Dio 1: Učinak akteozida kao zaštitnika stanica za proizvodnju kloniranog psa

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 Odsek za nauku o životinjama i mlekarstvu, Fakultet za poljoprivredu i nauku o životu, Nacionalni univerzitet Chungnam, Daejeon, Republika Koreja,

2 Odsjek za biologiju, Visoka pedagoška škola,Nacionalni univerzitet Chonnam, Gwangju, Republika Koreja

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Molimo kliknite ovdje do 2. dijela

Abstract

Prenos nuklearnih ćelija somatskih ćelija (SCNT) je dobro poznata laboratorijska tehnika. Princip SCNT-a uključuje reprogramiranje somatskog jezgra ubrizgavanjem somatske ćelije u oocitu primaoca čije je jezgro uklonjeno. Stoga se ćelije donori nukleusa smatraju ključnim faktorom u SCNT. Sinhronizacija ćelijskog ciklusa ćelija donora jezgra u fazi G0/G1 može se inducirati kontaktnom inhibicijom ili gladovanjem u serumu. U ovoj studiji,acteoside, jedinjenje fenilpropanoidnog glikozida, istraženo je kako bi se utvrdilo da li je primjenjivo za indukciju sinkronizacije ćelijskog ciklusa, citoprotekciju i poboljšanje efikasnosti SCNT u fibroblastima fetusa pasa. Tretirani su primarni pseći fetalni fibroblastiacteoside(10, 30, 50 μM) za različite vremenske periode (24, 48 i 72 sata). Sinhronizacija ćelijskog ciklusa u fazi G0/G1 nije se značajno razlikovala od metode indukcije:acteosidetretman, kontaktna inhibicija ili gladovanje u serumu. Međutim, od ova tri tretmana, gladovanje u serumu rezultiralo je značajno povećanim nivoom reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) (99,5 ± 0,3 posto) i apoptozom. To su otkrili i rezultatiacteosidesmanjen ROS i procesi apoptoze uključujući nekrozu u fibroblastima fetusa pasa i poboljšano preživljavanje stanica. Fibroblasti fetusa pasa tretirani saacteosidesu uspješno uhapšeni u fazi G0/G1. Štaviše, rekonstruirani embriji pomoću ćelija donora jezgra tretiranih akteozidom dali su zdravog kloniranog psa, ali ne i embrije proizvedene pomoću ćelija donora jezgra podvrgnutih kontaktnoj inhibiciji. U zakljucku,acteosideIndukovana sinhronizacija ćelijskog ciklusa ćelija donora jezgra bi bila alternativna metoda za poboljšanje efikasnosti psećeg SCNT-a zbog njegovih citoprotektivnih efekata.

Cistanche acteoside može poboljšati imunitet

Uvod

SCNT tehnika je korištena za proizvodnju genetski superiornih ili manipuliranih životinja za poljoprivredne svrhe i kao biomedicinski resursi. Sa sve većom potrebom za životinjskim modelima bolesti, spašavanjem životinja u opasnosti od izumiranja, matičnim stanicama za regenerativnu medicinu, transplantacijom organa, itd., u posljednje vrijeme raste interes za kloniranje životinja pomoću SCNT-a [1–5]. Iako je proizvodnja kloniranih životinja bila uspješna, efikasnost SCNT-a je i dalje vrlo niska [6]. Uzroci niske razvojne kompetencije SCNT embriona uključuju mnoge faktore koji su povezani sa kvalitetom oocita primaoca, kvalitetom ćelija donora jezgra i stanjem surogat majke [7–10].

Poznato je da su reaktivne vrste kiseonika (ROS) i apoptoza uključene u ženske reproduktivne procese uključujući razvoj oocita in vivo i in vitro [11–14]. ROS prekidaju razvoj embrija izazivanjem citoplazmatske kondenzacije, oštećenja DNK i apoptoze u embrionima. Prateće studije su izvestile da smanjenje ROS poboljšava kompetenciju za razvoj SCNT embriona tokom in vitro kulture [15–17]. Apoptoza je fiziološki proces koji se javlja spontano tokom normalnog razvoja embriona prije implantacije kako bi se održala ćelijska homeostaza uklanjanjem DNK oštećenih/neispravnih stanica. ROS uzrokuje fragmentaciju DNK i povećava apoptotske blastomere koji ometaju razvoj embrija. Događaj ROS i apoptoze češće se opaža nakon SCNT nego nakon in vitro oplodnje [18, 19]. Mnoge studije su objavile da se sposobnost razvoja SCNT embriona spašava smanjenjem nivoa ROS i apoptoze upotrebom antioksidansa kao što su selen [20], inzulin-transferin-selen [17, 21], melatonin [22] i glutation [23].

