Dio 1:Verbaskozid štiti ćelije pankreasa od ER-stresa

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Alessandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 i Carla Perego 1,*

sažetak:

Značajni epidemiološki dokazi ukazuju da ishrana bogata polifenolima štiti od razvoja dijabetesa tipa 2. Feniletanoid glikozidverbaskozid/akteozid, široko rasprostranjeno polifenolno biljno jedinjenje, ima nekoliko bioloških svojstava uključujući snažne antioksidativne, antiinflamatorne i neuroprotektivne aktivnosti. Cilj ovog istraživanja bio je ispitati moguće efekteverbascosidena ćelijama pankreasa, meta nikad ranije testirana. Mišje i ljudske ćelije su inkubirane saverbascoside(0.8–16 uM) do pet dana, a kombinacija biohemijskih tehnika i tehnika snimanja korištena je za procjenu preživljavanja i funkcije ćelija u normalnim ili endoplazmatskim retikulumom (ER) uslovima koji izazivaju stres. Pronašli smo zaštitni efekat ovisan o doziverbascosideprotiv oksidativnog stresa u klonskim i ljudskim stanicama. Mehanističke studije su otkrile da polifenol štiti ćelije od disfunkcija posredovanih ER-stresom, modulirajući aktivaciju protein kinaze RNA-like endoplazmatske retikulum kinaze (PERK) grane nesavijenog proteinskog odgovora i promovirajući mitohondrijalnu dinamiku. Kao rezultat, u ovim stanicama je otkrivena povećana vitalnost, mitohondrijalna funkcija i sadržaj inzulina. Ove studije pružaju dokaze daverbascosidepojačava sposobnost -ćelija da se nose sa ER-stresom, što je važan faktor koji doprinosi disfunkciji i neuspjehu -ćelija u dijabetičkim stanjima i podržava terapeutski potencijal verbaskozida kod dijabetesa.

Ključne riječi:

verbascoside; polifenoli; ćelije koje proizvode insulin; dijabetes; UPR; oksidativni stres; ER-stres; PERK; protuupalno; mitohondrije

1. Uvod

Dijabetes je hronični poremećaj koji pogađa stotine miliona ljudi [1]. Dijabetes tipa 1 (T1D) i dijabetesa tipa 2 (T2D) karakterizira različita etiologija, oba karakteriziraju nedostatak inzulina [2]. Inzulin regulira koncentraciju glukoze u plazmi stimulirajući unos glukoze u mišićne i masne stanice i modulirajući metabolizam glukoze u jetri. Dostupnost nutrijenata, hormoni i neuralni inputi reguliraju lučenje inzulina pankreasa i održavaju koncentraciju glukoze u krvi unutar fiziološkog raspona [3-5]. Stoga disfunkcija -ćelija dovodi do dijabetesa koji karakterizira hiperglikemija natašte.

T2D je progresivno stanje u kojem su inzulinska rezistencija i nefunkcionalnosti -ćelija međusobno povezane, a nedavni dokazi su podigli interes za kritičnu primarnu ulogu -ćelija u hiperglikemijskom statusu [6,7]. U gojaznih subjekata bez dijabetesa -ćelije kompenziraju inzulinsku rezistenciju povećanim lučenjem hormona. Međutim, kod nekih ispitanika, kako se njihovo stanje pogoršava, insulinemija opada i nivo glukoze se penje do hiperglikemije [8,9].

Glukoza je najvažniji modulator funkcija stanica. Stimulacija glukozom utiče na regulaciju gena i ekspresiju proteina uključenih u mnoge ćelijske funkcije kao što su glikoliza, sinteza inzulina i sekrecija [10]. Lučenje insulina izazvano glukozom oslanja se na oksidativni metabolizam za proizvodnju adenozin trifosfata (ATP), a fiziološki se proizvodi nizak nivo reaktivnih vrsta kiseonika (ROS). Međutim, -ćelije nisu baš dobro opremljene enzimima čistača i ova slabost ih čini veoma podložnim oksidativnom stresu [11,12]. Kako se oksidativni stres penje – proizvodnja inzulina u stanicama opada, a stanice proizvode citokine koji zapaljuju oštećenje stanica kroz upalu i apoptozu [13]. Zanimljivo, iako se smanjena ćelijska masa ranije pripisivala ćelijskoj smrti, nedavne studije ukazuju na glavnu ulogu dediferencijacije ćelija [14,15]. Postalo je jasno da nekoliko faza vodi do T2D. Metabolički i oksidativni inzulti uzrokuju stres endoplazmatskog retikuluma (ER) koji dovodi do opadanja sinteze i sekrecije inzulina, upalni procesi prate oslobađanje citokina i - može doći do gubitka ćelija apoptozom i dediferencijacijom. Ovo znanje je fundamentalno kako bi se razvile odgovarajuće strategije liječenja, budući da se oksidativni stres i upala mogu suprotstaviti, a plastičnost stanica pankreasa omogućava mogućnost vraćanja matičnih stanica u -ćelije, što je dokazano kod miševa [16].

