Dio 1: Mapiranje epigenomske i transkriptomske međusobne igre tokom formiranja pamćenja i prisjećanja u ansamblu hipokampalnog engrama

Za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Molimo kliknite ovdje do 2. dijela

Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila- Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*

1Picower Institute for Learning andMemorija, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, SAD.

2Odjel za mozak i kognitivne znanosti, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, SAD.

3Laboratorija za računarske nauke i umjetnu inteligenciju, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, SAD.

4Division of Newborn Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SAD.

5Broad Institute of Harvard i MIT, Cambridge, Massachusetts, SAD.

Kliknite zaCistanche vitamin shop i Cistanche za pamćenje

Abstract

Epigenom i trodimenzionalna (3D)-genomska arhitektura se pojavljuju kao ključni faktori u dinamičkoj regulaciji različitih transkripcionih programa potrebnih za neuronske funkcije. Ovdje koristimo sistem označavanja koji ovisi o aktivnosti kod miševa kako bismo odredili epigenetsko stanje, arhitekturu 3D genoma i transkripcijski pejzaž engramskih ćelija tokom životnog vijekamemorijaformiranje i opoziv. Naši nalazi to otkrivajumemorijakodiranje dovodi do epigenetskog prajminga, obilježenog povećanom dostupnošću pojačivača bez odgovarajućih transkripcijskih promjena.Memorijakonsolidacija zatim rezultira prostornom reorganizacijom velikih segmenata kromatina i interakcijama promotor-pojačivač. Konačno, sa reaktivacijom, engramski neuroni koriste podskup denovo-dugoletnih interakcija, gdje su pripremljeni pojačivači dovedeni u kontakt sa svojim odgovarajućim promotorima kako bi pojačali regulaciju gena uključenih u lokalnu translaciju proteina u sinaptičkim odjeljenjima. Zajedno, naš rad razjašnjava sveobuhvatnu transkripciju i Korisnici mogu da pregledaju, štampaju, kopiraju i preuzimaju tekst i podatke o sadržaju u takvim dokumentima, za akademsko istraživanje, uvek podložni punim Uslovi korišćenja: http://www.nature. com/authors/editorial_policies/license.html#terms

*Korespondencija sa: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.

Doprinosi autora:

AM i L.-HT su osmislili i osmislili projekt. AM i AZ su izveli eksperimente ponašanja, ISH, imunobojenje i MARIS analizu. CA je izvršio injekciju virusa i imunobojenje. AM i HSM su izveli ATAC-seq eksperimente. AM i AZ su izveli eksperimente nuklearnog RNA-seq. AM, HSM i VD su izveli pc-Hi-C i Hi-C eksperimente. AM, HSM, VD, RMR i JDV su izvršili ATAC-seq analizu. AM, RMR, HSM, VD i FG izvršili su nuklearnu RNA-seq analizu. AM, VD, HSM i RMR su izvršili pc-Hi-C i Hi-C analizu. Svi autori su pomogli u tumačenju podataka. AM, HSM, VD, RMR, JZY, MK i LHT napisali su rukopis uz doprinose svih autora. LHT je obezbijedio alate i nadgledao projekat.

Konkurentni interesi:

Autori se izjašnjavaju da nema suprotstavljenih interesa.

epigenomski pejzaž kroz životni vijekmemorijaformiranje i opoziv u ansamblu hipokampalnog engrama.

Formiranje i očuvanje dugotrajne memorije zavisi od koordinisane ekspresije gena i sinteze sinaptičkih proteina1. Ovi molekularni procesi djeluju unutar specifične populacije neurona, koja se naziva engramske ćelije2–4. Nedavni pristupi koji koriste izražavanje reportera ovisno o aktivnostima pružili su okvir za istraživanje engramskog ansambla5–8, ali molekularni mehanizmi koji upravljajumemorijaskladištenje i pronalaženje ostaju slabo shvaćeni. Konkretno, epigenetske modifikacije i 3D-genomska arhitektura se pojavljuju kao ključni faktor u dinamičkoj regulaciji ekspresije gena9–17, a sve je više uvažavanje njihovog značaja u neuronskoj funkciji, razvoju i bolesti14, 16, 18

