Dio 2: Akteozid potiskuje osteoklastogenezu posredovanu RANKL inhibiranjem C-Fos indukcije i NF-KB puta i slabljenjem proizvodnje ROS-a
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*
Molimo kliknite ovdje nazad na 1. dio
ActeosideInhibira koštanu resorpciju makrofaga Akteozid je takođe sprečio resorpciju kostiju posredovanu RANKL na način koji zavisi od doze, što je mereno in vitro modelskim sistemom (slika 3A). Resorpcija kosti je značajno inhibirana kada su BMM inkubirani sa 1 mM akteozida (slika 3B). Tretman od 10 mM akteozida gotovo je potpuno oslabio formiranje rupica izazvano RANKL od strane BMM. Slično, akteozid je smanjio resorpciju kostiju u ćelijama RAW264.7 stimulisanim RANKL (slike S2A i B). Sposobnost akteozida da inhibira resorpciju kosti ovisila je o vremenu tretmana u odnosu na RANKL stimulaciju. Akteozid (10 mM) dodan 4 dana nakon RANKL stimulacije nije smanjio formiranje jamica u BMM, dok je potisnuo broj formiranih osteoklasta (slika 3C). Ovaj drugačiji rezultat djelomično je posljedica područja jame koja je već formirana nakon 4 dana formiranja RANKL stimulacije (slika 3D).
ActeosideNaniže-reguliše rane RANKL signalne puteve
RANKL inducira aktivaciju 3 dobro poznata MAPK i NF-kB u prekursorima osteoklasta, a ova aktivacija je potrebna za ranu diferencijaciju osteoklasta. Razumjeti moguće mehanizme pomoću kojihacteosideinhibira osteoklastogenezu, istraživali smo učinakacteosidena MAPK i aktivaciju NF-kB u makrofagima. BMM i RAW264.7 ćelije su prethodno tretirane sa 10 mM akteozida tokom 2 sata, a zatim stimulisane sa 100 ng/ml RANKL tokom 30 minuta. Fosforilacija MAPK je ispitana Western blotingom i imunometrijskom analizom. RANKL je inducirao fosforilaciju p38, ERK i JNK u BMM (slika 4A) i RAW264.7 ćelijama (slika 4B). Acteoside je spriječio ova RANKL-inducirana povećanja p-p38, p-ERK i p-JNK. Ovaj rezultat je potkrijepljen imunometrijskom analizom, prema kojoj je predtretman sa 10 mM akteozida značajno inhibirao nivoe fosforiliranih MAPK u ovim makrofagima (slika 4C). RANKL tretman je povećao DNK-vezivanje NF-kB, dok je akteozid inhibirao RANKL-indukovanu aktivaciju vezivanja NF-kB-DNK (slika 5A). Ova inhibicija je bila izraženija kod BMM nego kod ćelija RAW264.7. Akteozid je takođe smanjio RANKL-stimulisanu fosforilaciju p65 i IkBa u BMM i ćelijama RAW264.7 (slike 5B i C). Dodavanje 10 mM akteozida gotovo je potpuno inhibirao i razgradnju i aktivaciju IkBa u BMM (slika 5B). Da bi se dodatno potvrdilo da je aktivacija NF-kB uključena u djelovanje akteozida, konstrukti kB promotor-luciferaze su prolazno transficirani u RAW264.7 ćelije. Ćelije inkubirane sa 100 ng/ml RANKL imale su 3- puta veću aktivnost promotora kB, koja je bila značajno oslabljena 10 mM akteozida (slika 5D).
ActeosideSuzbija proizvodnju inflamatornih citokina i ekspresiju TNF-a, c-Fos i NFATc1 u RANKL-stimuliranim makrofagima TNF-a, IL-1b i IL-6 su važni u formiranju osteoklasta i funkcija, koja je posredovana NF-kB signalizacijom u RANKL-stimuliranim makrofagima. RANKL je stimulisao proizvodnju ovih citokina, a ova proizvodnja je značajno smanjena predtretmanom od 10 mM akteozida u BMM (slika 6A). Slično, akteozid je oslabio RANKL-indukovanu proizvodnju citokina, osim IL-6, u RAW264.7 makrofagima (slika S3). Da bismo razumjeli molekularne mehanizme djelovanja akteozida u osteoklastogenezi, dalje smo ispitali učinak akteozida na ekspresiju TNF-a, c-Fos i NFATc1. RANKL je regulisao ekspresiju mRNA ovih faktora u BMM i ćelijama RAW264.7 (slike 6B i C). Prethodni tretman sa 10 mM akteozida značajno je inhibirao ekspresiju ovih faktora izazvanu RANKL u oba
BMM i ćelije RAW264.7. Predtretman akteozidom je takođe snažno smanjio nivoe proteina c-Fos i NFATc1 u RANKL-stimulisanim BMM (slika 6D). Ovi rezultati sugeriraju da akteozid naniže reguliše RANKL indukujući medijatore formiranja osteoklasta na nivou gena i proteina.