Nedavno je ranjivost -ćelija na oksidativni stres uspješno potaknula upotrebu dijetetskih antioksidansa za prevenciju dijabetesa [17]. Među najzanimljivijim antioksidansima, maslinovo ulje je poznato po svojim blagotvornim svojstvima još od starih Grka. Maslinovo ulje sadrži dobru količinu mono-nezasićenih masnih kiselina (MUFA) i nekoliko polifenola kao što su tirozol, hidroksitirosol, oleuropein i verbaskozid.

Verbascoside, također poznat kao akteozid, je feniletanoidni glikozid ekstrahiran iz Olea europea, biljaka vrste Verbascum i 23 druge biljne porodice [18–20]. Može se dobiti i od nusproizvoda maslinovog ulja (obogaćen je otpadnom vodom mlinova maslina dobivenom preradom plodova masline) ili se proizvodi metaboličkim inženjeringom i pristupima sintetičke biologije [21].

Još uvijek nisu prijavljeni podaci o bioraspoloživosti verbaskozida kod ljudi. Studije sprovedene na miševima, SKBR3 i Caco{1}} ćelijama sugerišu da je moguće da nemetabolizovani verbaskozid pređe crevnu barijeru, cirkuliše u krvnoj plazmi i ispoljava antioksidativne efekte [20,22,23]. Za razliku od većine biljnih polifenola, verbaskozid uglavnom deluje na ćelije kroz modulaciju transkripcije gena raznih enzima i regulatornih faktora, sa antioksidativnim i antiinflamatornim efektima [24–30].

Iako su poznati mnogi korisni efekti verbaskozida na ljudsko zdravlje, nema podataka o njegovom djelovanju na stanice gušterače. Budući da su oksidativni stres i upala u osnovi patogeneze T2D, istražili smo može li liječenje verbaskozidom poboljšati vitalnost stanica i

funkcionišu u uslovima koji izazivaju ER-stres i okarakterisani su molekularni mehanizmi njegovog delovanja. Naši podaci otkrivaju da verbaskozid sprječava oksidativni stres i upalu stanica, modulirajući aktivaciju nesavijenog proteinskog odgovora i promovirajući mitohondrijalnu dinamiku, što rezultira povećanom vitalnošću stanica i sadržajem inzulina.

2. Materijali i metode

2.1. Kultura ćelija i materijali

Mišje tc3 ćelije (ljubazno dostavljene od prof. Hanahan-Odjel za biohemiju i biofiziku, Univerzitet Kalifornije, San Francisco, CA [31]) su uzgajane u mediju RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Italija) sa dodatkom 10 posto (v/v) fetalnog telećeg seruma inaktiviranog toplinom (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Italija), 1 posto (v/v) penicilin-streptomicina (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Italija) i 1 posto (v/v) L-glutamina (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Italija). Ljudska Langerhansova otočića izolovana su u Milanu (Niguarda Ca' Granda) od kadaveričnih multiorganskih donora prema proceduri koju su opisali Ricordi et al. [32]; uzgajani su u RPMI mediju za kulturu koji sadrži 5,5 mmol/L glukoze, 10 posto toplinom inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma, 0,7 mM glutamina, 50 jedinica/mL penicilina i 50 ug/mL streptomicina (EuroClone, SpA, Pero MI, Italija). Korištena su četiri različita preparata otočića, čistoća otočića je bila 80 ± 10 posto. Izolaciju otočića i studije otočića odobrio je Etički komitet bolnice Niguarda Ca' Granda u Milanu (11.12.2009.). tc3 ćelije su tretirane sa 0,8, 1,6 i 16 uM verbaskozidom (Carbosynth, OV08034, Compton, UK), kafeinskom kiselinom i hidroksitirozolom (ljubazan poklon prof. Dell'Agli, Odsjek za farmakološke i biomolekularne nauke, Universita di Milanog Studi digli Studi Milano, Italija) u kompletnom RPMI mediju 5 dana, dok ljudska otočića sa 16 uM verbaskozida. Ćelije tretirane metanolom/etanolom korištene su kao kontrole. Da bi se inducirao oksidativni stres, ćelije su tretirane sa H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 uM u kompletnom mediju RPMI 20 minuta prije analize, dok je tretman sa tunikamicinom 2 ug/mL (T7765, Sigma Aldrich ) tokom 7 h je izvedeno da bi se inducirao ER stres.