Ovdje smo koristili mišji model ciljane rekombinacije u aktivnim populacijama (TRAP) 5,6, u kojem su aktivirani neuroni koji eksprimiraju protein povezan s citoskeletom reguliran aktivnošću, (Arc) gen, trajno označeni na inducibilan način. Aktivirani neuroni tokommemorijakodiranje, konsolidacija i opoziv su sortirani i podvrgnuti sekvenciranju nuklearne RNK (nRNA-seq), testu za hromatin dostupan transpozazi koristeći sekvenciranje (ATAC-seq) i hvatanju konformacije hromozoma (Hi-C). Naši podaci to pokazujumemorijakodiranje dovodi do povećanja dostupnosti kromatina u cijelom genomu, bez očekivanih promjena u ekspresiji gena. Nadalje, pokazujemo da je kasna faza konsolidacije memorije bila povezana s ponovnom lokalizacijom velikih kromatinskih segmenata (sub-kompartmana) iz neaktivnog u permisivno okruženje, i reorganizacijom pejzaža interakcije promotor-pojačivač. Konačno, reaktivacija neurona tokommemorijaopoziv je povezan sa interakcijama denovopromoter-pojačivač, koristeći veliki podskup pojačivača koji su bili pripremljeni tokommemorijakodiranje. Ove interakcije promotor-pojačivač su povezane sa snažnom promjenom u ekspresiji gena uključenih u lokalnu sintezu proteina i sinaptičku morfogenezu.

Rezultati

Vremenska i prostorna identifikacija aktiviranih i reaktiviranih engramskih ćelija

Praćenje neuronske aktivnosti tokom vremena bio je jedan od glavnih izazova prilikom proučavanja engramskih ćelija, jer se markeri neuronske aktivnosti, poznati kao neposredni rani geni (IEG), vraćaju na početnu liniju ubrzo nakon indukcije1,2. Da bismo prevazišli ovo ograničenje, iskoristili smo TRAP5,6 model, koji zahtijeva dva transgena, jedan koji eksprimira CreERT2 iz promotora Arc ovisnog o aktivnosti i jedan koji omogućava ekspresiju reportera žutog fluorescentnog proteina (eYFP) u Cre- zavisan način. Davanje tamoksifena (TAM) TRAP miševima rezultira trajnom oznakom eYFP u aktiviranim neuronima Arc. Bez TAM-a, CreERT2 se zadržava u citoplazmi i eYFP nije eksprimiran (prošireni podaci, slika 1a). TRAP miševi su bili podvrgnuti klasičnoj Pavlovskoj paradigmi kontekstualnog uslovljavanja strahom (CFC) (slika 1a), uobičajenoj metodi za proučavanje averzivnih sjećanja19. Otprilike 1,5-2 sata nakon izlaganja FS, sakupljeni su mozgovi da se identifikuju i) RNA vezujući protein fox-1 homolog 3 (Rbfox3) također poznat kao NeuN plus i eYFP plus označeni neuroni koji su aktivirani tokom početnog izlaganja (Aktivirano -rano), koji se može razlikovati od ii) NeuN plus /eYFP- neaktiviranih neurona bazalnog stanja (Basal) (slika 1a). Nakon pet dana, u nedostatku preuzimanja, prikupili smo iii) NeuN plus /eYFP plus neurone koji su označeni na dan treninga, što označava dugotrajnememorijakonsolidacija (Aktivirano-kasno). U

različita kohorta, miševi su ponovo izloženi uslovljenom stimulusu i naknadna ekspresija endogenog ARC proteina je analizirana 1,5-2 sata nakon ponovnog izlaganja. Ovo je omogućilo identifikaciju iv) dvostruko pozitivnih NeuN plus /eYFP plus / endogenih neurona Arc plus engrama koji su bili aktivirani tokom treninga i reaktivirani tokommemorijaopoziv (ponovno aktiviran). Primjetno, iako se rekombinacija DNK možda neće u potpunosti dogoditi 1,5-2 h nakon FS, primijetili smo visoku ko-lokalizaciju (u prosjeku od 84 posto) između endogenog Arc proteina i Arc:eYFP reportera (prošireni podaci, slika 1b), koji je također bio u skladu sa prethodnim izvještajima20.

Za potvrdumemorijakodiranje i prisjećanje tokom CFC-a, ponašanje smrzavanja je zabilježeno tokom treninga i ponovnog izlaganja znakovima koji izazivaju strah (Prošireni podaci, slika 1c). U skladu s prethodnim publikacijama6,20, naši podaci su pokazali značajno povećanje broja eYFP plus (aktiviranih ranih i kasnih) neurona u hipokampusu, u poređenju s miševima koji su ostali naivni na CFC u svom kućnom kavezu (F (2, 70)=240.3, P<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">

Formiranje pamćenja povezano je sa povećanom dostupnošću hromatina, pretežno na pojačivačima