CISTANCHE EKSTRAKT: AKTEOZID
Akteozid smanjuje unutarćelijsku generaciju ROS u BMM na način ovisan o dozi
Budući da je poznato da je intracelularna proizvodnja ROS u korelaciji s osteoklastogenezom stimuliranom RANKL-om, istražili smo da li akteozid inhibira proizvodnju ROS-a tijekom RANKL posredovane diferencijacije osteoklasta koristeći ćelijsko propusnu boju osjetljivu na oksidaciju, DCFH-DA. Analiza protočne citometrije pokazala je da je srednji signal fluorescencije specifičan za DCF u BMM bio očigledno pomaknut udesno nakon stimulacije sa RANKL, u poređenju sa netretiranim kontrolnim ćelijama (slika 7A). Ovaj pomak je bio sličan slučaju da su makrofagi RAW264.7 uočeni nakon RANKL stimulacije (podaci nisu prikazani). Tretiranje BMM akteozidom smanjilo je intenzitet signala DCF-a na način ovisan o dozi. Prethodni tretman sa 10 mM akteozida skoro je u potpunosti smanjio nivoe intracelularnog ROS proizvedenog tokom diferencijacije osteoklasta na netretirane kontrolne nivoe (slika 7B).
Oralna primjena akteozida inhibira promjenu biokemijskih markera osteoporoze i gubitak kostiju kod miševa sa jajnicima
Da bismo istražili učinak akteozida na gubitak koštane mase, pripremili smo životinjski model osteoporoze ovarijektomijom. Nije bilo značajne razlike u tjelesnoj težini između OVX i Sham miševa tokom eksperimentalnog perioda (podaci nisu prikazani). OVX grupa je imala značajno više serumske nivoe IL-1b i IL-6 od Sham grupe (slika 8). Povećanja ovih inflamatornih citokina izazvana ovarijektomijom su oslabljena oralnom primjenom akteozida (AC grupa). Nivoi markera koštanog obrta kao što su ALP, kalcij, TRAP5b i OC u serumu su značajno povećani u OVX grupi. Od ovih osteoporotskih markera, povećani nivoi kalcijuma, TRAP5b i OC kod OVX miševa su očigledno bili inhibirani tretmanom akteozida, dok nivo ALP u serumu nije promenjen tretmanom. Prosječno maksimalno opterećenje prijeloma do sredine desne femoralne osovine bilo je značajno niže u OVX grupi nego u Sham grupi (slika 9A). Tretman akteozidom podigao je maksimalnu frakturu na onu iz Sham grupe. Kada je kortikalna kost femura secirana i posmatrana optičkom mikroskopom, osteoporotske karakteristike prikazane u OVX grupi su skoro potpuno nestale kod AC miševa (slika 9B). Da bi se potvrdio učinak akteozida na model osteoporoze izazvane OVX, mikro-CT-om su analizirani BMD i koštani morfološki parametri u trabekularnom dijelu svijetlog proksimalnog femura. Kao što je prikazano na slici 9C, kod OVX miševa je pronađena promjena trabekularne arhitekture femura, dok je ova promjena smanjena tretmanom akteozidom. Rezultati mikro-CT analize otkrili su da je BMD, mjera čvrstoće kostiju, dramatično smanjen kod OVX miševa (slika 9D). U poređenju sa Sham grupom, OVX miševi su također pokazali značajne promjene u BV/TV, Tb. Sp i Tb. N, ali ne u Tb.Th. Oralno liječenje akteozidima OVX miševa značajno je spriječilo promjenu BMD-a, kao i BV/TV i Tb.N.