2.2. Detekcija vitalnosti ćelije MTT testom

Ćelije su postavljene u ploče sa 96 jažica, a pet dana nakon tretmana verbaskozidom inkubirane su sa 0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimetiltiazol{{7} }yl)-2,5-difeniltetrazolijum bromid) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, SAD) tokom 4 h u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5 procenata CO2 na 37 oC. Nakon inkubacije, ćelije su nježno resuspendirane u 100 uL DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Italija) i apsorbancija na 540 nm je detektirana čitačem mikroploča (Benchmark, čitač mikroploča, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, SAD) [33]. Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka, a podaci su izraženi kao višestruko povećanje u odnosu na kontrolne uzorke.

2.3. Detekcija smrti ćelije protočnom citometrijom

Pet dana nakon inkubacije sa 16 uM verbaskozida, -ćelije su odvojene inkubacijom od 7 minuta sa tripsinom/EDTA, sakupljene i centrifugirane; pelet je lagano resuspendiran u fosfatnom puferu sa niskim solima. Ćelije su obojene MuseTM reagensom za broj i vitalnost (Millipore, MCH100102, Burlington MA, SAD) prema protokolu proizvođača i analizirane protočnom citometrijom. Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka, a podaci su izraženi kao postotak mrtvih ćelija u ukupnom broju.

2.4. ROS Generation

Intracelularni ROS je procijenjen sa DCFDA (2/,7/-dihlorofuorescein diacetat) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, SAD), membransko propusnom sondom koja postaje fluorescentna kada je vezana za ROS [34]. tc3 ćelije su prethodno napunjene sa 15 uM DCFDA u Krebs-Ringer puferu (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 i 2 mM Ca2)

dopunjen sa 11 mM glukoze tokom 1 h na 37 oC. Sadržaj ROS detektovan je tokom 30 minuta u bazalnim i stresnim uslovima pomoću čitača mikroploče (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Švajcarska). Srednje vrijednosti i standardne devijacije zasnovane su na tri nezavisna eksperimenta.

2.5. Western blotting

tc3 ćelije su sakupljene i rastvorene u RIPA puferu (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 1 procenat TERGITOLw NP40, 0,5 procenata deoksiholata) sa dodatkom aprotinina (Sigma A45 Aldrich) Louis, MO, SAD), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, SAD) i Roche inhibitori (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, SAD) 40 minuta na 4 oC. Koncentracija proteina određena je Bradfordovom analizom [35] korištenjem Bradfordovog reagensa (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, SAD), 30 ug proteina je razdvojeno pomoću 10 posto SDS-PAGE i preneseno na nitrocelulozne membrane (Millipore, Burlington MA, SAD). Primarna antitijela su primijenjena 2 h u puferu za blokiranje sa 5% nemasnog mlijeka ili 5% otopine BSA; korišćena su sledeća primarna antitela: mišji anti- -aktin (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, SAD), mišji anti-akrolein (Abcam, ab48501,Cambridge, UK), mišji anti-BIP (ljubazan poklon prof. Borgese Nica, Institut za neuronauku, CNR, Milano, Italija), zečji anti-HNE (-diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, SAD), miš anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, SAD), zečji anti-fosfo-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, SAD), miš anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, SAD), zečji anti-fosfo-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, SAD), zec anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, SAD), ovčiji anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Njemačka), zečji anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, SAD), zečji anti-eIF2 (Tehnologija ćelijske signalizacije Inc., 5324, Danvers, MA, SAD) i zečji anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, SAD). Sekundarna antitijela HRP-konjugirana (Dako Agilent, Santa Clara, Kalifornija, SAD) korištena su u razrjeđenju 1:5000. Proteini su detektovani korišćenjem ECL sistema za detekciju (Euro-Clone SpA, Pero MI, Italija) korišćenjem Odyssey Fc Image sistema (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Nemačka), a gustina traka je kvantifikovana pomoću softvera Image Studiow Lite (LI -COR Biosciences, Lincoln, NE, SAD) [36]. Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka, a podaci su izraženi kao višestruko povećanje u odnosu na kontrolne uzorke.

