Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Molimo kliknite ovdje do 2. dijela

Cistanche ima veoma dobar neuroprotektivni efekat

Gabriel Gonzalez 1,2 , Jiˇrí Grz 1, Cosimo Walter D'Acunto 1, Petr Kaˇnovsk2 i Miroslav Strnad1,2,*

1. Laboratorija za regulatore rasta, Institut za eksperimentalnu botaniku Češke akademije nauka,

i Prirodno-matematički fakultet Univerziteta Palacký, Šlechtitel ˚u 27, CZ{1}} Olomouc, Češka Republika;

Gonzalez.gabriel@seznam.cz (GG); jiri.gruz@upol.cz (JG); waldacun@gmail.com (CWD)

2. Odjel za neurologiju, Univerzitetska bolnica Olomouc i Medicinsko-stomatološki fakultet,

Palacký Univerzitet Olomouc, CZ{0}} Olomouc, Češka Republika; Petr.Kanovsky@fnol.cz

* Prepiska: miroslav.strnad@upol.cz; Tel.: plus 420-585-634-850

Abstract: Citokininisu fitohormoni na bazi adenina koji reguliraju ključne procese u biljkama, kao što su dioba i diferencijacija stanica, rast korijena i izdanaka, apikalna dominacija, grananje i klijanje sjemena. U preliminarnim studijama pokazali su i zaštitne aktivnosti protiv neurodegenerativnih bolesti ljudi. Kako bismo proširili znanje o zaštiti (zaštitnoj djelatnosti) koju oni nude, istražili smo aktivnosti prirodecitokininiprotiv toksičnosti izazvane salsolinolom (SAL) (aParkinsonova bolestmodel) i smrt izazvana glutamatom (Glu).neuron-kao dopaminergičke SH-SY5Y ćelije. Otkrili smo da su kinetin{3}}glukozid, cis-zeatin ribozid i N6-izopentenil adenozin bili aktivni u SAL-induciranom PD modelu. Osim toga, trans-, cis-zeatin i kinetin zajedno sa kelatorom željeza deferoksaminom (DFO) i inhibitorom nekroptoze nekrostatinom 1 (NEC-1) značajno su smanjili stope ćelijske smrti u Glu-induciranom modelu. Analiza laktat dehidrogenaze otkrila je dacitokininipredviđeno niženeuroprotektivniaktivnost od DFO i NEC-1. Štaviše, slabije su smanjili aktivnosti apoptotičke kaspaze-3/7 od DFO. Međutim, thecitokininiimao vrlo slične efekte kao DFO i NEC-1 na proizvodnju superoksidnih radikala. Sve u svemu, pokazali su zaštitnu aktivnost u SAL-induciranom modeluparkinsonovacneuronskistanične smrti i Glu-induciranog modela oksidativnog oštećenja uglavnom smanjenjem oksidativnog stresa.

Ključne riječi: citokinin; fitohormon; neuroprotekcija; SH-SY5Y ćelije nalik neuronima; citotoksičnost; salsolinol; glutamat; oksidativni stres; Parkinsonova bolest

cistanche planto efektima naNeuroprotection

1. Uvod

Parkinsonova bolest(PD) je druga najčešća neurodegenerativna bolest povezana s motorikom, a očekuje se da će broj globalno dijagnosticiranih slučajeva porasti sa 6 miliona u 2015. na više od 12 miliona do 2040. godine [1]. Karakteriziraju ga motorički simptomi povezani sa specifičnom degeneracijom i gubitkom približno 30-70 posto dopaminergičkog (DA)neuronau substantia nigra pars compacta i njihovim projekcijama na striatum [2,3]. Neki od mnogih poznatih molekularnih obilježja PD uključuju pojačani oksidativni i nitrozativni stres, mitohondrijalnu disfunkciju [4–7], ekscitotoksičnost [8], disfunkciju ubikvitin/proteazomalnog sistema [9] i neuroinflamaciju [10]. Trenutni tretmani imaju različite štetne nuspojave i nude samo simptomatsko olakšanje [11], tako da postoje intenzivni napori da se razviju lijekovi s efikasnim kurativnim efektima na degenerirajuću DA.neurona. Resursi koji mogu pomoći takvim naporima uključuju prirodna jedinjenja koja obično imaju manje nuspojava. Između ostalog, supstance iz Ginkgo bilobe (ginkgetin, ginkolid, bilobalid), ginsenga (ginsenozidi) i flavonoida (baicalein, kempferol, rutin i luteolin) pokazale su široku zaštitnu aktivnost u nekoliko in vitro modela (uključujući ćelijsku liniju humanog neuroblastoma SH -SY5Y) i in vivo modeli PD izazvanog 1,1'-dimetil-4,4'-bipiridinijum dikloridom (parakvat), 1-metil- 4-fenil-1, 2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP), 1-metil-4-fenilpiridinijum (MPP plus ) i 6-hidroksidopamin (6-OHDA) [12].