Da bismo bolje razumjeli molekularne sile koje upravljaju različitim transkripcijskim programima, izmjerili smo promjene dostupnosti hromatina u cijelom genomu u različitim fazamamemorija. Hipokampalna tkiva su spojena i izolovana jezgra (prošireni podaci, slika 2a, dodatna tabela 1) su podvrgnuta pripremi ATAC-seq biblioteke. Analiza diferencijalno dostupnih regiona (DARs) (Diffbind, DESeq2 način) između svih populacija (slika 2a) otkrila je da se većina promjena u stanju hromatina dešava tokom rane faze formiranja memorije, gdje 7,862 regija širom genoma dobijaju pristupačnost (Basal vs. Early, Dodatna tabela 2). Nasuprot tome, uočili smo relativno minimalne promjene u stanju kromatina pri prelasku iz Aktivirano-rano u Aktivirano-kasno (582 DAR-a) i između Aktivirano-kasno i Reaktiviranih neurona (725 DAR-a), sa 48 posto preklapanja između njih (Prošireni podaci, Slika 2b ). Zanimljivo je da smo identificirali veliki postotak (52 posto) stabilno dobijenih DAR-ova koji su postali dostupniji u Aktivirano-rano i ostali dostupni i u Aktivirano-kasno i Reaktiviranim neuronima (Slika 2b,c; Dodatna tabela 2). Zanimljivo, dok su i rane promjene (Basal vs. Early) i stabilno dobijeni DAR obogaćeni za intergenske regije, kasne promjene hromatina (Early vs. late i Late vs. Reactivated) su uglavnom obogaćene za promotorska mjesta, (Slika 2d).

Funkcionalni uvid je dat procjenom kako su DAR-ovi obilježeni različitim modifikacijama histona. Prvo smo koristili ChromHMM da uspostavimo model stanja hromatina iz dvije nezavisne studije koje su koristile masivno tkivo hipokampusa prije i nakon šoka stopala 21,22. Zatim smo izvršili analizu obogaćivanja (uočeno preko očekivane distribucije) DAR-ova za ova različita stanja i otkrili da su rane promjene kromatina i stabilni DAR-ovi obogaćeni za oznake pojačivača (slika 2e; prošireni podaci slika 2c, dodatna tabela 3) .

Ovi rezultati su u skladu s prethodnim publikacijama, pokazujući da stimulacija primarne neuronske kulture inducira produženu aktivnost pojačivača12,23. Zatim smo analizirali preklapanje pojedinačnih stabilnih lokusa sa H3K4me1 i H3K27ac21. Ove dvije histonske oznake ocrtavaju različite populacije pojačivača, koji mogu biti ili 'primirani' (samo H3K4me1), 'aktivni' (H3K4me1 i H3K27ac) ili 'latentni' (bez oznaka)18. Stabilni pikovi su pokazali distribuciju i na primarne i na aktivne pojačivače (prošireni podaci, slika 2d), pri čemu se predviđalo da će 47 posto ovih mjesta biti 'latentno' (bez preklapanja između DAR-a i histonskih oznaka21 dobijenih 1 sat nakon FS). Da bismo potvrdili naš model, izvršili smo imunoprecipitaciju hromatinom (ChIP) za histonske markere H3K4me1 i H3K27ac, nakon čega je uslijedio qPCR. Četiri odabrana mjesta su odabrana iz naše pretpostavljene analize modeliranja pojačivača (Prošireni podaci, slika 2d; Enhancer 1 – predviđeni primirani, Enhancer 2- predviđeni aktivni, Enhancer 3 i 4 – predviđeni latentni). U skladu sa našim modelom, identifikovali smo dva 'latentna' lokusa u bazalnom stanju (pojačivači 3 i 4) koji su se transformisali u 'aktivno' stanje tokommemorijaformacija (slika 2f). Štaviše, utvrđeno je da je navodni pojačivač 1 bio 'primiran' u bazalnom stanju i postao aktivan, gdje je došlo do značajnog stabilnog povećanja H3K27ac markera tokom kasne faze i opoziva (slika 2f). Zajedno, ovi podaci ukazuju na to da je repertoar novodostupnih pojačivača proširen u potenciranim engramskim neuronima, gdje su latentne ili primirane regije dobile oznake H3K4me1 i H3K27ac i tako postale aktivni pojačivači.