Akteozid ne utiče na osteoblastogenezu u ćelijama koštane srži
Uloga akteozida u osteoblastnoj diferencijaciji dalje je istražena korištenjem stanica koštane srži. Kao što je prikazano na slici 10A, tretman DAG-om je povećao broj ćelija obojenih alizarinom crvenom bojom i to nije promijenjeno predtretmanom od 10 mM akteozida. Količina prisutne boje ukazuje na to da kombinovani akteozid iDAG tretman nije promijenio mineralizaciju (slika 10B). Slično, DAG-indukovana povećanja intracelularnog sadržaja kalcijuma (slika 10C) i nivoa mRNA (slika 10D) markera specifičnih za kosti, kao što su Runx2, osterix, BSP i OC, nisu bila pod uticajem prettretmana akteozidom.
efekat cistanhe akteozida
Diskusija
Remodeliranje kosti je strogo regulirano ravnotežom između formiranja kosti od strane osteoblasta i resorpcije kosti od strane osteoklasta. Produžena i prekomjerna resorpcija kosti uzrokuje neravnotežu skeletnog prometa, što rezultira bolestima resorpcije kosti. Da bismo istražili efekte akteozida na osteoklastogenezu, koristili smo dva makrofaga, primarno kultivisane BMM i ćelije RAW264.7.
Ove ćelije su stimulisane sa RANKL da se diferenciraju u osteoklaste u prisustvu i odsustvu akteozida. Po prvi put smo pokazali da akteozid inhibira diferencijaciju i formiranje osteoklasta. Sam akteozid u ispitivanim koncentracijama nije doveo do smanjenja vitalnosti primarno kultivisanih makrofaga u uslovima rasta i diferencijacije.
Tretman akteozidom je također smanjio resorpcijsku aktivnost zrelih osteoklasta. Ovi rezultati sugeriraju da akteozid potiskuje formiranje osteoklasta iz makrofaga i aktivnost resorpcije osteoklasta. Rezultati našeg sistema kulture, koji nije uključivao osteoblaste ili stromalne ćelije, također sugeriraju da akteozid sprječava stvaranje osteoklasta direktnim djelovanjem na prekursore osteoklasta.
RANKL aktivira MAPK-ove uključujući p38, ERK i JNK. Ove tri kinaze su uključene u ranu osteoklastičku diferencijaciju i stoga njihova inhibicija farmakološki ili sa dominantno negativnom JNK transfekcijom potiskuje osteoklastogenezu izazvanu RANKL [29]. Naši rezultati su otkrili da predtretman akteozidom inhibira sve ove kinaze, što ukazuje na nespecifičnu regulaciju MAPK-a. Ovaj rezultat se djelimično razlikovao od prethodnog izvještaja da je EGCG, glavno protuupalno jedinjenje u zelenom čaju, posebno oslabio aktivaciju JNK bez utjecaja na aktivaciju ERK ili p38 u RANKL-stimuliranim BMM [7]. Paeonol, antiinflamatorno jedinjenje dobijeno iz kineske biljke, takođe je prijavljeno da inhibira ERK i p38, ali ne i JNK, fosforilaciju u ćelijama RAW264.7 stimulisanim RANKL [30]. Nasuprot tome, silibinin, novi inhibitor u kosti, oslabio je RANKL-indukovanu aktivaciju p38, ERK i JNK [31]. Ovi nalazi sugeriraju da efekti antiresorptivnih spojeva na MAPK aktivaciju od strane RANKL zavise od spoja, iako su sva tri MAPK uključena u ranu osteoklastogenezu.
Uzimajući u obzir zapažanje da je akteozid atenuirao p-JNK
nivoi u RANKL stimulisanim BMM, čak i na 1 mM, čini se da je blokada JNK, a ne p38 MAPK ili ERK specifičniji događaj u anti-osteoklastogenezi u ćelijama posredovanoj akteozidima. Iako akteozid u istoj koncentraciji nije smanjio broj osteoklasta u BMM, došlo je do značajnog smanjenja formiranja jamica tretmanom akteozida. Također smo otkrili da je predtretman SP600125, farmakološkim inhibitorom specifičnim za JNK, dramatično spriječio stvaranje osteoklasta (podaci nisu prikazani). Zajedno, ovi nalazi sugeriraju da je JNK-posredovana signalizacija usko povezana sa supresijom osteoklastogeneze posredovanom akteozidima koju stimulira RANKL.
