DIO 2 Ehinakozid inhibira oslobađanje glutamata suzbijanjem naponski ovisnog Ca2 plus ulaza i protein kinaze C u cerebrokortikalnim nervnim terminalima pacova

Za više informacija kontaktirajte:Joanna.jia@wecistanche.com

KLIKNITE OVDJE ZA 1. DIO

3. Diskusija

U ovoj studiji, ehinakozid, aktivni spoj uHerba Cistanche, inhibirao4-aminopiridin izazvano oslobađanje glutamata u nervnim terminalima moždane kore pacova. Mogući osnovni mehanizmi za inhibiciju oslobađanja glutamata posredovanu ehinakozidom dalje se istražuju i raspravljaju ovdje.

Cistanche deserticola ima mnogo efekata, kliknite ovde da saznate više

3.1. Mehanizmi u osnovi inhibicije otpuštanja glutamata posredovane ehinakozidom Oslobađanje glutamata

izazvano 4-aminopiridinom sadrži dvije komponente: fiziološki relevantnu komponentu zavisnu od Ca2 plus, koja se proizvodi egzocitozom sinaptičkih vezikula koji sadrže glutamat; i Ca2 plus -nezavisna komponenta, koja potiče od produžene depolarizacije koja uzrokuje pomak stabilnog stanja glutamatnog transportera posredovanog membranskim potencijalom prema van, čime utiče na efluks citosolnog glutamata [31]. Evo, primetili smo toechinacosidenije značajno inhibirao oslobađanje glutamata izazvano 4-aminopiridinom izazvano u prisustvu medija bez Ca2 plus (oslobađanje neovisno o Ca2 plus). Nadalje, uočenoechinacoside-posredovana inhibicija oslobađanja glutamata izazvanog 4-aminopiridinom efikasno je spriječena bafilomicinom A1 (koji iscrpljuje sadržaj glutamata u sinaptičkim vezikulima), ali ne i DL-TBOA (koji neselektivno inhibira sve podtipove ekscitatornih transportera amino kiselina). Ovi rezultati ukazuju na toechinacosideutječe na Ca2 plus-zavisnu egzocitozu oslobađanja glutamata bez utjecaja na Ca2 plus-nezavisni citosolni efluks glutamata kroz preokret prijenosa glutamata u plazma membrani nervnog terminala. U sinaptičkim terminalima, inhibicija Na plus kanala ili aktivacija K plus kanala stabilizuje ekscitabilnost membrane i posljedično smanjuje izazvani ulazak Ca2 plus i oslobađanje neurotransmitera [32,33]. Dakle, potencijalni mehanizam koji leži u osnoviechinacoside-posredovana inhibicija oslobađanja glutamata uključuje smanjenje sinaptosomske ekscitabilnosti. Međutim, ova mogućnost je neodrživa na osnovu dva zapažanja: (1) 4-depolarizacija membranskog potencijala izazvana 4-aminopiridinom, mjerena bojom DiSC3(5) osjetljivom na membranski potencijal, nije bila pod utjecajem dodatkaechinacoside; i (2) ehinakozid nije uticao na 4-aminopiridin izazvano Ca2 plus -nezavisno oslobađanje glutamata, komponentu oslobađanja koja zavisi samo od membranskog potencijala [31]. Ako efekat nije izazvan supresijom sinaptosomske ekscitabilnosti, može se manifestovati kroz smanjenje aktivnosti Cav2.2 (N-tip) i Cav2.1 (P/Q-tip) Ca2 plus kanala zajedno sa glutamatnom egzocitozom u nervnih terminala [34–36]. Koristeći fura-2, to pokazujemoechinacosideznačajno smanjuje 4-aminopiridin izazvano povećanje koncentracije Ca2 plus. Osim toga, naši podaci pokazuju da je inhibitorni učinakechinacosidena 4-oslobađanje glutamata izazvano aminopiridinom smanjeno je sa 42,4 posto ˘ 2,3 posto na 12,1 posto ˘ 3,9 posto nakon izlaganja blokatoru Cav2.2 (N-tip) i Cav2.1 (P/Q-tip) Ca2 plus kanali. Štaviše, primetili smo toechinacosidenastavlja značajno inhibirati oslobađanje glutamata izazvano 4-aminopiridinom u prisustvu intracelularnih inhibitora oslobađanja Ca2 plus. Ovi rezultati pokazuju da je istovremena supresija Cav2.2 (N-tip) i Cav2.1 (P/Q-tip) aktivnosti Ca2 plus kanala potencijalni mehanizam u osnoviechinacoside-posredovana inhibicija oslobađanja glutamata. Međutim, kombinovana aktivacija Cav2.2 (N-tip) i Cav2.1 (P/Q-tip) Ca2 plus aktivnost kanala nije mogla blokirati djelovanjeechinacosidepotpuno. Stoga, drugi neidentificirani tipovi Ca2 plus kanala ili drugi presinaptički putevi mogu biti uključeni u inhibiciju. Na primjer, GABAA receptori su prisutni na presinaptičkom nivou, a pokazalo se da njihova aktivacija inhibira Ca2 plus priliv i oslobađanje glutamata [37]. U ovoj studiji, antagonisti GABAA receptora SR95531 i bikukulin nisu blokirali inhibiciju oslobađanja glutamata posredovanu ehinakozidom, što sugerira da GABAA receptori nisu uključeni u smanjenje aktivnosti Ca2 plus kanala zavisne od napona iu kasniju inhibiciju oslobađanja glutamata.