Da bismo razumjeli funkcionalnu ulogu dostupnih promotora i pojačivača regiona, izvršili smo analizu obogaćivanja motiva (dodatna tabela 4). Naši podaci pokazuju da je većina (70 posto) motiva na pristupačnim promotorima podjednako obogaćena i identifikovana u svim fazamamemorija(Prošireni podaci, slika 2e). Nasuprot tome, većina mjesta pojačivača pokazala je različite obrasce motiva vezanja faktora transkripcije (TF) u različitim memorijskim fazama. Zanimljivo je da su sveprisutno izraženi motivi iz Jun proto-onkogena, podjedinice transkripcionog faktora Ap-1 (tj. Jun-Ap1) i familije TF-ova regulatornog faktora X (Rfx), značajno obogaćeni tek nakon početne faze kodiranje (Prošireni podaci, slika 2e). Ranije je objavljeno da kompleks Jun-Ap1 igra centralnu ulogu u selekciji pojačivača i da može djelovati kao pionirski TF za definiranje mjesta pojačivača tokom razvoja mozga i neuronske aktivnosti12,24. Ovi nalazi su u skladu s našim podacima koji su pokazali visok postotak latentnih/primiranih lokusa u bazalnom stanju (slika 2f, prošireni podaci slika 2c,d). Stoga se čini da neuronska aktivnost može pokrenuti vezivanje Jun-Ap1 za latentne pojačivače, koji zatim regrutuju modifikatore kromatina koji aktiviraju latentne pojačivače. Slično, obogaćivanje motiva faktora transkripcije Yin Yang 1 (Yy1) samo u pojačivačima iz ranih i kasnih stanja, sugerira da je organizacija promotor-pojačivača aktivan procesmemorijaformiranje, jer je nedavno objavljeno da Yy1 olakšava formiranje ovih dugotrajnih interakcija25. Zbirno, ovi podaci sugeriraju da je početna faza odmemorijaformiranje mijenja krajolik pristupačnosti hromatina u aktiviranim neuronima, s dugotrajnim stabilnim promjenama koje se javljaju pretežno unutar pojačivača regija.

Dinamičke promjene u prostornoj nuklearnoj arhitekturi i dostupnosti hromatina tokom inicijalnogmemorijaformiranje odgovara povećanju učestalosti interakcija promotor-pojačivač tokommemorijaopoziv

Nuklearna 3D arhitektura se pojavljuje kao ključni faktor u dinamičkoj regulaciji ekspresije gena, u mnogim neuronskim funkcijama26-28. Stoga nas je zanimalo da ocrtamo precizne promjene koje se dešavaju u prostornoj organizaciji hromatina tokommemorijaformiranje i konsolidacija. Proizveli smo Hi-C podatke iz bazalnog stanja i eYFP plus označenih neurona (rani i kasni, dodatna tabela 5). Hromatin je podijeljen u dva prostorno različita subnuklearna odjeljka, 'A' i 'B', koji odgovaraju transkripcijski aktivnom i neaktivnom hromatinu, respektivno15, 16,26. Rani dokazi sugeriraju da neuronska aktivnost i ekstrinzična signalizacija mogu izazvati reorganizaciju 3D-hromatinske arhitekture14,27,28. Naša analiza stanja kompartmenta15, 16,26 (sl. 3a–c) otkrila je ponovnu lokalizaciju velikih segmenata hromatina iz neaktivnog (B) u permisivno okruženje (A) (i obrnuto) tokom početne i kasne fazememorijaformiranje (212 segmenata prebačeno iz A u B, 127 iz B u A, prosječna veličina ~436Kbp). Zanimljivo je da je 52 posto regiona u ranoj fazi koji su prešli sa B na A zadržalo to stanje u kasnoj fazi (tj. ostalo u stanju A, slika 3b,c; Dodatna tabela 6). Štaviše, skoro svi ovi regioni su se preklapali sa dobijenim DAR-ovima iz naše ATAC-seq analize, potvrđujući prelazak potkompartmenta iz neaktivnog u permisivno okruženje (slika 3d). Ovi podaci ukazuju na to da neki lokusi prolaze kroz prebacivanje pod-kompartmenta u različitim memorijskim fazama, te stoga mogu doprinijeti dugoročnim promjenama u svojstvima i funkciji neurona nakon početne aktivacije.

Dok su naši Hi-C podaci sugerirali reorganizaciju velikih razmjera, ostalo je nejasno da li je ova preorijentacija omogućila interakciju novih repertoara promotor-pojačivača i fino podešavanje različitih programa transkripcije (slika 3e). Koristeći Hi-C tehniku ​​hvatanja promotora (pc-HiC), proučavali smo precizne promjene koje se dešavaju u interakcijama promotor-pojačivača tokom procesamemorijaformiranje i opoziv. Za ovu studiju koristili smo prilagođene "mamce" koji ciljaju ~5000 promotera29. U skladu sa prethodnim publikacijama29, otkrili smo ~19.000 (po grupi) značajnih interakcija promotora-pojačivača (67,5 posto) i promotora-promotera (46,2 posto) (prošireni podaci, slika 3a,b).