Prethodne studije su objavile da je upotreba donorskih ćelija zaustavljenih u fazi G{{0}}/G1 poboljšala efikasnost SCNT-a [7, 9, 24–28]. Hromatin u donorskim ćelijama u fazi G0/G1 smatra se najefikasnijim za razvoj kompetencije SCNT embriona. Za sinhronizaciju ćelijskog ciklusa donora, često se koriste kontaktna inhibicija, gladovanje u serumu i hemijski tretmani [7, 25, 29, 30]. Međutim, gladovanje u serumu smanjuje preživljavanje ćelija i povećava fragmentaciju DNK, što dovodi do apoptoze [31]. Hemijska inhibicija je još jedna strategija za zaustavljanje ćelijskog ciklusa u fazi G0/G1 upotrebom inhibitora kao što su roskovitin [29, 32], dimetil sulfoksid (DMSO) [33] i cikloheksimid (CHX) [34]. Na efikasnost metode koja se koristi za sinhronizaciju utiču tipovi i vrste ćelija donora. Za optimalnu sinhronizaciju ćelija donora, potrebno je pažljivo procijeniti različite aspekte korištenih metoda.

Acteoside(takođe poznat kao verbaskozid) [{{0}}(3, 4-dihidroksi fenil etil)-1-OaL-ramnopiranozil-(1/3)-bD-({{13} }O-kafeoil)-glukopiranozid] je izolovan iz cvetova ljubičice Syringa vulgaris. Poznato je da biljke koje sadrže akteozid imaju antimikrobno i antigljivično djelovanje [35–37] i sprječavaju upalu. Zaista, akteozid pokazuje različite biološke aktivnosti in vitro i in vivo, kao što je antioksidativna aktivnost, anti-apoptotička aktivnost, citotoksičnost protiv različitih tumorskih ćelija i sinhronizacija ćelijskog ciklusa u fazi G0/G1 kao ciklin zavisna. inhibitor kinaze (CDK) [38]. Na primjer Lee et al.[38] izvijestili su da liječenje akteozidima može inhibirati proliferaciju ljudskih promijelocitnih HL-60 ćelija leukemije izazivanjem zaustavljanja ćelijskog ciklusa u fazi G0/G1. Međutim, efekat donorskih ćelija tretiranih akteozidom na efikasnost psećeg SCNT tek treba da se prouči.

U ovoj studiji, efektiacteosidena sinhronizaciju ćelijskog ciklusa, ROS iapoptozaispitivani su fibroblasti fetusa pasa. Analiza sinhronizacije ćelijskog ciklusa, ROS-a i apoptoze izvršena je pomoću fluorescentno aktiviranog sortiranja ćelija (FACS). Da bi se demonstrirala efikasnost ćelija donora tretiranih akteozidom, SCNT embrioni su kultivisani i prebačeni u psa primaoca, te uspešno proizveli zdravog kloniranog psa.

cistanchemože liječitibubregbolest se poboljšabubrežnifunkcija

Materijali i metode

Etička izjava

U ovoj studiji, 44 ženke mješanca (u dobi od 1-6 godina) korištene su kao donori oocita i surogati za prijenos embrija, a ženka bigla (u dobi od 2 godine) korištena je za uspostavljanje ćelijskih linija fetusa fibroblasta. Sve eksperimente na životinjama odobrio je Institucionalni komitet za brigu o životinjama (IACUC) Nacionalnog univerziteta Chungnam (broj odobrenja: CNU-00487) i izvedeni su prema "Vodiču za njegu i korištenje laboratorijskih životinja" koji je objavio IACUC Nacionalnog univerziteta Chungnam. Psi su uzgajani u zatvorenom prostoru u odvojenim kavezima sa sistemom za kontrolu temperature i ventilacije. Psi su hranjeni komercijalnom hranom jednom dnevno i davana im je voda ad libitum. U svim eksperimentima na životinjama, psi su inicijalno anestezirani sa 6 mg/kg ketamina i ksilazina i održavani u anesteziranom stanju sa 2 posto izoflurana. Na kraju operacije davani su antibiotici (prokain penicilin G, benzatin penicilin G i dihidrostreptomicin sulfat) da bi se sprečila svaka infekcija. Nakon operacije, psi su prebačeni u svoje individualne kaveze sa slatkom vodom, praćeni i pružena im je posebna nega od strane nadležnog veterinara, kako bi se dali neophodni tretmani ako je životinjama to bilo potrebno.