2.6. Potencijal mitohondrijske membrane

tc3 ćelije i Langerhansova otočića inkubirani su sa 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milano, Italija) ili 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Campoverde, Italija) za Milan337 oC; Intenzitet fluorescencije detektovan je čitačem mikroploča TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em za MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em za MitoSpyw Green) (TECAN Tecan Infinite⑧, ⑧ Tecan Infinite⑧, ⑧ Tecan F50ndorf, Ltd. Ćelije su inkubirane sa 500 uM H2O2 tokom 20 minuta, a intenzitet fluorescencije je detektovan kao što je prethodno opisano. Srednje vrijednosti i standardne devijacije zasnovane su na tri različita eksperimenta.

2.7. Mitohondrijska morfologija i dinamika

tc3 ćelije su prethodno napunjene sa 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milano, Italija) u 11 mM glukoznog Krebs-Ringer pufera na 37 oC tokom 30 minuta. Uzorci su pozicionirani u komoru za snimanje, a nasumična polja su snimljena korištenjem rodan filtera mikroskopa Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Njemačka). Za procjenu morfologije mitohondrija, pomoću softvera za analizu čestica ImageJ analizirani su sljedeći parametri: površina (um2), kružnost (4mArea2/Perimetar2) i Feretov maksimalni prečnik (um) [37].

Za eksperimente s time-lapse, jednoćelijsko snimanje je izvedeno pri 1 kadru u sekundi u trajanju od 30 s pod kontrolom ili uvjetima oksidativnog stresa. Da bi se izmjerila kumulativna udaljenost mitohondrija (um2), slike su prvo ispravljene za izbjeljivanje fotografija, a zatim su videozapisi analizirani korištenjem postojećeg dodatka Image-Pro Plus (praćenje objekata) (Media Cybernetics, Rockville, MD, SAD). Do dvanaest

ćelije su snimljene u tri nezavisna eksperimenta i podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti i standardne devijacije.

2.8. Sekrecija insulina

Ljudska izolovana Langerhansova otočića zasijana su u 96-ploču sa gustinom od 20 otočića po jažici i, nakon 5 dana tretmana, sadržaj i lučenje insulina su izmjereni u bazalnoj (3,3 mM glukoze) i stimulirani (16,7 mM glukoze ) stanja pomoću ELISA imunoeseja (Mercodia, 10-1113-01, Upsala, Švedska).

2.9. Statističke analize

Sve statističke analize su obavljene sa GraphPad Prism 8.0 na nezavisnim biološkim replikama. Srednja vrijednost između dvije grupe procijenjena je korištenjem dvostranog Studentovog t-testa, a p-vrijednost < 0.05="" je="" uzeta="" kao="" dokaz="" statističke="" značajnosti.="" srednje="" vrijednosti="" između="" tri="" ili="" više="" grupa="" su="" upoređene="" analizom="" varijanse="" (anova),="" praćeno="" višestrukim="" post-hoc="" (tukeyjevim)="" testom="" poređenja.="" korišteni="" statistički="" test,="" tačne="" p="" vrijednosti="" i="" broj="" replika="" (n)="" su="" naznačeni="" u="" legendama="" pojedinačnih="" slika.="" trake="" grešaka="" na="" slikama="" prikazuju="" srednju="" vrijednost="" ±="" sd="" ili="" srednju="" vrijednost="" ±="" se,="" kako="" je="">

