DIO 1 Ehinakozid izaziva vazorelaksaciju plućne arterije štakora otvaranjem NO-cGMP-PKG-BKCa kanala i smanjenjem unutarćelijskog Ca2 plus nivoa

Kako ehinakozid izaziva vensku relaksaciju?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri- li GE1, 2, * 1 Odsjek za farmakologiju, School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, Kina; 2 Istraživački centar za medicinu na velikim nadmorskim visinama, Medicinski fakultet Univerziteta Qinghai, Xining 810001, Kina; 3 Farmaceutski fakultet, Univerzitet za nacionalnosti Qinghai, Xining 810007, Kina; 4 Qinghai Biro za ulazno-izlaznu inspekciju i karantin, Xining 810001, Kina

Cilj:Trajna plućna vazokonstrikcija koja se javlja na velikoj nadmorskoj visini može dovesti do plućne hipertenzije (PH). Glavna svrha ove studije je istražiti vazorelaksantno djelovanjeechinacoside(ECH), feniletanoidni glikozid iz tibetanske biljke Lagotis brevituba Maxim iCistanche tubulosa, na plućnu arteriju i njen potencijalni mehanizam.

Metode:Prstenovi plućne arterije dobijeni od mužjaka Wistar pacova suspendirani su u komore organa ispunjene Krebs-Henseleit otopinom, a izometrijska napetost je mjerena pomoću pretvarača sile. Intracelularni nivoi Ca2 plus mjereni su u kultiviranim ćelijama glatkih mišića plućne arterije (PASMC) štakora korištenjem Fluo 4-AM.

Rezultati: ECH(30-300 μmol/L) relaksirane plućne arterije štakora koje su prethodno kontrahirane noradrenalinom (NE) na način ovisan o koncentraciji, a ovaj efekat se mogao primijetiti i u intaktnom endotelu i u endotelnom denudiranim prstenovima, ali sa značajno nižim maksimalnim odgovorom i viši EC50 u prstenovima bez endotela. Ovaj efekat su značajno blokirali L-NAME, TEA i BaCl2. Međutim, IMT, 4-AP i Gli nisu inhibiraliECH-indukovano opuštanje. U ekstracelularnim uslovima bez Ca2 plus, maksimalna kontrakcija je smanjena na 24,54 procenata ±2,97 procenata i 10,60 procenata ±2,07 procenata u prstenovima tretiranim sa 100 i 300 μmol/L ECH, respektivno. U uslovima ekstracelularnog priliva kalcijuma, maksimalna kontrakcija je smanjena na 112,42 procenata ±7,30 procenata, 100,29 procenata ±8,66 procenata i 74,74 procenata ±4,95 procenata u prstenovima tretiranim sa 30, 100 i 300 μmol/L respektivno Nakon što su ćelije napunjene Fluo 4-AM, srednji intenzitet fluorescencije bio je niži u ćelijama tretiranim saECH(100 μmol/L) nego sa NE.

zaključak: ECHpotiskuje NE-indukovanu kontrakciju plućne arterije pacova smanjenjem intracelularnog Ca2 plus nivoa i inducira njeno opuštanje kroz NO-cGMP put i otvaranje K plus kanala (BKCa i KIR).

Ključne riječi:tibetanska biljka;echinacoside; plućna hipertenzija; velika visina; vazorelaksacija; NE; BKCa; KIR; arterijski prsten; glatkih mišićnih ćelija plućnih arterija.

