. Analize i statistike rađene su korištenjem Roche vlasničkog algoritama i REST 2009 softvera baziranog na Pfaffivoj metodi52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 je uključeno u našu analizu. Biblioteke cDNK za svaku grupu pripremljene su prema Vodiču za pripremu uzorka TruSeq RNA (Illumina). Dvjesto pedeset nanograma ukupne RNK iz svakog miša je pročišćeno magnetnim kuglicama vezanim za poli-T oligo i toplotno fragmentirano. Prvi i drugi lanac cDNK su potom sintetizirani i pročišćeni. Nakon što su krajevi zatupljeni, 3′ kraj je adeniliran kako bi se spriječilo spajanje šablona tokom povezivanja adaptera. Za svaku grupu, jedinstveni set adaptera je dodat na krajeve cDNK, a biblioteke su umnožene PCR-om. Kvalitet biblioteke je procijenjen Bioanalyzerom i kvantificiran korištenjem qRT-PCR sa standardnom krivom pripremljenom iz komercijalne biblioteke sekvenciranja (Illumina). Uzorci su multipleksirani, pri čemu je svaka grupa ponašanja predstavljena u svakoj protočnoj ćeliji sekvencera. 10 nM svake biblioteke je objedinjeno u četiri multipleksne biblioteke i sekvencionirano na instrumentu Illumina HiSeq 2500 tokom sekvenciranja od 50 bp pojedinačnog čitanja, koje je sproveo Genomic High-Throughput Facility na Univerzitetu Kalifornije, Irvine. Rezultirajući podaci sekvenciranja za svaku biblioteku su naknadno obrađeni kako bi se proizvele FastQ datoteke. Podaci su zatim demultipleksirani i filtrirani korišćenjem softvera Illumina CASAVA 1.8.2, kao i internog softvera. Očitavanja lošeg kvaliteta (koja nisu uspjela na Illumininim standardnim testovima kvaliteta) i kontrolna očitavanja uspješno usklađena sa PhiX kontrolnim genomom uklonjena su iz analiza. Kvalitet preostalih sekvenci je dalje procenjen korišćenjem PHRED rezultata kvaliteta proizvedenih u realnom vremenu tokom koraka pozivanja baze sekvenciranja (dodatna slika 3a).

Usklađivanje sa referentnim genomom i transkriptomom. Očitavanja iz svakog eksperimenta su odvojeno poređana sa referentnim genomom i odgovarajućim transkriptomom korištenjem kratko-čitanih alignera ELAND v2e (Illumina) i Bowtie24. Čitanja koja su oba alata jedinstveno poravnala sa poznatim egzonima ili spojevima spajanja s ne više od dva nepodudaranja na bilo kojem 25 bp fragmentu očitanja uključena su u transkriptom. Čitanja su jedinstveno usklađena, ali s više od dva nepodudaranja na bilo kojem 25 bp fragmentu pročitanog uklonjena su iz analiza. Slično, očitavanja koja odgovaraju nekoliko lokacija u referentnom genomu su uklonjena iz analize. Procenat čitanja koji je dodijeljen referentnom genomu i transkriptomu pomoću ovog protokola prijavljen je za svaku grupu replika (dodatna slika 3b). Ovo je rezultiralo u prosjeku oko 30 miliona čitanja po uzorku.

Da bismo potvrdili prisustvo plazmida pLVX i CRISPR-SAM nakon lentivirusne infuzije, izvršili smo sekvenciranje RNK na uzorcima hipokampusa iz podskupine od tri životinje po grupi nakon ponašanja. Kako je broj ćelija inficiranih lentivirusima in vivo bio premalen da bi pouzdano otkrio prisustvo odgovarajućih transkripata pomoću RT-qPCR (dodatna slika 6a, d), koristili smo RNA-seq kao osjetljiviju metodu za otkrivanje prisutnosti ovih transkripata. Ažurirana verzija sklopa genoma i beleške genoma su napravljene dodavanjem sekvenci i beleške plazmidnih konstrukata originalnom mm10 mišjem genomu i mm10 komentaru genoma miša, respektivno. Koristeći alat za poravnanje čitanja TopHat u Tuxedo Suite54, očitavanja su mapirana u genom i samo pogoci koji su bili jedinstveni za transkripte plazmida u poređenju sa endogenim referentnim genomom miša smatrani su "podudarnim čitanjima" za plazmidne konstrukte. Broj tih podudarnih očitavanja je zatim kvantificiran za svaki konstrukt za svaki uzorak.