Ovdje predstavljena studija fokusirala se na efekte klase prirodnih fitohormona tzvcitokinini(CK) i njihovi metaboliti, koji su dobro poznati regulatori stanične diobe, rasta, diferencijacije i starenja listova u biljkama [13]. Strukturno, CK su derivati ​​adenina koji su supstituisani na poziciji N6- sa prenilom (izopentenil) ili aromatičnim bočnim lancem. Prirodni oblici uključuju 6-(E)-4-hidroksi-3-metil ali-2-enilaminopurin (transzeatin, tZ), njegov 6-(Z)-izomer ( cis-zeatin, cZ), N6-izopentenil adenin (iP), 6-benzil amino purin (BAP), 6-furfurilaminopurin (kinetin, K) i orto-, meta-, i para-hidroksilovane ili metoksilirane derivate BAP-a, nazvane topolini (oT, mT, pT, MeoT, MemT, MepT). Različiti 9-ribozidi, 9-nukleotidi, kao i 7-, 9 i O-glukozidi ovih oblika takođe se često javljaju, kao što je prikazano u Tabeli 1. Pored njihove prirodne uloge u biljke, CK su pokazale moćnu ant-oksidativnu aktivnost prema reaktivnim vrstama kiseonika (ROS) koje pružaju zaštitu u nekoliko in vitro modela stresa poremećaja povezanih sa starenjem [14].

Tabela 1. Strukturecitokininii agensi pozitivne kontrole.

Konkretno, CK navodno imaju citoprotektivnu aktivnost u modelima kao što su H2O2- indukovana ćelijska smrt ljudskih fibroblasta [15] i glikoksidativni stres izazvan D-galaktozom u astrocitima štakora [16]. Što je još važnije, u ovom kontekstu, pokazali suneuroprotektivniefekti u modelima vezanim za neurodegenerativne bolesti kao što su porodična PD, MG 132-indukovana ili H2O2- toksičnost izazvana inhibitorom proteasoma u SH-SY5Y ćelijama [17], Glu-indukovano oksidativno oštećenje hipokampusa miša HT22neuronskićelije [18], i PC12 ćelijski model Huntingtonove bolesti [19]. Druge studije pokazuju da zaštitne aktivnosti CK uključuju i direktnu [20,21] i indirektnu [15,16,22] modulaciju ćelijskih redoks sistema. Pored karakterističnih antioksidativnih aktivnosti CKs, oni navodno imaju regulatorne efekte u mitohondrijima koji pojačavajuneuronskiodrživost [17]. Štaviše, K može stabilizirati potencijal mitohondrijalne membrane i povećati proizvodnju ATP-a, čime se ublažava glu-indukovana smrt HT22 ćelija [18]. Međutim, uprkos nalazima u vezi sa njihovim efektima u nekoliko modela, postoji ograničeno znanje o zaštitnoj aktivnosti CK u najčešćem (sporadičnom) obliku PD.