Hemikalije

Sve hemikalije su kupljene od Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, SAD) osim ako nije drugačije navedeno. Acteoside je nabavljen od Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. u Kini.

Izolacija psećih fetalnih fibroblasta

Fibroblasti fetusa pasa su dobijeni od {{0}}dan starih fetusa. Ukratko, ženka Bigla je umjetno oplodjena spermom mužjaka Bigla. Nakon 28 dana potvrđena je trudnoća ženke bigla i celiohisterektomijom je dobijeno 5 fetusa. Fetusi su tri puta isprani u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, SAD). Glava, unutrašnji organi i udovi fetusa uklonjeni su hirurškim nožem, a preostali dijelovi tijela su mljeveni u PBS-u. Komadi fetusa su dva puta isprani centrifugiranjem na 400 × u trajanju od 5 minuta i uzgajani u Dulbecco-ovom modificiranom orlovom mediju (DMEM; Gibco) sa dodatkom 1 posto penicilina-streptomicina (proizvod br. P4458) i 20 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS); na 39 stepeni u vlažnoj atmosferi od 5 posto CO2 i 95 posto zraka. Kada su ćelije došle do konfluencije nakon 5-7 dana, tretirane su sa 0,25 posto tripsina-EDTA (Gibco) u trajanju od 2 minute i sakupljene. Od dva pojedinačna fetusa ustanovljene su dvije ćelijske linije fibroblasta fetusa pasa. Ćelije su zamrznute u 10 posto DMSO u FBS-u i pohranjene u tečnom dušiku na -196 stepenu dok nisu upotrijebljene.

Tretman ćelijama

Smrznuti pseći fibroblasti su odmrznuti i kultivirani do 80 posto konfluentnosti. Ćelije su sakupljene i pasirane 4 do 7 puta za naredne eksperimente. Ćelije su zasijane u koncentraciji od 106/mL u posude za kulturu od 60 mm. Ćelije su kultivisane u (1) DMEM sa dodatkom 10 posto FBS i 1 posto penicilina-streptomicina pet dana (inhibicija kontakta), (2) DMEM sa dodatkom 0,5 posto FBS i 1 posto penicilina-streptomicina pet dana (gladovanje u serumu) ili (3) DMEM dopunjen sa 10 posto FBS i 1 posto penicilin-streptomicina koji sadrži akteozid u 10 μM, 30 μM ili 50 μM tokom 24 h, 48 h i 72 h (tretman akteozidima).

Analiza ćelijskog ciklusa protočnom citometrijom

Za analizu faza ćelijskog ciklusa, ćelije su sakupljene upotrebom {{0}}.25 posto tripsina-EDTA i isprane 3 puta sa PBS centrifugiranjem. Nakon posljednjeg ispiranja, supernatanti su odbačeni, a ćelije resuspendirane u 0.3 mL PBS. Za fiksaciju, {{10}}.7 mL hladnog apsolutnog etanola je dodano u kapima suspenziji ćelija, pomiješano blagim vorteksiranjem i ostavljeno preko noći na 4 stepena. Fiksne ćelije su centrifugirane i dva puta isprane hladnim PBS-om. Ćelije su resuspendovane u 0,25 mL PBS sa dodatkom 5 μL 10 mg/mL RNKaze i inkubirane 1 h na 37 stepeni. Zatim je dodano 10 μL 1 mg/mL propidijum jodida (PI). Ćelijski ciklus je analiziran kvantifikacijom sadržaja DNK u ćelijskim populacijama u fazama G0/G1 (2n), S (između 2n i 4n) i G2/M (4n) pomoću protočnog citometra FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA , SAD).