Ulazak Ca2 plus kroz naponsko zavisne Ca2 plus kanale aktivira nekoliko protein kinaza povezanih sa oslobađanjem glutamata u nervnim terminalima, uključujući protein kinazu aktiviranu mitogenom, protein kinazu C i protein kinazu A. Ovdje pokazujemo da inhibitori protein kinaze C efikasno antagonizirajuechinacoside-posredovana inhibicija oslobađanja glutamata; ipak, inhibitor protein kinaze aktiviran mitogenom PD98059 ili inhibitor protein kinaze A H89 je bio neefikasan. Štaviše, to. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1006 8 od 13 4-aminopiridin-indukovane fosforilacije protein kinaze C smanjena je u sinaptosomima nakon prethodnog tretmana saechinacosideu koncentraciji efikasnoj za inhibiciju oslobađanja glutamata. Dakle, signalni put odechinacoside-posredovana inhibicija oslobađanja glutamata može uključiti protein kinazu C. Protein kinaza C je važan intracelularni signalni sistem koji je prisutan na presinaptičkom nivou i ima ključnu ulogu u egzocitozi neurotransmitera. Na primjer, nekoliko sinaptičkih proteina uključenih u promet sinaptičkih vezikula ili regrutaciju i egzocitozu, kao što je miristoilirani supstrat C kinaze bogat alaninom, fosforilira se protein kinazom C [38,39]. Ovaj proces fosforilacije može se povećati depolarizacijom stimuliranim ulaskom Ca2 plus, što olakšava oslobađanje glutamata [40]. Dakle, možemo razumno spekulisati da je inhibitorni efekatechinacosidena Ca2 plus ulazak koji je ovdje uočen može smanjiti aktivnost protein kinaze C i posljedično oslobađanje glutamata.

3.2. Terapeutske implikacije

Ekscitotoksičnost, patološki proces uzrokovan prekomjernim oslobađanjem glutamata i aktivacijom glutamatnih receptora, glavni je uzrok smrti neurona kod akutnih i kroničnih poremećaja mozga kao što su moždani udar, traumatska ozljeda mozga, Parkinsonova i Alchajmerova bolest [13,41] i terapijske strategije. koje uključuje inhibiciju oslobađanja glutamata može biti obećavajuća neuroprotektivna strategija za liječenje takvih bolesti.Echinacosidepotvrđeno je da prodire kroz krvno-moždanu barijeru (BBB) ​​i da ispoljava neuroprotektivne efekte u različitim in vivo modelima neurotoksičnosti [8,10–12,42]. Iako mehanizam ovih neuroprotektivnih efekata nije u potpunosti shvaćen, nekoliko mogućih mehanizama je prijavljeno uključujući inhibiciju inflamatornog odgovora, stabilizaciju mitohondrijalne funkcije, antioksidaciju, uklanjanje slobodnih radikala i oponašanje neurotrofne funkcije [5,9,12,42]. U trenutnoj studiji, sposobnost ehinakozida da smanji oslobađanje glutamata iz nervnih završetaka također može djelomično objasniti njegov neuroprotektivni mehanizam. Međutim, da li ovaj učinak doprinosi očiglednom terapijskom potencijalu ehinakozida u poremećajima mozga povezanim s ekscitotoksičnošću glutamata zahtijeva daljnja istraživanja.