Kako bismo riješili gore opisani jaz u znanju, sistematski smo evaluirali efekte prirodnih CK i njihovih metabolita u dva in vitro modela: model PD izazvan salsolinolom (SAL) i model oksidativnog oštećenja izazvanog glutamatom (Glu)neuron-kao SH-SY5Y ćelije. Ova linija je korištena zbog svog dopaminergičkog fenotipa, osjetljivosti na dopaminergičke toksine kao što je SAL i pogodnog formiranja relativno stabilnih populacija diferenciranihneuronskićelije sa smanjenom stopom proliferacije nakon 48 h izloženosti 10 uM all-trans retinojskoj kiselini (ATRA) [23–25].

Neuronstanice slične su bile izložene endo/egzotoksin SAL-u kako bi oponašale PD patologiju preko disfunkcije ćelijskog redoks sistema: iscrpljivanje glutationa (GSH) i inhibicija aktivnosti enzima antioksidansa (Cu/Zn superoksid dismutaza i katalaza) i mitohondrijalnih kompleksa (I i II), što dovodi do apoptoze i nekroze [26]. U drugom modelu, Glu izaziva potencijalno smrtonosna oksidativna oštećenja narušavanjem redoks sistema. Oba modela u ćelijskoj liniji SH-SY5Y su prethodno korišćena u studijama neuroprotekcije [26,27].

Citoprotektivne i/ili antioksidativne aktivnosti povezane s degenerativnim poremećajima K, iP, BAP, iPR, tZR i njihovih slobodnih baza su testirane i (kao što je gore navedeno) utvrđeno je da neki CK imaju zaštitne aktivnosti uneuronskićelije. Međutim, nijedna ranije objavljena studija nije ispitala strukturu-neuroprotektivniodnos aktivnosti (SAR) prirodnih CK (tabela 1). Stoga je ova studija poduzeta radi ispitivanjaneuroprotektivni(protiv-parkinsonovac) aktivnosti gotovo svih poznatih prirodnih CK u odabranim SAL- i Glu-indukovanim modelima neurodegeneracije. Prvo smo procijenili kapacitet apsorpcije kisikovih radikala (ORAC) i (u sigurnosnim testovima) citotoksičnost svakog od CKs-ova.neuron-kao SH-SY5Y ćelije. Zatim smo procijenili neuroprotektivne efekte jedinjenja i utjecaj na nivoe oksidativnog stresa mjerenjem proizvodnje superoksida (O2.) (dihidroetidij, DHE test) i aktivnosti apoptotičke kaspaze-3,7. Rezultati pružaju prve prijavljene sistematske indikacije odnosa između prirodnih struktura CK ineuroprotektivniaktivnosti.

Cistanche herbaima veoma dobarneuroprotektivniefekat

2. Rezultati i diskusija

2.1. Kapacitet apsorpcije radikala kisika citokinina (ORAC)

Kako su neurodegenerativne bolesti povezane s povišenim oksidativnim stresom, antioksidativna aktivnost igra ključnu ulogu u odbranineuronskićelije. Za procjenu biološkog potencijala CKs u ovom pogledu, antioksidativni kapacitet je određen pomoću ORAC-a, koji se obično koristi za određivanje antioksidativnog kapaciteta supstanci [28]. Antioksidativni kapacitet izražen je kao Trolox ekvivalenti (TE), što određuje efikasnost (niže do veće) jedinjenja od Troloxa na ekvimolarnoj osnovi. Rezultati, predstavljeni u Tabeli 1, pokazuju da topolini (oT, mT i pT) i njihovi ribozidi (oTR, mTR, pTR) imaju visoke antioksidativne aktivnosti, koje su vjerovatno usko povezane sa elektronima bogatim sistemom njihovog C{{ 3}}hidroksi benzil amino supstituent. Uprkos visokim ORAC vrijednostima, topolini nisu imali visokeneuroprotektivniaktivnost. Međutim, nekoliko heteroaromatičnih CK uključujući K (N6-furfurilaminopurin) i nearomatski cis-zeatin-O-glukozid (cZOG), koji ima 4-hidroksi-3-metilbut{{7} }en-1-il)amino supstituent, takođe je pokazao visok antioksidativni kapacitet (Tabela 2). Ostali CK metaboliti—uključujući kinetin{10}}glukozid (K3G), kinetin ribozid 5<-monophosphate (kmp),="" kinetin-9-glucoside="" (k9g),="" and="" trans-zeatin=""><- monophosphate="" (tzmp)—had="" moderate="" antioxidant="" activity.="" all="" the="" others="" had="" detectable="" capacity="" except="" bap.="" these="" results="" confirm="" previous="" findings="" that="" ip,="" pt,="" k="" can="" act="" as="" direct="" radical="" scavengers,="" but="" conflict="" with="" the="" previously="" reported="" activity="" of="" bap="" in="" the="" orac="" test="" [20,21].="" to="" conclude,="" these="" compounds="" have="" potential="" in="" the="" treatment="" of="" neurodegenerative="" diseases="" associated="" with="" increased="" oxidative="" stress="">