Ekspresija gena i diferencijalna analiza. Nivoi ekspresije gena su direktno izračunati iz rezultata čitanja poravnanja za svaku repliku. Standardne vrijednosti RPKM55, čitanja po kilobazi modela egzona na milion mapiranih čitanja) ekstrahovane su za svaki gen obuhvaćen podacima sekvenciranja i svaku repliku korištenu u ovoj studiji.

Diferencijalne transkripcijske analize su obavljene korištenjem Cyber ​​T56,57 u svakom paru grupa (kućni kavez naspram 6{26}} m nakon treninga) kako bi se identificirali geni koji su regulirani naviše ili naniže nakon OLM-a. Pored 18-mjesečnih HDAC3 plus / plus i HDAC3flox/flox miševa obučenih za trenutnu studiju, identično obrađeni podaci o sekvenciranju RNA od {{10}}mjesečnih C57 miševa divljeg tipa ( homecage i OLM obučeni na isti način kao i trenutna studija) iz prethodne studije20 korištena je za diferencijalne analize. Broj životinja (bioloških replika) za svaku grupu je bio: Mladi HDAC plus / plus HC: 6, Mladi HDAC3 plus / plus OLM: 6, Stari HDAC3 plus / plus HC: 6, Stari HDAC3 plus / plus OLM: 6, Stari HDAC3flox/flox HC: 8, stari HDAC3flox/flox OLM: 8. Nisu korištene tehničke kopije. Prag p-vrijednosti koji se koristi za određivanje diferencijalne ekspresije je 0,05 za sve grupe. Stopa lažnog otkrivanja (FDR) mjerena q-vrijednošću Benjamini & Hochberg (BH) korištena je za korekciju višestrukog testiranja, s pragom FDR od 0,15. Skupovi gena koji su regulirani nakon iskustva (u poređenju sa kućnim kavezom) za ove 3 grupe (mladi divlji tip, starenje HDAC plus / plus ili starenje HDAC3flox/flox) su ukrštani kako bi se odredili geni zajednički za dvije ili više grupa. Obogaćivanje svake grupe za tkivno-specifičnu ekspresiju, pojmove genske ontologije58 i KEGG puteve59,60 procijenjeno je korištenjem DAVID61, na osnovu različito eksprimiranih gena nakon ponašanja. Vizualizacija podataka je izvedena pomoću "matplotlib" za python i "ggplot" za R.

Imunoprecipitacija hromatina. ChIP je izveden na DH udarcima na osnovu protokola iz Millipore ChIP kita11,12,62. Tkivo je umreženo sa 1 posto formaldehida (Sigma), lizirano i ultrazvučno, a kromatin je imunoprecipitiran preko noći sa 2 ul anti-H4K8Ac (Millipore #17-10099) ili 4 ul anti-HDAC3 (Millipore #{{ 13}}) ili ekvivalentnu količinu normalnog zečjeg seruma (H4K8Ac negativna kontrola, Millipore) ili anti-mišjeg IgG (HDAC3 negativna kontrola, Millipore). Nakon ispiranja, hromatin je eluiran iz kuglica i obrnuto umrežen u prisustvu proteinaze K prije pročišćavanja DNK u koloni. Primer sekvence za promotore svakog gena dizajnirane su programom Primer 3 (Tabela S4). Pet ul ulaznog, imunoprecipitata anti-H4K8Ac IgG/anti-HDAC3 IgG ili anti-zečjeg/mišjeg IgG imunoprecipitata iz svake životinje je ispitano u duplikatu. Da bismo normalizovali ChIP-qPCR podatke, koristili smo metod unosa procenta. Ulazni uzorak je podešen na 100 posto i oba uzorka IP i IgG su izračunati kao postotak ovog unosa koristeći formulu 100*AE^(prilagođeni unos – Ct(IP)). Obogaćivanje nabora je zatim izračunato kao omjer ChIP i prosječnog IgG. Standardna kriva u pločici određivala je efikasnost amplifikacije (AE).