Za više informacija kontaktirajte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola ima mnogo efekata, kliknite ovde da saznate više

Uvod

Trajna plućna vazokonstrikcija koja se javlja na velikoj nadmorskoj visini može dovesti do plućne hipertenzije (PH) i medijalne hipertrofije[1], koje su identificirane kao glavni uzrok hipertrofije desne komore i zatajenja srca[2]. Pojedinci koji žive na velikoj nadmorskoj visini, privremeno ili trajno, mogu imati blagu do umjerenu plućnu hipertenziju, a oni s većom osjetljivošću na hipoksiju mogu imati pretjeranu plućnu vazokonstrikciju, što dovodi do različitih bolesti na velikim nadmorskim visinama koje su povezane sa značajnim morbiditetom i smrtnošću, kao što je npr. visinski plućni edem i srčana oboljenja[3].Echinacoside(ECH) (Slika 1) je afeniletanoid glikozidnalazi se u raznim kineskim biljkama kao što je tibetanska biljka Lagotis brevituba Maxim iCistanche tubulosa[4, 5]. Lagos brevituba Maxim je vrsta Lagotis spp koja pripada Scrophulariaceae i raste široko na nadmorskoj visini preko 3000 metara na Qinghai-Tibetskoj visoravni.ECHima različite poželjne farmakološke karakteristike, kao što su antioksidativna, protuupalna, neuroprotektivna, hepatoprotektivna i svojstva uklanjanja radikala dušikovog oksida (NO)[6]. Takođe može izazvati relaksaciju zavisnu od endotela u prstenovima torakalne aorte pacova i izlečiti kardiovaskularne bolesti[7]. Međutim, koliko nam je poznato, nije postojala studija koja bi istraživala njegove učinke na vaskularni tonus u plućnim arterijama. Svrhe ove studije su sljedeće: (1) istražiti izaziva li ECH in vitro vazorelaksaciju u plućnim arterijama štakora koji su prethodno kontrahirani noradrenalinom (NE), i da li je ovaj efekat, ako postoji, ovisan o endotelu ili djeluje direktno na glatke mišiće krvnih žila ; (2) da se ispita efekat ECH na ekstracelularni priliv kalcijuma i intracelularno oslobađanje kalcijuma u ćelijama glatkih mišića plućne arterije štakora (PASMCs); i (3) da se identifikuju mogući putevi i K plus kanali uključeni u relaksaciju izazvanu ECH.

materijali i metode

Reagensi

ECH je ljubazno obezbedio dr Peng-fei TU sa Univerziteta u Pekingu (Peking, Kina), sa čistoćom od više od 98 procenata utvrđenom tečnom hromatografijom visokih performansi. Dimetil sulfoksid (DMSO) je kupljen od Solar Science & Technology Co, Ltd (Peking, Kina); NE, acetilholin (ACh, veći ili jednak 99 posto), indometacin (IMT), Nω -Nitro-L-arginin metil ester hidrohlorid (L-NAME), tetraetilamonijum hlorid (TEA), barijum hlorid (BaCl2), {{ 9}}aminopiridin ({{10}}AP), i glibenklamid (Gli) iz Sigma Chemical Co (St Louis, MO, SAD); visokoglukozni Dulbecco modifikovani Eagleov medijum (DMEM), fetalni goveđi serum (FBS) i tripsin od Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, SAD); mišje anti-pacovsko primarno antitijelo na aktin glatkih mišića (-SMA) i kozje anti-mišje sekundarno antitijelo iz Boshide Biotech Co, Ltd (Wuhan, Kina); Fluo Calcium Indicators (Fluo 4-AM) iz Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, USA); i sve anorganske soli iz Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Peking, Kina). IMT je otopljen u DMSO i 5 posto NaH2PO4, Gli, Fluo 4-AM i ECH su otopljeni u DMSO, a svi ostali reagensi su otopljeni u Krebs-Henseleit (KH) ili PBS otopini. Preliminarni eksperimenti su pokazali da DMSO sa manje od 0,1 posto (v/v) nema efekta na razvoj napetosti izolovanih plućnih arterijskih prstenova.

Eksperimentalne životinje

Sve procedure i protokoli odobreni su od strane Komiteta za negu i upotrebu životinja Medicinskog fakulteta Univerziteta Qinghai. Mužjaci Wistar štakora, stari 6-8 sedmica, 250-300 g tjelesne težine, kupljeni su od Centra za životinje Univerziteta Lanzhou (Lanzhou, Kina) i održavani su na standardnoj laboratorijskoj ishrani i vodi iz slavine ad libitum na temperaturi okoline od 22±. 2 stepena i relativna vlažnost od 45 do 55 procenata tokom eksperimenata.