prednosti cistanche stabljikeonprotiv Alchajmerove bolesti

2.2. Diferencijacija SH-SY5Y ćelija

za proučavanje CKs'neuroprotektivniefekte, ćelije neuroblastoma SH-SY5Y (odabrane iz razloga koji su već opisani [23]) su diferencirani izlaganjem 10 uM ATRA tokom 48 sati kao što je prethodno opisano [23,24]. Zatim su obojene pomoću kompleta za bojenje membrane kako bi se ispitale morfološke razlike između nediferenciranih i diferenciranih stanica. Kao što je prikazano na slici 1A,neuron-like diferencirane ćelije rasle su manje gusto, bile su duže i proizvodile više neurita (označeno žutim strelicama na slici) od nediferenciranih ćelija. Ove morfološke promjene povezane s diferencijacijom su prethodno uočene, čak i nakon kraćeg izlaganja (24 h) ATRA [24,30]. Što je još važnije, broj neurita dramatično raste do nivoa kada mogu stvoriti neurinsku mrežu. Iz tog razloga, mjerena je vitalnost ćelija kako bi se uporedila stopa proliferacije nediferenciranih i diferenciranih SH-SY5Y ćelija. Vijabilnost nediferenciranog SH-SY5Y uzeta je kao maksimalna stopa proliferacije. Rezultati prisutni u

Slika 1B pokazuje da je stopa proliferacije (procijenjena Calcein AM testom održivosti) SH-SY5Y smanjena za 23 posto nakon 48 h ATRA tretmana.

Slika 1. (A) Fluorescentne mikrofotografije SH-SY5Y ćelija sa membranama obojenim pomoću kompleta za izrastanje Neurita (Invitrogen™): Kontrolne, nediferencirane ćelije (izložene lažnom rastvoru za tretman:<0.1% dmso);="" cells="" differentiated="" by="" exposure="" to="" 10="" um="" all-trans="" retinoic="" acid="" (atra)="" for="" 48="" h.="" bars="50" um.="" (b)="" proliferation="" rates="" of="" undifferentiated="" and="" differentiated="" sh-sy5y="" cells:="" numbers="" of="" viable="" cells="" after="" 48="" h="" exposure="" to=""><0.1% dmso="" and="" 10="" um="" atra,="" respectively.="" data="" were="" obtained="" from="" five="" independent="" experiments="" with="" triplicate="" cultures:="" asterisks="" show="" the="" significance="" of="" differences="" in="" numbers="" of="" viable="" cells="" (as="" percentages="" of="" numbers="" of="" undifferentiated="" cells)="" between="" the="" cultures:="" *="" p="" <="">

Tabela 2. Kapacitet apsorpcije kisikovih radikala (ORAC) testiranihcitokinini(CKs) izraženi kao Trolox ekvivalenti (TE) na ekvimolarnoj osnovi. Nazivi, skraćenice i strukture CK-a prikazani su na slici 1.

