Dio 1:Ehinakozid štiti od MPP plus -indukovane neuronske apoptoze putem ROS/ATF3/CHOP regulacije puta

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

Molimo kliknite ovdje do 2. dijela

vrste (ROS) također doprinose njegovom razvoju [3]. Karakteristike slične PD mogu biti izazvane nekoliko toksina iz okoline, uključujući 1-metil-4-fenil- 1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP), cijanid, ugljični disulfid, i toluen. MPTP se široko koristi za indukciju životinjskih modela PD, a njegov aktivni metabolit, 1-metil-4- fenilpiridinijum jon (MPP?), koristi se u ćelijskim modelima PD [4, 5]. MPP? selektivno inhibira lanac transporta elektrona i rezultira prekomjernom proizvodnjom ROS-a, izazivajući tako neuronsku smrt i sindrom sličan PD [6]. Nedavne studije su pokazale da MPP? inducira više puteva u in vitro PD modelu, uključujući povećanu fosforilaciju GSK3B (pY206) i akumulaciju a-sinukleina [5], pojačanu regulaciju heme oksigenaze-1/ni-nikotinamid adenin dinukleotid fosfat oksidaze/ROS [7, 8], povećana ekspresija aktivnog transkripcionog faktora 3 (ATF3) i zaustavljanje rasta putem 153 (GADD153)/C/EBP-homolognog proteina (CHOP) inducibilnog oštećenja DNK [9]. U kliničkom liječenju, supresija ROS produkata je jedna od najvažnijih strategija za preživljavanje neurona i liječenje PD [1].

Echinacoside(ECH, sl. 1A), prirodnifeniletanoidkoji se nalazi u mnogim ljekovitim biljkama, glavni je sastojakfeniletanoidglikozidiizolovan od tradicionalne kineske biljke,Cistanchesalsa [10]. Zanimljivo, nedavna istraživanja su to pokazalaECHima zaštitne efekte u mišjem modelu PD izazvanog MPTP-om [10, 11].ECHtakođer ublažava apoptozu ćelija neuroblastoma indukovanu faktorom tumorske nekroze-a ili 6-hidroksidopaminom in vitro [12, 13]. Međutim, mehanizmi pomoću kojihECHpromoviše preživljavanje neurona u MPP-induciranom modelu PD stanica ostaju nejasni.

Pokazali smo toECHznačajno smanjio ROS proizvode izazvane MPP? u SH-SY5Y ćelijama.ECHtakođe inhibirao MPP?-indukovanu ekspresiju ATF3, CHOP i a-sinukleina, kao i potiskivanje aktivacije pro-apoptoznih proteina kaspaze-3 i poli (ADP-riboza) polimeraze (PARP).

Cistancheechinacosideimaneuroprotektivniefekti

Materijali i metode

Reagensi

Dulbeccov minimalni esencijalni medij (DMEM), fetalni goveđi serum, 0.25 posto tripsina, 1 posto penicilina/streptomicina i TRIzol reagens su iz Life Technologies (Grand Island, NY). Kromatinska boja bisbenzimid (Hoechst 33342), poli-L-lizin, MPP? jodid i MPTP su iz Sigme (St. Louis, MO). Komplet za analizu malondialdehida (MDA) peroksidacije lipida i dihlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) su iz Beyotime Biotech (Haimen, Kina). ECH čistoće C98 posto je iz Push Biotechnology (Chengdu, Kina).

Životinje i tretmani

Održavanje i tretmani životinja bili su kao što je prethodno opisano [14]. Koristili smo mužjake miševa C57BL/6 (Shanghai Laboratory Animal Co., Šangaj, Kina) težine 24–26 g u dobi od 10 sedmica. Životinje su držane u standardnim uslovima (12:12 h svetlo: ciklus tame, 21 ± 2C i relativna vlažnost 40 procenata) i dozvoljen im je pristup hrani i vodi ad libitum. Sve procedure su odobrene od strane Etičkog komiteta za životinje bolnice Zhongshan, Univerziteta Fudan, i sprovedene u skladu sa vodičem Nacionalnog instituta za zdravlje za njegu i upotrebu

Laboratorijske životinje.