4. Materijali i metode

4.1. Hemikalije

Fura-2-acetoksimetil ester (Fura-2-AM) i 3',3',3'-dipropiltiadikarbocijanin jodid [DiSC3(5)] kupljeni su od Invitrogena (Carlsbad, CA, SAD). ω-konotoksin MVIIC, rottlerin,2-[1-(3-dimetilaminopropil)indol-3-il]-3-(indol-3-il) maleimid ( GF109203X), 5,6,7,13-tetrahidro-13-metil-5-okso-12H-indolo[2,3-a]pirolo[3,{ {27}}c]karbazol-12-propannitril (Go6976) i N-[2-(p bromocinamilamino)etil]-5-izohinolinsulfonamid (H89) kupljeni su od TocrisBioscience (Bristol, UK). Ehinakozid, dantrolen, DL-treo-beta-benzil-oksiaspartat (DL-TBOA),7-hloro-5-(2-klorofenil)-1,5-dihidro -4,1-benzotiazepin-2(3H)-on (CGP37157), 2-(2-amino-3-metoksifenil)-4 H-1-benzopiran-4-on) (PD98059), etilen glikol bis(-aminoetil etar)-N,N,N1,N1-tetraoctena kiselina (EGTA) i svi ostali reagensi su kupljeni iz Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, SAD).

4.2. Životinje

Korišteni su dvomjesečni mužjaci Sprague-Dawley pacova. Životinje su bile smještene u standardiziranim uvjetima okoline (22 ˘ 1 ˝C; 50 posto relativne vlažnosti; 12 h ciklus svjetlo/mrak) i dozvoljen im je neograničen pristup hrani i vodi. Životinje su ubijene dekapitacijom, a cerebralni korteks je brzo uklonjen na 4 ˝C. Eksperimentalne procedure je odobrio Fu Jen Institutional Animal Care and Utilization Committee (A10259), u skladu sa vodičem Nacionalnog instituta za zdravlje za njegu i korištenje laboratorijskih životinja. Uloženi su svi napori da se patnja životinja svede na minimum i da se koristi minimalan broj životinja neophodan za postizanje pouzdanih rezultata.

4.3. Synaptosomal Preparations

Sinaptozomi su pročišćeni iz cerebralnog korteksa pacova na diskontinuiranim Percoll gradijentima kao što je prethodno opisano [43,44]. Ukratko, tkivo je homogenizovano u medijumu koji sadrži 0.32 M saharozu (pH 7,4), homogenat je centrifugiran 10 min na 3000ˆ g (5{{25 }}00 o/min u rotoru JA 25.5; Beckman Coulter, Inc., Miami, FL, SAD) i 4 ˝C, a supernatant je ponovo centrifugiran 12 minuta na 14,500ˆ g ( 11,000 o/min u rotoru JA 25.5). Pelet je lagano resuspendiran u 0,32 M saharoze (pH 7,4), a alikvot ove sinaptosomske suspenzije (2 mL) stavljen je na 3 mL Percoll diskontinuirani gradijent koji sadrži 0,32 M saharoze, 1 mM EDTA, 0,25 mM EDTA i 0,25 dilit. 3 posto, 10 posto i 23 posto Percoll (pH 7,4). Nakon centrifugiranja na 32.500ˆg (16.500 o/min u JA 20.5 rotoru) u trajanju od 7 minuta na 4˝C, sinaptosomi su izvučeni između 10% i 23% Percoll traka i razrijeđeni su u konačnoj zapremini od 30 mL. HEPES pufer medija (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2¨ 6H2O, 1,2 mM Na2HPO4, 10 mM glukoze i 10 mM HEPES (pH 7,4)). Nakon daljeg centrifugiranja na 27,000ˆ g (15,000 rpm u JA 25.5) tokom 10 minuta, pelet sinaptosoma je resuspendiran u 3 mL HEPES pufer medija, a sadržaj proteina je određen korištenjem Bradfordovog testa. Konačno, 0,5 mg suspenzije sinaptosoma je razrijeđeno u 10 ml HEPES pufer medija i centrifugirano na 3000ˆg (5000 rpm u JA 20.1 rotoru) 10 min. Supernatant je odbačen, a pelete koje sadrže sinaptozome su pohranjene na ledu i korištene u roku od 4-6 sati.