2.3. Citotoksičnost citokinina prema SH-SY5Y ćelijama sličnim neuronima

U testovima potencijalne citotoksičnosti CKs pomoću Calcein AM testa održivosti [31] većina je pokazala nisku toksičnost premaneuron-kao SH-SY5Y ćelije. Smanjenje vitalnosti ispod 90 posto smatrano je pragom za neurotoksični učinak. Jedina dva izuzetka su KR (11,9 posto) i pTR (10,5 posto), u skladu s ranijim nalazima da su nekicitokininmetaboliti, posebno ribozidi, mogu imati citotoksične efekte [32]. Ostali ribozidi, kao što su cZR, iPR, oTR, mTR, nisu izazvali očigledno smanjenjeneuronVijabilnost ćelija poput SH-SY5Y (tabela 3). DFO [33,34] i NEC-1 [35,36] korišćeni kao pozitivne kontrole u našem in vitro modelu su takođe dokazale druge studije na SH-SY5Y ćelijama da nisu toksični. U zaključku, uglavnom derivati ​​KR i pTR pokazali su nižu održivost od 90 posto i stoga su smatrani manje zanimljivim za dalju evaluaciju u oba in vitro modela neurodegeneracije.

Tabela 3. Vijabilnost ćelijaneuron-kao SH-SY5Y ćelije nakon izlaganjacitokininiza 24 h. Viabilnost se izražava kao procenat DMSO kontrole.

2.4. Identifikacija neuroprotektivnih citokinina u SAL-induciranom modelu PD

Za ove testove,neuronskiSH-SY5Y ćelije su diferencirane tokom 48 sati, a zatim su tretirane sa 500 uM SAL-a i svakim CK u tri koncentracije (0,1, 1, 10 uM). Kao što je prikazano isprekidanom linijom na slici 2A, primjena neurotoksina SAL na 500 uM smanjila je održivost diferenciranih SH-SY5Y ćelija, prema Calcein AM testu, za 30 posto. N-acetilcistein (NAC) je korišćen kao pozitivna kontrola u ovim testovima zbog njegovog prethodno prijavljenog neuroprotektivnog efekta u istom in vitro modelu zasnovanom na SH-SY5Y ćelijama [37]. Koncentracije od 10, 100 i 1000 uM NAC korištene su za induciranje djelomičnog ili gotovo potpunog oporavka u SAL modelu. NAC je bio u stanju da poveća vitalnost ćelija pri koncentraciji od 100 uM i 1 mM, što odgovara 83,39 ± 1,74 posto i 89,21 ± 2,89 posto, respektivno. Zaštitna aktivnost NAC-a na 100 uM (označena isprekidanom linijom na slici 2A) korištena je kao prag potencije za odabir CK za dalje testove. Prema ovoj postavci, biološki značajne neurozaštitne aktivnosti uočene su kod K3G pri 10 uM (81,84 ± 2,36 posto), cZR pri 0,1 uM (81,14 ± 2,30 posto) i 1 uM (81,53 posto ± ) i iPR. uM (82,43 ± 2,51 posto). Dakle, iPR i cZR su bili efikasni neuroprotektori pri nižim mikro ili submikromolarnim koncentracijama od NAC. Thecitokininskrining je također otkrio da mnogi drugi metaboliti mogu umjereno povećati vitalnost diferenciranih SH-SY5Y ćelija izloženih SAL-u. Međutim, neki testirani CK (uključujući tZR, tZMP, mT, mTR, pT i pTR) imali su vrlo mali zaštitni učinak.

Slika 2. (A)Neuroprotektivnoaktivnost odcitokininii N-acetilcistein (NAC) u SAL-induciranom modelu PD naneuron-kao SH-SY5Y ćelije. Isprekidana linija prikazuje prag NAC efekta na kojemcitokininiodabrani su za dalje testiranje; isprekidana linija zatim broji broj živih ćelija u Calcein AM testu nakon tretiranja ćelija sa 500 uM SAL; zdrave kontrolne ćelije (CTR, DMSO < 0,1="" posto).="" trostruki="" primjerak="" u="" najmanje="" tri="" odvojena="" dana.="" (b)="" normalizovana="" smrt="" ćelije="" sh-sy5y="" nakon="" bojenja="" propidijum="" jodidom.="" trostruki="" primjerak="" u="" najmanje="" pet="" nezavisnih="" dana.="" *="" p="" u="" poređenju="" sa="" vozilom="" sa="" 500="" um="" sal,="" #="" p="" u="" poređenju="" sa="" vozilom="" bez="" 500="" um="">