Miševi su nasumično podeljeni u četiri grupe (10 miševa/grupa): grupa A, kontrolna grupa sa vehikulumom, kojoj je data jednaka zapremina (500 lL) normalnog fiziološkog rastvora (NS); grupa B, ECH kontrolna grupa, dato 20 mg/kg ECH; grupa C, grupa MPTP modela, prethodno tretirana jednakim volumenom NS; i grupa D, grupa tretirana ECH, prethodno tretirana sa 20 mg/kgECH. ECHje rastvoren u NS i isporučen intragastričnom primenom svaka 24 h tokom 15 uzastopnih dana. Mišji PD model za grupe C i D generiran je pet uzastopnih intraperitonealnih injekcija od 30 mg/kg MPTP svaka 24 h od 11. do 15. dana. Miševi su ubijeni cervikalnom dislokacijom ili perfuzijom narkotizom 10 posto hloralhidrata (3,6 mg/ kg) intraperitonealno 24 h nakon završnog tretmana.

Perfuzija i obrada tkiva su kao što je prethodno opisano [14]. Nakon intrakardijalne perfuzije, uzorci mozga su sakupljeni i fiksirani u 4 posto paraformaldehida 24 h na 4C, ugrađeni u parafin i koronalni dijelovi koji obuhvataju cijeli SNc (stereotaksične koordinate anteroposteriorne {{5}{7}}.64 do {{5}{7}}.64. mm u odnosu na bregmu) su izrezani na 5 lm.

Još 5 životinja iz svake grupe ubijeno je dislokacijom vrata maternice, a ventralni srednji mozak je brzo liziran u 1 posto SDS pufera za lizu na ledu. Nivoi CHOP i ATF3 proteina u lizatu analizirani su Western blottingom.

kidney injury and disease

Cistancheechinacosideima efekat okrepljenjabubreg

Kultura ventralnog srednjeg mozga pacova (VM)

Dopaminergički neuroni

Trudne pacove Wistar kupljene su od Shanghai Laboratory Animal Co. (Šangaj, Kina). DA neuroni u VM izolovani su 14. embrionalnog dana. VM je seciran i obrađen za uspostavljanje primarnih VM DA neuronskih kultura kao što je prethodno opisano [15, 16]. Ukratko, komadići tkiva su sakupljeni u ledeno hladnom Hanksovom balansiranom rastvoru soli (HBSS) i centrifugirani na 1000 rpm na 4C tokom 5 minuta. Peleta tkiva je inkubirana u 750 lL 0,1% tripsina-HBSS tokom 15 minuta na 37C sa 5% CO2. Fetalni teleći serum (FCS; 750 lL) korišten je za inaktivaciju tripsina, a tkiva su razdvojena nježnom trituracijom

korištenjem sterilizirane Pasteurove pipete. Suspenzije ćelija su centrifugirane na 1000 rpm 4 min na 4C i ponovo suspendovane u medijumu za diferencijaciju (Dulbecco-ov modifikovani Eagleov medijum/F12, 33 mmol/L D-glukoze, 1 procenat L-glutamina i 1 procenat FCS, dopunjen sa 2 procenta FCS B27). Ćelije su posađene na pločice za kulturu tkiva obložene poli-D-lizinom (Sigma) 24-jažicom na 5 9 104 ćelija/jažici u 500 lL medijuma za diferencijaciju na 37C sa 5% CO2 tokom 10 dana da bi se razvile u

zreli DA neuroni. VM DA neuroni su bili okarakterisani imunofluorescencijom sa anti-b-tubulin izotip III antitijela i antitijela na tirozin hidroksilazu (TH) (slika S1). Ćelije su tretirane sa 1 mmol/L MPP?, 40 LG/mL ECH, kombinacijom MPP? i ECH, ili samo PBS kao kontrola. Vijabilnost ćelija je analizirana sa CCK-8 reagensom nakon 96 h tretmana.

i predstavljeni su kao srednja vrijednost ± SD (n {{0}}; **P \0.01 naspram kontrole, #P \ 0,05, ##P \0,01 vs MPP ? tretman). C Svjetlosne mikroskopske slike morfoloških promjena izazvanih MPP? ili MPP? i ECH. a, PBS kontrola; b, 40 lg/mL ECH; c, 1 mmol/L MPP?; d, 1 mmol/L MPP? i 10 lg/mL ECH; e, 1 mmol/L MPP? i 20 lg/mL ECH; f, 1 mmol/L MPP? i 40 lg/mL ECH (skala bar, 200 lm).