4.4. Oslobađanje glutamata

Oslobađanje glutamata je analizirano onlajn fluorimetrijom kao što je prethodno opisano [45,46]. Sinaptozomske pelete su resuspendirane u HEPES pufer mediju (0.5 mg/mL) i prethodno inkubirane na 37 ˝C 10 minuta u prisustvu 16 µM albumina goveđeg seruma kako bi se vezale sve slobodne masne kiseline oslobođene iz sinaptosoma tokom preinkubacije. 2-mL alikvot sinaptosoma prebačen je u kivetu za miješanje koja sadrži 2 mM NADP plus, 50 jedinica glutamat dehidrogenaze i 1,2 mM CaCl2, a FL fluorescencija NADPH je izmjerena u Perkin-Elmer LS{{ 14}} spektrofluorimetar (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, SAD) na talasnim dužinama ekscitacije i emisije od 340 i 460 nm, respektivno. Kako sinaptozomi nisu podložni električnoj stimulaciji, za stimulaciju oslobađanja glutamata korišten je blokator kalijumovih kanala 4-aminopiridin. 4-aminopiridin destabilizuje membranski potencijal i smatra se da uzrokuje ponavljajuću spontanu depolarizaciju zavisnu od Na plus kanala koja je usko aproksimirana in vivo depolarizaciji sinaptičkog terminala što dovodi do aktivacije naponsko zavisnih Ca2 plus kanala i oslobađanja neurotransmitera [47 ]. Podaci su dobijeni u intervalima od 2 s. Standard egzogenog glutamata (5 nmol) je dodan na kraju svakog eksperimenta. Vrijednost promjene fluorescencije FL proizvedene standardnim dodavanjem korištena je za izračunavanje oslobođenog glutamata kao nanomola glutamata po miligramu sinaptosomalnog proteina (nmol/mg). Vrijednosti oslobađanja navedene u tekstu su nivoi postignuti u stabilnom stanju nakon 5 min depolarizacije (nmol/mg/5 min). Kumulativni podaci analizirani su korištenjem Lotus 1-2-3 tabela (IBM, White Plains, NY, SAD) i MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, SAD).

4.5. Potencijal plazma membrane

Potencijal plazma membrane određen je bojom osjetljivom na membranski potencijal, DiSC3(5) [48]. Sinaptozomi su resuspendirani u HEPES pufer mediju, a alikvoti od 2 ml prebačeni su u kivetu za miješanje koja sadrži 5 µM DiSC3(5) na 37 ˝C u Perkin-Elmer LS{10}} spektrofluorometru (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham MA, SAD). Nakon puštanja smjese da se uravnoteži 3 min, FL fluorescencija je određena na talasnim dužinama ekscitacije i emisije od 646 i 674 nm, respektivno. Podaci su prikupljani u intervalima od 2 s. Kumulativni podaci su analizirani korišćenjem MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, SAD) i izraženi u FL fluorescentnim jedinicama.

4.6. Citosolna koncentracija Ca2 plus ([Ca2 plus ]C)

[Ca2 plus ]C je mjeren Ca2 plus indikatorom fura-2. Sinaptozomi (0.5 mg/mL) su prethodno inkubirani u HEPES pufer mediju koji sadrži 5 µM fura-2 i 0.1 mM CaCl2, 30 minuta na 37 ˝C uz miješanje tube. Nakon punjenja fura-2, sinaptozomi su centrifugirani u mikrocentrifugi 30 s na 3000ˆg (5000 rpm). Sinaptozomske pelete su resuspendirane u HEPES pufer mediju, a sinaptosomska suspenzija je miješana u termostatiranoj kiveti u Perkin-Elmer LS{17}} spektrofluorometru (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, SAD). CaCl2 (1 mM) je dodan nakon 3 min, a nakon dodatnih 10 min. Podaci o fluorescenciji su akumulirani na talasnim dužinama ekscitacije od 340 i 380 nm (valna dužina emisije 505 nm) u intervalima od 2 s. [Ca2 plus ]C (nM) izračunat je korištenjem postupaka kalibracije [49] i jednadžbi opisanih ranije [50]. Kumulativni podaci analizirani su korištenjem MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA).