Budući da promotori u mozgu sisara mogu biti pod kontrolom višestrukih regulatornih elemenata14,30,31, analizirali smo preklapanje između svih pojačivača u interakciji i njihovih odgovarajućih promotora. To smo otkrili tokom svakememorijafazi, isti promoteri češće stupaju u interakciju sa različitim podskupom pojačivača (tj. jedinstveni, bazalni – 3243, rani - 7602, kasni - 7028, reaktivirani – 7244; slika 4a,b; prošireni podaci Fig. 3c; Dodatna tabela 7). Ovaj rezultat je u skladu s prethodnim publikacijama koje pokazuju da su višestruki pojačivači koji okružuju nekoliko gena (c-Fos i Arc) ključni za njihovu aktivaciju i da se njihova učestalost interakcije s odgovarajućim promotorima mijenja kao odgovor na različite depolarizirajuće agense u kultiviranim neuronima31. Također smo identificirali manji podskup interakcija u kojima su promotori bili u interakciji s istim pojačivačima u različitimmemorijafaze (tj. uobičajene, ~31 posto svih interakcija; Dodatna tabela 7). Nadalje, reaktivirani neuroni su pokazali značajno jače rezultate interakcije (prema proračunu Chicaga, slika 4b; prošireni podaci slika 3d). Stoga, iako je broj jedinstvenih interakcija bio sličan u ranim, kasnim i reaktiviranim stanjima, jači rezultati interakcije ukazuju na to da se specifične interakcije promotor-pojačivača javljaju češće tokom pamćenja.

opoziv. Ova ideja je dodatno potvrđena eksperimentima 3C, sa prajmerima dizajniranim da mjere učestalost interakcije između odabranog pojačivača (E) i genskih promotora (P) koji kodiraju za eukariotski faktor inicijacije translacije 3 podjedinicu D (Eif3d) ili glutamatni receptor, jonotropni, kainatni 3 (Grik3) (Sl. 4c). Naši podaci su pokazali da su reaktivirani neuroni imali značajno povećanje učestalosti interakcije između Eif3d promotora i odabranog pojačivača, u poređenju sa drugim populacijama (slika 4c). Zbirno, ovi podaci ukazuju na to da se interakcije promotor-pojačivač dešavaju češće tokommemorijaopoziv.

Zatim smo pitali da li dinamičke interakcije dugog dometa identificirane putem pc-HiC odgovaraju regijama hromatina koje postaju pristupačnije, kao što je određeno putem ATAC-seq. Ovo bi potvrdilo da povećana dostupnost ima funkcionalnu posljedicu u stvaranju novih interakcija promotor-pojačivač. Da bismo to postigli, uporedili smo preklapanje između pojačivača u interakciji u svakoj ćelijskoj populaciji sa DAR-ovima (opaženim) ili slučajnim skupom dostupnih genomskih lokusa (očekivano). Naša analiza je otkrila značajno preklapanje između oba dobijena DAR-a u Aktiviranim ranim neuronima i stabilno dobijenih DAR-a sa pojačivačima koji djeluju u interakciji, u svim ćelijskim populacijama (Svi Ps < 0.0001,="" prošireni="" podaci,="" slika="" 3e).="" nasuprot="" tome,="" promjene="" u="" dostupnosti="" hromatina="" koje="" su="" se="" dogodile="" tokom="" kasne="">memorijakonsolidacija i reaktivacija nisu se značajno preklapale sa pojačivačima u interakciji (Prošireni podaci, slika 3e). Zajedno, ovi rezultati ukazuju na to da je dobijanje pristupačnosti tokom memorijskog kodiranja početni događaj i da se ovi pripremljeni lokusi uključuju u de-novo funkcionalne interakcije promotor-pojačivača tokom kasnijih fazamemorijaformiranje. Ovaj dinamični pejzaž je ilustrovan vizualizacijom genomskih regiona oko eukariotskog gena inicijacije translacije 5 podjedinice A (Eif5a) (slika 4d). Ova privremena molekularna disekcija životnog vijeka engrama naglašava kako je koordiniran početak epigenetskog stanja ćelije tokommemorijakodiranje i konsolidacija olakšava dugotrajne interakcije tokom reaktivacije.