ROS detekcija protočnom citometrijom

ROS u živim ćelijama je procijenjen pomoću Image-iT™ Live Green Reactive Oxygen Species Detection Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Ukratko, ćelije su isprane u PBS nakon uklanjanja podloge za kulturu i dodano je 2 mL 100 μM radne otopine terc-butil hidroperoksida (TBHP). Nakon inkubacije na 37 stepeni u trajanju od 1 h, radni rastvor TBHP je uklonjen, a ćelije su nežno isprane 3 puta u toplom Dulbecco-ovom fiziološkom puferu sa fosfatom (DPBS; Gibco). Ćelije su zatim inkubirane u radnoj otopini od 25 μM 5-(i-6)-karboksi-2,7-dihlorodihidro-fluorescein diacetata (karboksi-H2DCFDA) na 37 stepeni 30 minuta u mraku . Kada se oksidira, karboksi-H2DCFDA emituje zelenu fluorescenciju, olakšavajući procjenu ROS-a protočnom citometrijom. Kao pozitivna kontrola korišten je TBHP, koji je induktor proizvodnje ROS. Jezgra ćelija su obojena Hoechst 33342. Nakon 3 puta ispiranja sa PBS, ćelije su sakupljene tripsinizacijom, suspendovane u PBS i korištene za detekciju ROS pomoću protočnog citometra FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, SAD ). Brzina formiranja ROS-a izračunata je dijeljenjem broja ROS pozitivnih ćelija sa ukupnim brojem ćelija i pretvaranjem vrijednosti u procente.

Analiza apoptoze protočnom citometrijom

Analiza apoptoze je izvedena korišćenjem Vybran1 Apoptosis Assay Kit #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Ukratko, ćelije su sakupljene tripsinizacijom i isprane 2 puta hladnim PBS-om. Nakon toga, ćelijama je dodato 100 μL 1× pufera za vezivanje aneksina, 5 μL Alexa Fluor 488 aneksina V i 1 μL PI. Nakon inkubacije od 15 minuta na sobnoj temperaturi, dodano je 400 μL 1 x pufera za vezivanje aneksina i ćelijska suspenzija je lagano pomiješana. Aneksin V, koji je protein koji veže fosfolipide o Ca2 plus, ima visok afinitet za fosfatidilserin (PS). U živim ćelijama, PS se nalazi na unutrašnjoj citoplazmatskoj membrani i translocira se na vanjsku citoplazmatsku membranu u apoptotičkim stanicama. Apoptotične ćelije se razlikuju po Aneksinu V označenom Alexa Fluor 488 koji se vezuje za PS na vanjskoj membrani. Osim toga, PI, koja je boja koja vezuje nukleinsku kiselinu, boji nekrotične stanice crvenom fluorescencijom. Stoga su apoptotičke ćelije sa zelenom fluorescencijom, nekrotične ćelije sa crvenom fluorescencijom i žive ćelije sa malo ili bez fluorescencije u ćelijama analizirane korišćenjem FACS Calibur protočnog citometra (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornija, SAD). Stope su izračunate dijeljenjem broja ćelija živih, nekrotičnih ili apoptotičkih ćelija sa ukupnim brojem ćelija i pretvaranjem izračunatih vrijednosti u procente.

Sakupljanje in vivo zrelih oocita

Da bi se otkrila ovulacija kod svakog psa, izmjerena je koncentracija progesterona u serumu (P4) korištenjem DSL-3900ACTIVE progesterona obloženog radioimunoesay kompleta (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, SAD). Kao što je prethodno opisano [39, 40], dan kada je koncentracija P4 premašila 4 ng/mL smatran je danom ovulacije. 72 h nakon ovulacije, oocite su izvađene laparotomijom aseptičnim hirurškim procedurama. Fimbriji jajovoda se pristupilo kroz burzalni prorez i kanulirano pomoću čelične igle sa invertiranom prirubnicom (18 gauge, 7,5 cm). Intravenski (IV) kateter od 24 kalibra (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seul, Koreja) umetnut je u isthmus jajovoda blizu uterotubalnog spoja, a medij 199 (Gibco) dopunjen je 1 posto penicilina-streptomicina i 5% FBS je uveden u jajovod kroz IV kateter. Oociti su odmah transportovani u laboratoriju. Ukupno je prikupljeno 316 oocita od 31 psa.