NF-kB signalizacija reguliše ćelijske događaje, uključujući apoptozu, progresiju ćelijskog ciklusa, ćelijsku adheziju, proizvodnju citokina i preživljavanje u makrofagima [32]. NF-kB signalizacija je također potrebna za razvoj osteoklasta, što je pokazano pojavom osteopetroze kod NF-kB-nokaut miševa [33,34]. Stoga se predlaže da je inhibicija NF-kB efikasna meta za antiresorptivna sredstva za smanjenje aktivnosti osteoklasta i liječenje osteoporoze. Posttranslacijska modifikacija NF-kB potfamilije proteina je ključna u modulaciji aktivnosti NF-kB. Posebno, fosforilacija p65 podjedinice i IkB kinaze je kritična za NF-kB da indukuje osteoklastogenezu [7]. Naši sadašnji nalazi su pokazali da RANKL stimulacija povećava aktivnost vezivanja DNK NF-kB i fosforilaciju p65 podjedinice i IkBa u oba BMM i RAW264.7 ćelijama. Predtretman akteozidom je inhibirao ova povećanja izazvana RANKL, što je rezultiralo smanjenom aktivnošću NF-kB. Shodno tome, ovi rezultati sugeriraju da je, pored MAPK, NF-kB signalizacija glavna meta akteozida u inhibiciji diferencijacije i formiranja osteoklasta iz makrofaga stimuliranih RANKL.
Pored NF-kB signalizacije, c-Fos/c-Jun/NFATc1 put igra ključnu ulogu u razvoju osteoklasta, tako da nedostatak bilo kojeg od ovih proteina može zaustaviti osteoklastogenezu [35,36]. U ovoj studiji smo otkrili da akteozid sprečava ekspresiju c-Fos i NFATc1 izazvanu RANKL-om na nivoima mRNA i proteina. JNK je uzvodna kinaza c-Jun, koja je potrebna za ekspresiju NFATc1 i osteoklastogenezu kao odgovor na RANKL [29].
Blokiranje puta JNK/c-Jun sa junk inhibitorom smanjilo je formiranje osteoklasta izazvano RANKL i ekspresiju c-Fos i NFATc1 [7]. Naši rezultati i prethodni nalazi ukazuju na to da je inhibicija JNK posredovane signalizacije od strane akteozida usko povezana sa prevencijom RANKL posredovanog c-Fos i NFATc1ekspresija, koja potiskuje diferencijaciju osteoklasta u makrofagima. Razlike u efektima akteozida na ćelije BMM i RAW264.7 su barem delimično posledica razlika u osetljivosti na JNK inhibiciju.
TNF-a može inducirati osteoklastogenezu nezavisno od RANKL-RANK signalizacije [37]. IL-1 je moćan medijator patološke destrukcije kosti izazvane nedostatkom estrogena ili upalom [7]. Poremećaj tipa I IL-1 receptora ili IL-1 signalizacije može preokrenuti gubitak koštane mase izazvan ovariektomijom [38] ili reumatoidnim artritisom [39]. Ova studija je pokazala sposobnost akteozida da smanji proizvodnju upalnih citokina kao što su TNF-a, IL- 1b i IL-6 u makrofagima. Smatra se da akteozid inhibira proizvodnju inflamatornih citokina supresijom p38 kinaze i ERK signalizacije, jer je aktiviranje ERK1/2, p38 MAPK, ili oboje, potrebno za proizvodnju ovih citokina u makrofagima izazvanu lipopolisaharidom [40,41]. Luteolin, inflamatorno jedinjenje, takođe je prijavljeno da suzbija proizvodnju inflamatornih medijatora inhibiranjem aktivacije p38 MAPK [42]. U ovoj studiji smo također otkrili da je akteozid oslabio gubitak kosti kod miševa s ovariektomijom, što je dokazano obnovljenom maksimalnom snagom prijeloma na središnjem dijelu desne femura i nestankom osteoporotične kortikalne kosti. Oralna primjena akteozida smanjila je povećanje nivoa IL-1b i IL-6 u serumu izazvano ovariektomijom, ali ne i ALP. Povećani nivoi kalcijuma u serumu, TRAP i OC u OVX-u su također inhibirani oralnim tretmanom akteozidom, što sugerira da akteozid umanjuje promjenu biomarkera specifičnih za formiranje kosti, kao i resorpciju. Kako osteoporozu karakterizira smanjena gustina mase i pogoršana mikroarhitektura trabekularne kosti, gubitak trabekularne kosti izazvan OVX i promjena morfometrijskih parametara značajno su inhibirani oralnom primjenom akteozida. Ovi nalazi upućuju na to da se akteozid može koristiti kao antiresorptivni agens za liječenje osteoporoze poništavanjem neuravnotežene aktivacije osteoklasta. Međutim, osteoblasti su primarni faktor odgovoran za formiranje nove kosti. Stoga je potreban agens koji može povećati proliferaciju ili diferencijaciju osteoblasta za poboljšanje formiranja kosti [30]. Nasuprot tome, otkrili smo da akteozid nije utjecao na diferencijaciju ili mineralizaciju osteoblasta u stanicama koštane srži tretiranim DAG-om. Uzeti zajedno, naši rezultati sugeriraju da akteozid ima antiresorpcijski učinak, ali ne utiče direktno na formiranje kosti. Potrebni su detaljniji eksperimenti koji analiziraju parametre specifične za kost in vivo i in vitro da bi se razjasnilo da li akteozid koristi osteoblastogenezi ili ne.