4.7. Western blotting

Sinaptozomi su homogenizirani u puferu za lizu (10 mM HEPES pufer, pH 7,4), 1 posto Triton X-100 i mješavini inhibitora proteaze. Lizati su bistreni centrifugiranjem, a koncentracija proteina je određena pomoću kompleta za analizu proteina (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornija, SAD). Jednake količine proteina su odvojene natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezom (SDS-PAGE) i prebačene na nitroceluloznu membranu. Membrane su blokirane tris puferiranim fiziološkim rastvorom koji je sadržavao 5 posto mlijeka s niskim udjelom masti i inkubirane s odgovarajućim primarnim antitijelom (fosfo-protein kinaza C (pan), 1:3000, NOVUS Biologicals Inc., Beverly, MA, SAD) preko noći u 4 ˝C. Nakon tri ispiranja u tris puferiranoj fiziološkoj otopini, membrana je zatim tretirana sekundarnim antitijelom konjugiranim s peroksidazom hrena (1:3000) 1 h na sobnoj temperaturi. Membrane su zatim isprane najmanje tri puta sa Tris puferiranim fiziološkim rastvorom i vizualizovane korišćenjem poboljšanog sistema hemiluminiscencije (Amersham, Buckinghamshire, UK). Alikvot uzoraka je napunjen i ispitan anti-PKC antitelom za detekciju PKC kao kontrole punjenja. Nivo ekspresije ili fosforilacije procijenjen je gustinom trake, koja je kvantificirana denzitometrijom. Denzitometrijska kvantifikacija traka je analizirana korišćenjem softvera Syngene (Synoptics, Cambridge, UK).

4.8. Statistička analiza

Podaci su dobijeni iz jednog sinaptosomskog preparata i nisu bili nezavisni jedan od drugog. Da bi se testirala značajnost efekta lijeka u odnosu na kontrolu, korišten je dvostrani Studentov t-test. Kada je bilo potrebno dodatno poređenje (kao što je da li je drugi tretman utjecao na djelovanje ehinakozida), korištena je jednosmjerna ANOVA praćena Tukeyjevim testom. Analiza je završena putem softvera SPSS (17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ˘ SEM; značajnost je procijenjena na p < 0.05="" za="" sve="" statističke="">

5. Zaključci

Ovo je prva studija koja to pokazujeechinacosideinhibira oslobađanje glutamata iz cerebrokortikalnih sinaptosoma pacova smanjenjem Ca2 plus priliva kroz Cav2.2 i Cav2.1 kanale, a ova inhibicija oslobađanja vjerovatno ovisi o supresiji puta protein kinaze C, barem djelomično. Sadašnji nalaz je vrijedan jer pruža novi uvid u mehanizme djelovanja ehinakozida u mozgu.

Priznanja:Ovaj rad je podržan grantom Ministarstva nauke i tehnologije (MOST 103-2320-B-030-001 MY3).

Doprinosi autora:Tzu Yu Lin i Su Jane Wang osmislili su i dizajnirali eksperimente; Cheng Wei Lu je izveo eksperimente; Cheng Wei Lu i Shu Kuei Huang analizirali su podatke; Su Jane Wang je napisala rad.

Sukobi interesa:Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Reference

1. Tu, PF; Wang, B.; Deyama, T.; Zhang, ZG; Lou, ZC Analiza feniletanoidnih glikozidaHerba cistanchepomoću RP-HPLC. Acta Pharm. Sin. 1997, 32, 294-300.

2. Dalby-Brown, L.; Barrett, H.; Landbo, AK; Meyer, AS; Molgaard, P. Sinergistički antioksidativni efekti alkamida, derivata kafeinske kiseline i frakcija polisaharida iz Echinacea purpurea na in vitro oksidaciju humanih lipoproteina niske gustine. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 9413-9423. [CrossRef] [PubMed]

3. Dapas, B.; Dall'Acqua, S.; Bulla, R.; Agostinis, C.; Perissutti, B.; Invernizzi, S.; Grassi, G.; Voinovich, D. Imunomodulacija posredovana biljnim sirupom koji sadrži standardizirani ekstrakt korijena ehinacee: pilot studija na zdravim ljudskim subjektima o ekspresiji gena citokina. Fitomedicina 2014, 21,1406-1410. [CrossRef] [PubMed]

4. He, WJ; Fang, TH; Tu, PF Napredak istraživanja farmakoloških aktivnosti ehinakozida. Kina J. Chin. Mater. Med. 2009, 34, 476-479.