3. Rezultati

3.1. Verbaskozid poboljšava vitalnost ćelija

Budući da nije bilo podataka o efektu verbaskozida na -ćelije, izvršili smo MTT test za procjenu vitalnosti ćelije i kao što je prikazano na slici 1A, uočen je pozitivan trend ovisan o dozi. Stoga smo za daljnja istraživanja odabrali koncentraciju od 16 uM za koju se statistički pokazalo da je efikasna za povećanje vitalnosti ćelija. Protočnom citometrijom proučavali smo uticaj petodnevne inkubacije verbaskozida na preživljavanje ćelija u bazalnim uslovima i nakon 2{{21} } min prethodnog tretmana sa 500 uM H2O2. U bazalnom stanju, verbaskozid nije uticao na preživljavanje ćelija, što sugeriše da povećana vitalnost ćelija primećena u MTT testu može biti posledica poboljšane mitohondrijalne aktivnosti. Dok je, nakon izlaganja H2O2, predtretman 16 uM verbaskozidom značajno smanjio smrt stanica uzrokovanu oksidativnim stresom (Slika 1B,C). Verbaskozid je složeni molekul koji se može modificirati hidrolizirajućim enzimima [18]. Da bi se ispitalo da li metaboliti verbaskozida mogu biti odgovorni za uočeni zaštitni efekat, tc3 ćelije su tretirane hidroksitirozolom i kafeinskom kiselinom (0,8 i 16 uM) tokom 5 dana. Oba metabolita nisu povećala vitalnost ćelije, naprotiv, citotoksični efekat, relevantniji nakon izlaganja H2O2, otkriven je za koncentraciju od 16 uM (slika S1). Ovo otkriće dokazuje da verbaskozid, a ne njegovi metaboliti, imaju zaštitni učinak na tretman H2O2.

3.2. Verbaskozid modulira redoks homeostazu i ispoljava antiinflamatorni efekat u ćelijama

Prvo smo potvrdili u tc3 ćelijama anti-inflamatorne i antioksidativne efekte verbaskozida uočene u drugim tipovima ćelija [24,29,34]. Aktivnost uklanjanja ROS verbaskozida procijenjena je sa tc3 ćelijama označenim ROS specifičnom DCFDA (2/,7/-dihlorofuorescein diacetat) ćelijskom permeabilnom sondom. Kao što je prikazano na slici 2A, otkriveno je značajno smanjenje sadržaja ROS nakon prethodnog tretmana verbaskozidom, kako u uslovima bazalnog tako iu uslovima oksidativnog stresa.

Western blot analize su otkrile značajno smanjenje ekspresije markera oksidativnog stresa akroleina i 4-hidroksinonenala (HNE) u ćelijama tretiranim verbaskozidom. Osim toga, otkrili smo povećanje ekspresije superoksid dismutaze (SOD1), što sugerira da verbaskozid ispoljava svoju antioksidativnu aktivnost vjerovatno s dva različita mehanizma, direktno kao čistač ROS-a i indirektno indukujući ekspresiju antioksidativnih enzima (Slika 2B,C).

Protuupalni učinak verbaskozida na -ćelije procijenjen je procjenom aktivacije NFKB puta, najvažnijeg proinflamatornog puta u ovim stanicama [38]. Western blot analizom pronašli smo smanjenu ekspresiju inhibitora nuklearnog faktora kapa B (IKB) i nuklearnog faktora kapa-light-chain-enhancer (NFKB), te značajno smanjenje fosforilacije NFKB u prethodno tretiranim stanicama, što podupire hipotezu o efikasnost verbaskozida za smanjenje ćelijske upale (slika 2D,E).

3.3. Verbaskozid modulira nesavijeni proteinski odgovor -ćelija

Zatim smo detaljno analizirali molekularni mehanizam pomoću kojeg verbaskozid ima antioksidativne i protuupalne uloge, fokusirajući se na endoplazmatski retikulum koji se pojavljuje kao ključni senzor metaboličkih i stresnih signala u -ćelijama. U uslovima stresa, organela pokreće homeostatski odgovor, poznat kao nesavijeni proteinski odgovor (UPR), čiji je cilj obnavljanje funkcije ER; međutim, prekomjerna aktivacija ovog puta dovodi do apoptoze [39,40].

Markeri povećanog ER stresa su pojačana regulacija proteina šaperona i aktivacija UPR odgovora. Western blot analiza ćelija tretiranih verbaskozidom otkrila je smanjene nivoe dva šaperonina proteina toplotnog šoka 70 (HSP70) i ​​vezivnog imunoglobulinskog proteina (BIP) (Slika 3A,B). Nadalje, otkriveno je značajno smanjenje ekspresije ER kinaze nalik protein kinazi RNA (PERK) i smanjena fosforilacija njenog nizvodnog efektora, eukariotskog faktora inicijacije translacije 2 (eIF2).

Kliknite ovdje za 2. dio