Ova studija naglašava inhibitorni efekat akteozida na diferencijaciju osteoklasta i resorpciju kosti supresijom MAPK i nekoliko transkripcionih faktora kao što su NF-kB, c-Fos i NFATc1. Podaci ukazuju na dva moguća mehanizma pomoću kojih akteozid ima ove prednosti.
CISTANCHE ECHINACOSIDE I ACTEOSIDE MOGU LIJEČITI osteoporozu
Reference
1. RhoJ, Takami M, Choi Y (2004) Osteoimunologija: interakcije imunog i skeletnog sistema. Molekuli i ćelije 17: 1–9.
2. Del Fattore A, Capannolo M, Rucci N (2010) Kost i koštana srž: isti organ. Archives of Biochemistry Biophysics 503: 28–34.
3. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC (2011) Osteoporoza: sada i budućnost. Lancet 377: 1276–1287.
4. Sturge J, Caley MP, Waxman J (2011) Metastaze kostiju kod raka prostate: nove terapijske strategije. Nature Reviews Clinical Oncology 8: 357–368.
5. Goltzman D (2002) Otkrića, lijekovi i skeletni poremećaji. Nature Reviews Drug Discovery 1: 784–796.
6. Rodan GA, Martin TJ (2002) Terapijski pristupi bolestima kostiju. Science 289: 1508–1514.
7. Lee JH, Jin H, Shim HE, Kim HN, Ha H, et al. (2010) Epigalokatehin-3- galat inhibira osteoklastogenezu tako što smanjuje ekspresiju c-Fos i potiskuje signal nuklearnog faktora-kappaB. Molekularna farmakologija 77: 17–25.
8. Kim HN, Lee JH, Jin WJ, Ko S, Jung K, et al. (2012) MS-275, inhibitor benzamid histon deacetilaze, sprečava osteoklastogenezu smanjujući ekspresiju c-Fos i suzbija gubitak koštane mase kod miševa. European Journal of Pharmacology 691: 69–76.
9. Kim T, Ha H, Shim KS, Cho WK, Maj (2013) Anti-osteoporotski efekat Yijung-tanga u modelu štakora sa ovariektomijom posredovan inhibicijom diferencijacije osteoklasta. Časopis za etnofarmakologiju 146: 83–89.
10. Nakanishi A, Litsuka N, Tsukamoto J (2013) Riblje ulje potiskuje resorpciju kostiju inhibirajući osteoklastogenezu kroz smanjenu ekspresiju M-CSF, PU.1, MITF i RANK kod pacova sa ovarijektomijom. Izvještaji o molekularnoj medicini 7: 1896–1903.
11. Bar-Shavit Z (2007) Osteklast: osteoimuna ćelija sa više jezgara hematopoetskog porekla koja resorbuje kost. Journal of Cellular Biochemistry 102: 1130–1139.
12. Takahashi N, Maeda K, Ishihara A, Uehara S, Kobayashi Y (2011) Regulatorni mehanizam osteoklastogeneze putem RANKL i Wnt signala. Frontiers in Bioscience 16: 21–30.