Da bi se potvrdilo, najaktivnije prirodne CKs anti-PD aktivnosti, ukupne stope ćelijske smrti su kvantifikovane bojenjem propidijum jodidom (PI), koje (za razliku od testova održivosti zasnovanih na ćelijskom metabolizmu) označava samo ćelije sa oštećenim integritetom membrane, umiruće ćelije i već mrtve ćelije [38]. Rezultati su normalizovani u odnosu na stopu ćelijske smrti nakon tretmana samo SAL-om (postavljeno kao 100 posto). Kao što je prikazano na slici 2B, NAC pozitivna kontrolna supstanca značajno je smanjila stope ćelijske smrti i pri 100 i 1000 uM (na 77,3 ± 2,21 posto i 77,5 ± 4,44 posto, respektivno). Sve u svemu, NAC se pokazao kao aneuroprotektivniagens sa uporedivim aktivnostima sa onima zabilježenim u drugim studijama na način ovisan o dozi (u rasponu 50–500 uM) za ćelije SH-SY5Y [37]. PI test je također pokazao da CKs cZR, K3G i iPR imaju zaštitne aktivnosti, posebno cZR, koji je smanjio stopu ćelijske smrti na 71,6 ± 5,08 posto pri 0,1 uM. Za razliku od cZR, K3G je imao obrnute efekte zavisne od doze, sa maksimalnom aktivnošću na 10 uM (smanjenje stope ćelijske smrti na 75,0 ± 3,69 posto), a aktivnost NPR-a dostigla je vrhunac na 1 uM (smanjenje stope na 73,9 ± 4,99 posto). Uzeti zajedno, kao što je prikazano na slici 2, CK-ovi su dali uporedivineuroprotektivniaktivnost do 100 uM NAC prema testovima održivosti i citotoksičnosti. Štaviše, efektivne koncentracije CK kao što su cZR i iPR bile su mnogo niže od onih NAC-a, u submikromolarnim i mikromolarnim rasponima. Prethodna zapažanja dobijena nakon dvostrukog bojenja s PI i aneksinom V/PI ukazuju da K može smanjiti apoptozu [39], stoga smo također istraživali efekte CKs i NAC na oksidativni stres i aktivaciju kaspaze-3,7 (dobro poznati marker apoptoze).