11-

Cistanche echinacoside ima učinak inhibicije apoptoze

SH-SY5Y Ćelijska kultura

SH-SY5Y ćelije su iz Banke ćelija Šangajskog instituta za ćelijsku biologiju (Kineska akademija nauka, Šangaj, Kina) i uzgajane u DMEM sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma, 100 U/mL penicilina i 100 U/mL streptomicina. Ćelije su održavane u vlažnom inkubatoru na 37°C opskrbljenom 5 posto CO2. MPP? je rastvoren u sterilnoj vodi i odmah upotrebljen. ECH je otopljen u PBS. Da bi se istražila ekspresija gena vezana za ROS i nivoi proteina, ćelije su zasijane u 6-ploče sa bunarima i kultivisane 24 h. Ćelije su zatim hranjene svježim medijumom koji je sadržavao MPP?, ECH, kombinaciju MPP? i ECH, ili samo PBS kao kontrola. Nakon 24 h tretmana, ćelije su lizirane sa 1% SDS pufera za lizu (1% SDS, 25 mmol/L EDTA, 45 mmol/L Tris-HCl, pH 6,5) za Western blot analizu, a ukupna RNK je izolovana direktno sa TRIzol reagens.

Za analizu distribucije ATF3 i CHOP nakon tretmana, korišteni su kompleti reagensa za nuklearnu i citoplazmatsku ekstrakciju (Thermo Fisher, Waltham, MA) za ekstrakciju citoplazmatskih i nuklearnih frakcija iz stanica tretiranih lijekom i kontrolnih stanica.

Ispitivanje vitalnosti ćelija

SH-SY5Y ćelije su posađene u 96- ploče sa bunarima i inkubirane preko noći. Ćelije su hranjene svaka 24 h svježim kompletnim medijumom koji je sadržavao različite lijekove i održavane 3 dana. Zatim je procijenjena održivost korištenjem kompleta za brojanje ćelija CCK8 (Dojindo, Japan). Podaci su normalizovani na rezultate PBS kontrole i predstavljeni su kao srednja vrednost ± SD. Da bi se analizirala održivost u ATF3-nokdaunu SH-SY5Y (ATF3 shRNA) i kontrolnim (GFP shRNA) ćelijama, ćelije su dodane u 96-ploče sa bunarima i uzgajane 14-16 h. ATF3 shRNA ili GFP shRNA plazmidi su transficirani u SH-SY5Y ćelije koristeći Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Ćelije su tretirane sa 1 mmol/L MPP? ili jednaku zapreminu PBS-a nakon 24 h transfekcije, a zatim su inkubirani 3 dana. Broj ćelija se brojao svaki dan. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD.

shRNA konstrukcije i oligo prajmeri

pGV298-ATF3 shRNA (ATF3shRNA) i GFP kontrolni shRNA konstrukti su iz GeneChem Co. (Šangaj, Kina). Ciljna sekvenca ATF3 bila je 50-GCAAAGT G!CCGAAACAAGA-30 iz prethodno opisanih metoda [17, 18]. Da bi se otkrila ekspresija gena indukovana MPP?, za qRT-PCR su odabrani geni povezani sa ROS stresom i PD, a GAPDH je korišten kao kontrola. Svi prajmeri su sintetizovani od strane Sangon Biotech Co. (Šangaj, Kina), a sekvence prajmera su navedene u tabeli 1.

PCR u realnom vremenu

Ukupna RNK ekstrahirana je TRIzol reagensom prema uputama proizvođača. Reverzna transkripcija i kvantitativni PCR u realnom vremenu (qRT-PCR) izvedeni su kao što je prethodno opisano. Reakcija reverzne transkripcije izvedena je korištenjem kompleta RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific, Waltham, MA) prema uputama proizvođača. SYB Premix Ex Taq II komplet (TaKaRa, Dalian, Kina) je korišten za qRT-PCR: 20-lL reakcioni sistemi su korišteni sa ABI (Life Technologies, Carlsbad, CA). PCR parametri su se sastojali od sledećih koraka: 95C tokom 3 min, 1 ciklus; 95C za 5 s i 60C za 40 s, 40 ciklusa. Konačni podaci bili su nor-

moralizirani u GAPDH i predstavljeni su kao odnos prema kontroli. Prajmeri koji se koriste za ampliﬁkaciju navedeni su u tabeli 1.

Western blotting

Western blot analiza je izvedena kao što je prethodno opisano [19]. Primarna antitela bila su protiv cijepanja kaspaze 3 i p53 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-GAPDH (Proteintech Group, Chicago, IL), anti-GADD153/CHOP (Wanlei Bio, Shenyang, Kina) i anti- ATF3, anti-PARP, anti-PUMA i anti-histon 3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Sekundarna antitijela označena peroksidazom rena su iz Jackson Immune Research Laboratories (Western Grove, PA). PVDF membrane su iz EMD Millipore (Billerica, MA), a ECL supstrat iz CWBio (Suzhou, Kina). Relativni nivoi proteina na osnovu nivoa sive boje sa slike analizirani su pomoću Tanon GIS softvera (Tanon Biotech, Šangaj, Kina), a podaci su predstavljeni kao odnos ciljnog proteina prema GAPDH.