5. Deng, M.; Zhao, JY; Tu, PF.; Jiang, Y; Li, ZB; Wang, YH Echinacoside spašava SHSY5Y neuronske ćelije od apoptoze izazvane TNFalpha. EUR. J. Pharmacol. 2004, 505, 11-18. [CrossRef] [PubMed]

6. Koo, KA; Sung, SH; Park, JH; Kim, SH; Lee, KY; Kim, YC In vitro neuroprotektivne aktivnosti feniletanoidnih glikozida iz Callicarpa dihotoma. Planta Med. 2005, 71, 778-780. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, YH; Xuan, ZH; Tian, ​​S.; Du, GH Echinacoside Štiti od 6-Mitohondrijalne disfunkcije izazvane hidroksidopaminom i upalnih odgovora u PC12 ćelijama putem smanjenja proizvodnje ROS. Evid. Based Complement. Altern. Med. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

8. Zhu, M.; Lu, C.; Li, W. Prolazna izloženost ehinakozidu je dovoljna da aktivira Trk signalizaciju i zaštiti neuronske ćelije od rotenona. J. Neurochem. 2013,124, 571-580. [CrossRef] [PubMed]

9. Geng, X.; Tian, ​​X.; Tu, P.; Pu, X. Neuroprotektivni efekti ehinakozida u mišjem MPTP modelu Parkinsonove bolesti. EUR. J. Pharmacol. 2007, 564, 66-74. [CrossRef] [PubMed]

10. Wei, LL; Chen, H.; Jiang, Y; Tu, PF.; Zhong, M.; Du, J.; Liu, F.; Wang, L.; Liu, CY Efekti ehinakozida na histicentralne nivoe aktivne mase kod pacova sa okluzijom srednje cerebralne arterije. Biomed. Environ. Sci. 2012, 25, 238-244. [PubMed]

11. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Preokret vodenim ekstraktimaCistanche tubulosaod deficita u ponašanju u modelu štakora nalik Alchajmerovoj bolesti: Relevantnost za taloženje amiloida i funkciju centralnog neurotransmitera. BMC Complement. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, Q.; Gao, J.; Li, W.; Cai, D. Neurotrofni i neurospasivni efekti ehinakozida u subakutnom MPTP mišjem modelu Parkinsonove bolesti. Brain Res. 2010, 1346, 224-236. [CrossRef] [PubMed]

13. Meldrum, BS Glutamat kao neurotransmiter u mozgu: pregled fiziologije i patologije. J. Nutr. 2000, 130, 1007S-1015S. [PubMed]

14. Lee, D.; Šim, MS; Kim, KY; Ne, YH; Kim, H.; Kim, SY; Weinreb, RN; Ju, WK Koenzim Q10 inhibira ekscitotoksičnost glutamata i mitohondrijalne promjene posredovane oksidativnim stresom u mišjem modelu glaukoma. Investig. Oftalmol. Vis. Sci. 2014, 55, 993-1005. [CrossRef] [PubMed]

15. Choi, DW Kalcijum i ekscitotoksična povreda neurona. Ann. NY Acad. Sci. 1994, 747, 162-171. [CrossRef] [PubMed]

16. Lau, A.; Tymianski, M. Glutamat receptori, neurotoksičnost i neurodegeneracija. Pflugers. Arch. 2010, 460, 525-542. [CrossRef] [PubMed]

17. Sattler, R.; Tymianski, M. Molekularni mehanizmi ekscitotoksične neuronske smrti ćelija posredovane glutamatnim receptorom. Mol. Neurobiol. 2001, 24, 107-129. [CrossRef]

18. Schauwecker, PE Neuroprotekcija antagonistima glutamatnih receptora protiv ekscitotoksične ćelijske smrti uzrokovane napadima u starenju mozga. Exp. Neurol. 2010, 224, 207-218. [CrossRef] [PubMed]

19. Yeganeh, F.; Nikbakht, F.; Bahmanpoui; S.; Rastegar, K.; Namavar, R. Neuroprotektivni efekti NMDA i antagonista metabotropnih glutamatnih receptora grupe I protiv neurodegeneracije izazvane homocisteinom u hipokampusu pacova: In vivo studija. J. Mol. Neurosci. 2013, 50, 551-557. [CrossRef] [PubMed]

20. Doble, A. Uloga ekscitotoksičnosti u neurodegenerativnim bolestima: implikacije za terapiju. Pharmacol. Ther. 1999, 81, 163-221. [CrossRef]

21. Muir, KW Terapijski pristupi zasnovani na glutamatu: Klinička ispitivanja sa antagonistima NMDA. Curr. Opin. Pharmacol. 2006, 6, 53-60. [CrossRef] [PubMed]