Priprema i snimanje rezova. Mladi (otprilike 3-mj.) i ostarjeli (18-mj.) miševi su stereotaksički infuzirani virusom. Za prvi eksperiment, mladi i stari HDAC3 plus/plus i HDAC3flox/flox miševi su infuzirani sa AAV-CaMKII-Cre bilateralno u DH. Za drugi eksperiment, mladim i starim miševima divljeg tipa C57 infuziran je AAV-HDAC3(Y298H) u DH jedne hemisfere i AAV-EV kontrola u drugu hemisferu. Dvije sedmice nakon infuzije (da bi se omogućila optimalna ekspresija virusa)2, poprečni rezovi hipokampusa (320 μm) stavljeni su u komoru za snimanje sa prethodno zagrijanom (31 ± 1 stepen) vještačkom cerebrospinalnom tekućinom (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mm1). KH2PO4, 1,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 i 10 mM D-glukoze). Kriške su kontinuirano perfuzirane brzinom od 1,75-2 ml u minuti dok je površina kriški bila izložena toplom, vlažnom 95 posto O2/5 posto CO2. Snimanje je počelo nakon najmanje 2 h inkubacije.

Ekscitatorni postsinaptički potencijali polja (fEPSP) snimljeni su iz CA1b stratum radiatum pomoću jedne staklene pipete (2–3MΩ) napunjene 2 M NaCl. Stimulacijski impulsi (0.05 Hz) isporučeni su u Schafferove kolateralno-komisurne projekcije korištenjem bipolarne stimulirajuće elektrode (upletena nihromska žica, 65 μm) postavljene u CA1c. Intenzitet struje je prilagođen da se dobije 50 posto maksimalnog fEPSP odgovora. Nakon što je uspostavljena stabilna osnovna linija, LTP je induciran jednim nizom od pet theta rafala, u kojima je svaki burst (četiri impulsa na 100 Hz) isporučen u razmaku od 200 ms (tj. na theta frekvenciji). Intenzitet stimulacije nije povećan tokom TBS-a. Podaci su prikupljeni i digitalizovani pomoću NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Theta Burst).

Statistička analiza. Statističke analize su rađene kako je naznačeno u tekstu i legendi slika pomoću Prism 6 (GraphPad). Naši analitički pristupi zasnovani su na ranije objavljenim radovima12,20,63,64. Nisu korištene statističke metode za unaprijed određivanje veličine uzoraka, ali naše veličine uzorka su slične onima koje se općenito koriste u ovoj oblasti, uključujući one navedene u prethodnim publikacijama12,20,64,65. Pretpostavljalo se da je distribucija podataka normalna, sa sličnim varijansama uočenim među grupama, ali to nije formalno testirano. Kada je eksperiment imao dvije grupe za poređenje, korišteni su dvostrani Studentovi t-testovi. Kada su upoređivana dva faktora (kao što su dob i genotip ili sesija i grupa), podaci su analizirani sa dvosmjernim ANOVA-ama praćenim Sidakovim post hoc testovima višestrukih poređenja. Sve analize su dvostrane, sa vrijednošću od 0,05 koja je potrebna za značajnost. Trake grešaka na svim slikama predstavljaju SEM. Za sve eksperimente, vrijednosti ± 2SD od srednje vrijednosti grupe smatrane su izvanrednim vrijednostima i uklonjene su iz analiza.

Dostupnost podataka. Podaci koji podržavaju nalaze ove studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev. Podaci o sekvenciranju RNA deponovani su u NCBI-jev omnibus genske ekspresije i dostupni su putem pristupnog broja GEO serije GSE94832.

Reference

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ Epigenetske promjene u suprahijazmatskom jezgru i hipokampusu doprinose kognitivnom padu vezanom za starenje. Oncotarget 6, 23181–23203 (2015).

2. Gerstner, JR & Yin, JC Cirkadijski ritmovi i formiranje memorije. Nat. Rev. Neurosci. 11, 577–588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL et al. Cirkadijalna oscilacija MAPK aktivnosti hipokampusa i cAmp: implikacije na postojanost memorije. Nat. Neurosci. 11, 1074–1082 (2008).

4. Chaudhury, D. & Colwell, CS Cirkadijska modulacija učenja i pamćenja kod miševa uslovljenih strahom. Behav. Brain Res. 133, 95–108 (2002).

5. Kondratova, AA i Kondratov, RV Cirkadijalni sat i patologija starenja mozga. Nat. Rev. Neurosci. 13, 325–335 (2012).

6. Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. & Stehle, JH. J. Neurochem. 138, 731–745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA & Sweatt, JD Epigenetska hipoteza kognitivne disfunkcije povezane sa starenjem. Front Aging Neurosci. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. et al. Izmijenjena acetilacija histona povezana je s oštećenjem pamćenja ovisno o dobi kod miševa. Science 328, 753–756 (2010).