2.5. Citokinini smanjuju SAL-indukovano formiranje superoksidnih radikala

Oksidativni stres (OS) je ključni patološki faktor koji doprinosi nekoliko neurodegenerativnih bolesti, a i SAL (na > 100 uM) i tetrahidroizohinolini su snažni induktori OS [26,40]. Stoga smo također mjerili formiranje superoksida (ROS i važan OS marker) u prisustvu SAL sa i bez odabranih CK ili NAC. Kako bi se osiguralo da je SAL uzrokovao dovoljno oštećenja OS u SH-SY5Y ćelijama da bi se otkrili odgovori, ćelije su bile izložene 500 uM SAL-a tokom 24 h, kao u prethodnom radu [37] iu skladu sa nalazima predstavljenim gore. Ćelije su zatim obojene dihidroetidijem (DHE) kako bi se otkrilo stvaranje superoksidnih radikala [41,42]. Kao što se može vidjeti na slici 3A, ćelije su vizualno promatrane nakon obilježavanja sa DHE (koji daje signale crvene fluorescencije nakon reakcije sa superoksidom). SAL je izazvao jasan porast fluorescencije DHE, u odnosu na nivoe u kontrolnim i NAC-tretiranim ćelijama. Štaviše, tri CK (cZR, K3G i iPR) imala su slične vizuelne efekte kao NAC (100 uM) na DHE fluorescenciju. Nadalje, spektrofotometrijska kvantifikacija u odnosu na nivoe otkrivene u ćelijama tretiranim samo SAL-om (podešeno kao 100 posto), bila je u skladu sa mikroskopskim posmatranjem. Kao što je prikazano na slici 3B, normalizovani nivo superoksida u zdravim kontrolnim ćelijama (CTR) bio je manji od 39 procenata, a pozitivna kontrolna supstanca NAC obezbedila je umereno do potpuno smanjenje proizvodnje ROS izazvane SAL na 100 i 1000 uM (na 76,3). ± 4,33 i 44,3 ± 5,12 posto), što sugerira da osiromašenje glutationa (GSH) igra ključnu ulogu u modelu [26]. Zanimljivo je da je SAL izazvao dramatično smanjenje sadržaja GSH u SH-SY5Y ćelijama praćeno povišenjem OS, na nivoe slične onima koji su prethodno uočeni u studiji koja je također zabilježila NAC-posredovane efekte na vitalnost ćelije, smrt ćelije i sadržaj glutationa [43] . Ovdje predstavljeni rezultati pokazuju da je NAC također smanjio formiranje superoksidnih radikala na bazalne nivoe (tj. nivoe u kontrolama tretiranim DMSO). CK ribozidi su testirani u aktivnim koncentracijama (0,1-1 uM) zajedno sa K3G i značajno su smanjili sadržaj superoksidnih radikala u ćelijama na sledeće nivoe (u odnosu na ćelije tretirane samo SAL-om): cZR 80,34 ± 5,99 procenata na 0,1 uM ; K3G 77,1 ± 4,89 posto na 10 uM; iPR 79,2 ± 5,91 posto na 1 uM, uporedivo sa efektima 100 uM NAC. Zajedno, ortogonalne demonstracije snažno ukazuju na to da moćna anti-OS aktivnost igra ključnu ulogu u zaštitnim efektima NAC i CKs u SAL-induciranom PD modelu. Korelaciju između poboljšanja OS i neuroprotekcije također su primijetili drugi autori [29], a nekoliko studija je otkrilo da K i BAP mogu direktno poboljšati OS aktivnosti [44] kroz formiranje kompleksa sa Cu2 plus jonima, što rezultira superoksid dismutazom- slična aktivnost [45,46]. Međutim, CK su također opisani kao indirektni antioksidansi s efektima posredovanim indukcijom antioksidativnog odgovora (iPR) s nuklearnim faktorom 2-povezanog s faktorom 2 (NRF2) [22] ili djelomičnim obnavljanjem aktivnosti glutation peroksidaze i SOD ( K) [16]. Osim toga, K navodno imaneuroprotektivniaktivnosti protiv oštećenja OS izazvanih H2O2 u SH-SY5Y ćelijama [17]. Obje vrste prijavljene anti-ROS aktivnosti CK mogu potencijalno objasniti efekte cZR, K3G i iPR u redukciji superoksidnih radikala u SAL-induciranom SH-SY5Y ćelijskom PD modelu [47–50].

Slika 3. (A) Mikrofotografije koje prikazuju oksidativni stres izazvan SAL-om i aktivnosti smanjenja oksidativnog stresacitokininikod ljudi diferenciranneuron- ćelije poput SH-SY5Y vizualizirane fluorescentnom mikroskopijom nakon obilježavanja dihidroetidijem (DHE). Barovi=50 um. Slike pokazuju ćelije tretirane rastvorom DMSO (kontrole), samo 500 uM salsolinola (SAL) i kombinacije 500 uM SAL i 1000 uM NAC ( plus NAC), 0,1 uM cZR ( plus cZR); 10 uM K3G ( plus K3G), 1 uM iPR ( plus iPR) 24 h prije bojenja sa DHE. (B) SAL-indukovano stvaranje superoksidnih radikala icitokininili zaštitna aktivnost N-acetilcisteina (NAC). Grafikon prikazuje kvantifikaciju ćelija obojenih DHE pomoću Infinite M200 Pro čitača mikroploča (Tecan, Austrija). Trostruki primjerak u najmanje pet nezavisnih dana. * P u poređenju sa vozilom sa 500 uM SAL, # P u poređenju sa vozilom bez 500 uM SAL.