22. Gonzalez, JC; Egea, J.; del Carmen Godino, M.; Fernandez-Gomez, FJ; Sanchez-Prieto, J.; Gandia, L.; Garcia, AG; Jordan, J.; Hernandez-Guijo, JM Neuroprotektant minociklin deprimira glutamatergičku neurotransmisiju i Ca2 plus signalizaciju u neuronima hipokampusa. EUR. J. Neurosci. 2007, 26, 2481-2495. [CrossRef] [PubMed]

23. Lu, CW; Lin, TY; Wang, SJ Memantin smanjuje oslobađanje glutamata kroz inhibiciju napon-zavisnog Ca2 plus ulaza i protein kinaze C u nervnim terminalima moždane kore pacova: mehanizam nezavisan od NMDA receptora. Neurochem. Int. 2010, 57, 168-176. [CrossRef] [PubMed]

24. Wang, SJ; Sihra, TS Nekonkurentni metabotropni antagonist glutamat 5 receptora (E)-2-metil-6- stiril-piridin (SIB1893) smanjuje oslobađanje glutamata kroz inhibiciju napon-zavisnog Ca2 plus ulaska u cerebrokortikalne nervne terminale pacova (sinaptozome). J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 309, 951-958. [CrossRef] [PubMed]

25. Dunkley, PR.; Jarvie, PE; Heath, JW; Kidd, GJ; Rostas, JA Brza metoda za izolaciju sinaptosoma na Percoll gradijentima. Brain Res. 1986, 372, 115-129. [CrossRef]

26. Araque, A.; Li, N.; Doyle, RT; Haydon, PG SNARE oslobađanje glutamata ovisno o proteinu iz astrocita. J. Neurosci. 2000, 20, 666-673. [PubMed]

27. Dunlop, J. Terapeutski pristupi zasnovani na glutamatu: Ciljanje na sistem transporta glutamata. Curr. Opin. Pharmacol. 2006, 6, 103-107. [CrossRef] [PubMed]

28. Zucchi, R.; Ronca-Testoni, S. Sarcoplasmic retikulum Ca2 plus kanal/ryanodin receptor: Modulacija endogenim efektorima, lijekovima i bolesnim stanjima. Pharmacol. Rev. 1997, 49, 1-51. [PubMed]

29. Fan, Y.; Li, J.; Zhang, YQ; Jiang, LH; Zhang, YN; Yan, CQ Protein kinaza C delta posredovana citotoksičnošću 6-hidroksidopamina putem kontinuirane aktivacije kinaze regulirane ekstracelularnim signalom 1/2 u PC12 ćelijama. Neurol. Res. 2014, 36, 53-64. [CrossRef] [PubMed]

30. Gschwendt, M.; Muller, HJ; Kielbassa, K.; Zang, R.; Kittstein, W.; Rincke, G.; Marks, F. Rottlerin, novi inhibitor protein kinaze. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 199, 93-98. [CrossRef] [PubMed]

31. Nicholls, DG; Sihra, TS; Sanchez-Prieto, J. Kalcijum zavisno i nezavisno oslobađanje glutamata iz sinaptosoma praćeno kontinuiranom fluorometrijom. J. Neurochem. 1987, 49, 50-57. [CrossRef] [PubMed]

32. Nicoll, RA Spajanje neurotransmiterskih receptora na jonske kanale u mozgu. Science 1988, 241, 545-551. [CrossRef] [PubMed]

33. Wu, LG; Saggau, P. Presinaptička inhibicija izazvanog oslobađanja neurotransmitera. Trends Neurosci. 1997, 20, 204-212. [CrossRef]

34. Turner, TJ; Dunlap, K. Farmakološka karakterizacija presinaptičkih kalcijumskih kanala korištenjem subsekundnih biohemijskih mjerenja sinaptosomalne neurosekrecije. Neuropharmacology 1995, 34, 1469-1478. [CrossRef]

35. Millan, C.; Sanchez-Prieto, J. Diferencijalno spajanje kalcijumskih kanala N- i P/Q-tipa na egzocitozu glutamata u cerebralnom korteksu pacova. Neurosci. Lett. 2002, 330, 29-32. [CrossRef]