9. Snigdha, S. et al. Inhibicija H3K9me3 poboljšava pamćenje, potiče formiranje kralježnice i povećava nivoe BDNF u ostarjelom hipokampusu. J. Neurosci. 36, 3611–3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS & Rapp, PR Epigenetički doprinosi kognitivnom starenju: rastavljanje uma i životnog vijeka. Learn Mem. 21, 569–574 (2014).

11. Malvaez, M. et al. HDAC3-selektivni inhibitor pojačava izumiranje ponašanja u potrazi za kokainom na uporan način. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 2647–2652 (2013).

12. Kwapis, JL et al. Kontekst i slušni strah su različito regulisani aktivnošću HDAC3 u lateralnim i bazalnim subnukleusima amigdale. Neuropsychopharmacology 42, 1284–1294 (2017).

13. McQuown, SC et al. HDAC3 je kritičan negativni regulator formiranja dugotrajne memorije. J. Neurosci. 31, 764–774 (2011).

14. Bieszczad, KM i dr. Inhibicija histon deacetilaze preko RGFP966 otpušta kočnice senzorne kortikalne plastičnosti i specifičnosti formiranja memorije.J. Neurosci. 35, 13124–13132 (2015).

15. Lahm, A. et al. Otkrivanje skrivene katalitičke aktivnosti histon deacetilaze klase IIa kralježnjaka. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 17335–17340 (2007).

16. Sun, Z. et al. Funkcija HDAC3 nezavisna od deacetilaze u transkripciji i metabolizmu zahteva korepresor nuklearnog receptora. Mol. Cell 52, 769–782 (2013).

17. Alahband, Y. et al. Različite uloge za domen deacetilaze HDAC3 u hipokampusu i medijalnom prefrontalnom korteksu u formiranju i izumiranju pamćenja. Neurobiol. Naučite. Mem. 145, 94–104 (2017).

18. Nott, A. et al. Histon deacetilaza 3 povezuje se sa MeCP2 da reguliše FOXO i društveno ponašanje. Nat. Neurosci. 19, 1497–1505 (2016).

19. Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR Histon deacetilaza 3 je neophodna za pravilan razvoj mozga. J. Biol. Chem. 289, 34569–34582 (2014).

20. Vogel-Ciernia, A. et al. Regulatorna podjedinica hromatina BAF53b, specifična za neuron, neophodna je za sinaptičku plastičnost i pamćenje. Nat. Neurosci. 16, 552–561 (2013).

21. Alberini, CM Transkripcijski faktori u dugotrajnoj memoriji i sinaptičkoj plastičnosti. Physiol. Rev. 89, 121–145 (2009).

22. Barnes, CA Dugotrajno potenciranje i starenje mozga. Philos. Trans. R. Soc. London. B 358, 765–772 (2003).

23. Speir, ML et al. Baza podataka UCSC Genome Browser: ažuriranje iz 2016. Nukleinske kiseline Res. 44, D717–D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, SL Ultrabrzo i memorijsko efikasno usklađivanje kratkih DNK sekvenci sa ljudskim genomom. Genome Biol. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB et al. Analize ekspresije hipokampusa otkrivaju selektivnu povezanost neposredno-ranih, neuroenergetskih i mijelinogenih puteva sa kognitivnim oštećenjem kod starijih pacova. J. Neurosci. 27, 3098–3110 (2007).

26. McNulty, SE et al. Različite uloge za Nr4a1 i Nr4a2 u lokaciji objekta u odnosu na dugotrajnu memoriju prepoznavanja objekata. Learn Mem. 19, 588–592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Efekti deprivacije sna i starenja na dugotrajno i udaljeno pamćenje kod miševa. Learn Mem. 22, 197–202 (2015).

28. Rawashdeh, O. et al. PERIOD1 koordinira ritmove hipokampusa i obradu memorije sa danom. Hippocampus 24, 712–723 (2014).

29. Jilg, A. et al. Vremenska dinamika ekspresije gena mišjeg hipokampalnog sata podržava procesiranje memorije. Hippocampus 20, 377–388 (2010).

30. Eckel-Mahan, KL Cirkadijske oscilacije unutar hipokampusa podržavaju formiranje memorije i postojanost. Front Mol. Neurosci. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK & McGaugh, JL Ekspresija gena zavisna od iskustva u hipokampusu pacova nakon prostornog učenja: poređenje neposredno ranih gena Arc, c-fos i zif268. J. Neurosci. 21, 5089–5098 (2001).

32. Kouzarides, T. Chromatin modifikacije i njihova funkcija. Cell 128, 693–705 (2007).

33. Konermann, S. et al. Aktivacija transkripcije na nivou genoma pomoću projektovanog kompleksa CRISPR-Cas9. Nature 517, 583–588 (2015).