Prenos nuklearne ćelije somatskih ćelija i transfer embriona SCNT izvedeni su kao što je prethodno opisano [39]. Ukratko, da bi se uklonile kumulusne ćelije iz in vivo zrelih oocita, kumulus-oocit-kompleksi (COC) su ponavljano pipetirani u 0.1 posto hijaluronidaze. Prvo polarno tijelo i hromozomi metafaze-II uklonjeni su aspiracijom. Enukleacija je potvrđena bojenjem sa Hoechst 33342 (bisbenzimid). Fibroblasti fetusa pasa su tretirani sa 30 μM akteozida tokom 48 sati, a zatim sakupljeni sa 0.25 posto tripsina-EDTA. Jedna ćelija, koja ima glatku ćelijsku membranu, prebačena je u perivitelinski prostor svake enukleisane jajne ćelije. Distihovi su bili ekvilibrirani medij za infuziju, a to je 0.26 M manitol medij koji sadrži 0.1 mM HEPES, 0,5 mM MgSO4 i 0.05 posto BSA, i fuzioniran pomoću dva impulsa jednosmerne struje (69–75 V za 15 μs) iz aparata Electro-Cell Fusion (NEPA gene Co., Chiba, Japan). Ovi kupleti su inkubirani u mediju 199 sa dodatkom 10% FBS tokom 1 h 30 min. Stopljeni SCNT embrioni su provjereni i kemijska aktivacija je izazvana inkubacijom u 10 μM kalcijum jonoforu (proizvod br. C7522, Sigma) u trajanju od 4 min. SCNT embrioni su isprani, a zatim stavljeni u modifikovani sintetički jajovodni fluid (mSOF) [41] koji sadrži 1,9 mM 6-dimetilaminopurina (6-DMAP) na 3 h i 30 minuta. Konstruisani embrioni su hirurški prebačeni u jajovode surogata sinhronizovanih sa estrusom u roku od 4 h nakon SCNT-a. Trudnoća je potvrđena ultrazvukom 26 dana (najranije) nakon transfera embriona.

aktivni sastojakacteosideincistanche

In vitro kultura kloniranih embriona

Nakon SCNT-a, klonirani embrioni su uzgajani u 40 μL mikro kapi modificiranog sintetičkog jajovodnog fluidnog medija (mSOF) (10 kloniranih embriona po mikrokapi) prekrivenog mineralnim uljem na 38,5 stupnjeva u 5 posto CO2 i 95 posto zraka. Razvoj SCNT embriona posmatran je od 2. do 8. dana.

Mikrosatelitska i mitohondrijska DNK analiza kloniranog psa

Ukupna DNK je ekstrahirana iz ćelija nuklearnih donora i kože pasa donora oocita, surogatnih pasa i kloniranog psa pomoću G-spin™ kompleta za ekstrakciju genomske DNK (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Koreja) prema uputama proizvođača, a zatim je eluiran u 100 μL TE pufera (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). Količina DNK je izmjerena BioSpec-nano spektrofotometrom (Shimadzu Corp., Japan).

Za mikrosatelitsku genotipizaciju odabrano je sljedećih 7 specifičnih gena: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 i FH2079. PCR je izveden sa početnom denaturacijom u trajanju od 10 minuta na 95 stepeni, 20 ciklusa koji se sastoje od denaturacije od 30 sekundi na 95 stepeni, 30 sekundi žarenja na 58 stepeni (-0.1 stepen/ciklus), 1 min ekstenzije na 72 stepena i još 15 ciklusa koji se sastoje od denaturacije u trajanju od 30 sekundi na 95 stepeni, 30 sekundi žarenja na 56 stepeni, 1 min ekstenzije na 72 stepena i konačnog produženja na 72 stepena u trajanju od 10 minuta.

Za sekvenciranje mitohondrijske DNK, koristeći kompletne nukleotidne sekvence pseće mtDNK (GenBank pristupni broj: U96639), sintetizirani su sljedeći oligonukleotidni prajmeri: regija citokroma b (L14,252 –L14,631) F: ACTCATTAGGATTGGATTGCATCAGCCATGGATTGGATCGCCAGGCATTGCATTGCATTGCATTGGCG Podjedinica citokrom c oksidaze II (L7,054—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S rRNA (L2,033 –L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; Region D-petlje (L15,622 – L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. PCR ciklusi za ovu analizu uključivali su: početne denaturacije od 95 stepeni u trajanju od 5 minuta, 5 ciklusa denaturacije u trajanju od 30 sekundi na 95 stepeni, 40 sekundi žarenja na 60 stepeni (-1 stepen/ciklus), 1 min ekstenzije na 72 stepena, i narednih 30 ciklusa denaturacije u trajanju od 30 sekundi na 95 stepeni, 40 sekundi žarenja na 55 stepeni, 1 min ekstenzije na 72 stepena i konačnog produženja na 72 stepena u trajanju od 10 minuta. PCR fragmenti iz različitih eksperimenata analizirani su pomoću ABI Prism 3100 genetskog analizatora (Applied Biosystems Inc., SAD). Sklapanje sekvence, višestruka poravnanja i obrezivanje poravnanja za kontrolne regije izvedeni su uz BioEdit softver (v.7.0.5.3).

acteosideincistanchemože ojačati imuni sistem