36. Vazquez, E.; Sanchez-Prieto, J. Presinaptička modulacija oslobađanja glutamata cilja različite kalcijumske kanale u cerebrokortikalnim nervnim terminalima pacova. EUR. J. Neurosci. 1997, 9, 2009-2018. [CrossRef] [PubMed]

37. Long, P; Mercer, A.; Begum, R.; Stephens, GJ; Sihra, TS; Jovanović, JN GABAA receptori na nervnim terminalima aktiviraju Ca2 plus/kalmodulin zavisnu signalizaciju da inhibiraju naponski ograničen Ca2 plus priliv i otpuštanje glutamata. J. Biol. Chem. 2009,284, 8726-8737. [CrossRef] [PubMed]

38. Turner, JR; Angle, JM; Black, ED; Joyal, JL; Sacks, DB; Madara, JL PKC-ovisna regulacija transepitelne rezistencije: uloge MLC i MLC kinaze. Am. J. Physiol. 1999, 277, C{4}}C562. [PubMed]

39. Vaughan, PF; Walker, JH; Peters, C. Regulacija sekrecije neurotransmitera protein kinazom C. Mol. Neurobiol. 1998, 18, 125-155. [CrossRef] [PubMed]

40. Coffey, ET; Sihra, TS; Nicholls, DG; Pocock, JM Fosforilacija sinapsina I i MARCKS u nervnim terminalima je posredovana ulaskom Ca2 plus preko Aga-GI osjetljivog Ca2 plus kanala koji je povezan s egzocitozom glutamata. FEBS Lett. 1994, 353, 264-268. [CrossRef]

41. Obrenovitch, TP; Urenjak, J. Izmijenjeni glutamatergijski prijenos kod neuroloških poremećaja: od visokog ekstracelularnog glutamata do pretjerane sinaptičke efikasnosti. Prog. Neurobiol. 1997, 51, 39-87. [CrossRef]

42. Zhang, D.; Li, H.; Wang, JB Echinacoside inhibira amiloidnu fibrilizaciju HEWL i štiti od neurotoksičnosti izazvane Ap. Int. J. Biol. Macromol. 2015, 72, 243-253. [CrossRef] [PubMed]

43. Lin, TY; Lu, CW; Wang, CC; Lu, JF; Wang, SJ Hispidulin inhibira oslobađanje glutamata u cerebrokortikalnim nervnim terminalima pacova. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2012, 263, 233-243. [CrossRef] [PubMed]

44. Chang, CY; Lin, TY; Lu, CW; Huang, SK; Wang, YC; Chou, SS; Wang, SJ Hesperidin inhibira oslobađanje glutamata i vrši neuroprotekciju protiv ekscitotoksičnosti izazvane kainskom kiselinom u hipokampusu pacova. Neurotoxicology 2015,2015,157-169. [CrossRef] [PubMed]

45. Nicholls, DG; Sihra, TS sinaptozomi poseduju egzocitotski bazen glutamata. Nature 1986, 321, 772-773. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Wang, CC; Kuo, JR; Wang, SJ Dimebon, antihistaminik, inhibira oslobađanje glutamata u cerebrokortikalnim nervnim terminalima pacova. EUR. J. Pharmacol. 2014, 734, 67-76. [CrossRef] [PubMed]

47. Tibbs, GR; Barrie, AP; van Mieghem, FJ; Mc-Mahon, HT; Nicholls, DG Ponavljajući akcijski potencijali u izolovanim nervnim terminalima u prisustvu 4-aminopiridina: efekti na oslobađanje Ca2 plus u citosolu i glutamata. J. Neurochem. 1989,53,1693-1699. [CrossRef] [PubMed]

49. Akerman, KE; Scott, LG; Heikkila, JE; Heinonen, E. Jonska ovisnost membranskog potencijala i odgovora povezanih s glutamatnim receptorom u sinaptoneurozomima mjereno cijaninskom bojom, DiSC2(5). J. Neurochem. 1987, 48, 552-559. [CrossRef] [PubMed]

50. Sihra, TS; Bogonez, E.; Nicholls, DG Localized Ca2 plus unos prvenstveno utiče na defosforilaciju proteina, fosforilaciju i oslobađanje glutamata. J. Biol. Chem. 1992, 267, 1983-1989. [PubMed]

50. Grynkiewicz, G.; Poenie, M.; Tsien, RY Nova generacija Ca2 plus indikatora sa znatno poboljšanim svojstvima fluorescencije. J. Biol. Chem. 1985, 260, 3440-3450. [PubMed]