34. Sharma, M., Shetty, MS, Arumugam, TV & Sajikumar, S. Inhibicija histon deacetilaze 3 ponovo uspostavlja sinaptičko označavanje i hvatanje u starenju kroz aktivaciju nuklearnog faktora kapa B. Sci. Rep. 5, 16616 (2015).

35. Kramar, EA et al. Sinaptički dokazi za efikasnost razmaknutog učenja. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 5121–5126 (2012).

36. Barrett, RM et al. Hipokampalni fokalni nokaut CBP-a utječe na specifične modifikacije histona, dugotrajnu potenciranje i dugotrajno pamćenje. Neuropsychopharmacology 36, 1545–1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR & McMahon, LL. Povećana dugotrajna potenciranje na medijalno-perforantnom putu-dentatnih granula ćelija sinapsi izazvana selektivnom inhibicijom histon deacetilaze 3 zahtijeva Fragile X protein mentalne retardacije. Neurobiol. Naučite. Mem. 114, 193–197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB i memorija. Annu. Rev. Neurosci. 21, 127–148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. Funkcionalne uloge CREB-a kao pozitivnog regulatora u formiranju i poboljšanju pamćenja. Brain Res. Bik. 105, 17–24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD & Reines, D. Gen koji kodira krhki protein koji se vezuje za X RNK kontrolira nuklearni respiratorni faktor 2 i CREB familija transkripcionih faktora. Nukleinske kiseline Res. 34, 1205–1215 (2006).

41. Wang, H. et al. Uloga CREB-a u regulaciji FMRP metabotropnim glutamatnim receptorima grupe I u cingularnom korteksu. Mol. Brain 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Monako, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. Promijenjeni ritmovi ponašanja i ekspresija gena sata kod miševa sa ciljanom mutacijom u genu Period1. EMBO J. 20, 3967–3974 (2001).

43. Halder, R. et al. Promjene metilacije DNK u genima za plastičnost prate formiranje i održavanje pamćenja. Nat. Neurosci. 19, 102–110 (2016).

44. Duke, CG, Kennedy, AJ, Gavin, CF, Day, JJ & Sweatt, JD Epigenomska reorganizacija hipokampusa zavisna od iskustva. Learn Mem. 24, 278–288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. & Kidokoro, Y. Sat gen, tačka, igra ključnu ulogu u formiranju dugoročnog pamćenja kod Drosophile. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 16058–16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. Senzibilizacija i nagrada na kokain su pod uticajem cirkadijanskih gena i ritma. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 9026–9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR Dnevna oscilacija aktivnosti MAP (protein aktivirane mitogenom) kinaze i adenilil ciklaze u hipokampusu zavisi od suprahijazmatskog jezgra. J. Neurosci. 31, 10640–10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Ispitivanje lokacije objekta i memorije za prepoznavanje objekata kod miševa. Curr. Protoc. Neurosci. 69, 1–17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. et al. Cirkadijalni sat u ventromedijalnom hipotalamusu kontrolira cikličku potrošnju energije. Cell Metab. 23, 467–478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Fenotipizacija cirkadijanskih ritmova kod miševa. Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 271–281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA & Wessendorf, MW Smanjenje autofluorescencije slične lipofuscinu u fluorescentno označenom tkivu. J. Histochem. Cytochem. 47, 719–730 (1999).

52. Pfaffl, MW Novi matematički model za relativnu kvantifikaciju u realnom vremenu RT-PCR. Nukleinske kiseline Res. 29, e45 (2001).

53. Pfaffl, MW, Horgan, GW & Dempfl, L. Softverski alat za relativnu ekspresiju (REST) ​​za grupno poređenje i statističku analizu rezultata relativne ekspresije u PCR-u u realnom vremenu. Nukleinske kiseline Res. 30, e36 (2002).

54. Trapnell, C. et al. Diferencijalna analiza ekspresije gena i transkripta RNA-seq eksperimenata sa TopHat i Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562–578 (2012).

55. Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Mapiranje i kvantifikacija transkriptoma sisara pomoću RNA-Seq. Nat. Metode 5, 621–628 (2008).

56. Kayala, MA & Baldi, P. Cyber-T web server: diferencijalna analiza podataka velike propusnosti. Nukleinske kiseline Res. 40, W553–W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD Bayesov okvir za analizu podataka o ekspresiji mikromreža: regularizirani t-test i statistički zaključci o promjenama gena. Bioinformatika 17, 509–519 (2001).