In vitro perfuzija plućne arterije

Priprema prstenova plućnih arterija pacova

Pacovi težine 250–300 g su anestezirani intraperitonealnom injekcijom natrijum pentobarbitala (40 mg/kg), a zatim su im srca i pluća uklonjeni i odmah uronjeni u ledeno hladan rastvor KH koji sadrži (u mmol/L) : 118 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4·7H2O, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3 i 11,1 glukoze (pH 7,4). Intrapulmonalne arterije (0,7-1,5 mm u promjeru) su secirane bez okolnog vezivnog tkiva i adventicije, a zatim izrezane na prstenove od približno 2-3 mm dužine. Prstenovi su suspendovani u komorama za organe napunjene sa 10 mL rastvora KH na 37 stepeni i gasovitim sa 95 procenata O2–5 procenata CO2 [8], a izometrijska napetost je merena pomoću pretvarača sile (JH-2, Space Medico -Inženjerski institut, Peking, Kina)

Procjena aktivnosti žilnog prstena i procjena funkcije endotela

Prstenovi su ostavljeni da se uravnoteže 2 h pod bazalnom tenzijom od 400 mg, za koje vrijeme se otopina KH mijenja svakih 15 minuta; zatim je 1 μmol/L NE dodat u komoru da se proceni aktivnost svakog prstena detektovanjem procenta kontrakcije. Prije i nakon eksperimentalnog protokola mjeren je postotak kontrakcije (Slike 2A i 2B). Endotel je u nekim prstenovima uklonjen blagim trljanjem površine intime finom čeličnom žicom, a integritet je kvalitativno ocjenjivan stepenom relaksacije uzrokovane ACh (10 μmol/L) u procentu kontraktilnog tonusa izazvanog NE (1 μmol/L). Ako je relaksacija sa ACh bila veća od 80 posto, endotel je ostao u dobrom stanju; ako je relaksacija bila manja od 30 posto, endotel je uništen (Slike 2A i 2B)[9].

Izolacija i kultura PASMC pacova

Distalne plućne arterije su izolirane iz plućnih režnjeva pacova, a endotel i adventicija su pažljivo uklonjeni. Nakon što su tkiva usitnjena na komadiće od {{0}} mm, odmah su dodana u tikvice, održavana na 37 stepeni i 5 posto CO2 u vlažnom inkubatoru otprilike četiri sata, a zatim kultivirana sa DMEM sa visokim sadržajem glukoze. dopunjen sa 20 posto FBS, 100 U/mL penicilina i 100 U/mL streptomicina otprilike pet dana. Polovina medijuma za kulturu je zamenjena svežom podlogom kada su se ćelije pojavile. Kada su ćelije dostigle 80 posto konfluencije, sakupljene su sa 0,125 posto tripsina i zasijane u tikvice (omjer 1:2) koje su sadržavale DMEM s visokim sadržajem glukoze i dodatkom 10 posto FBS, 100 U/mL penicilina i 100 U/mL streptomicina. . Za sve eksperimente korištene su ćelije sa tri do osam prolaza.

Identifikacija PASMC imunohistohemijom

PASMC su bili pozitivni na imunohemijsko bojenje kada su uočene tipične karakteristike "brda i doline". Ćelije su posađene u 6-ploče sa staklenim pokrovnim stakalcima. Kada su ćelije dosegle 80 posto konfluencije, fiksirane su u 4 posto paraformaldehida, blokirane sa 3 posto vodonik peroksida 15 minuta, a zatim inkubirane s mišjim anti-pacovskim primarnim -SMA antitijelom preko noći na 4 stepena. Nakon što su tri puta isprane u PBS-u po 10 minuta, ćelije su inkubirane sa kozjim anti-mišjim sekundarnim antitelom na sobnoj temperaturi tokom 45 minuta, ponovo tri puta isprane u PBS-u tokom 10 minuta i vizualizovane sa diaminobenzidinom.

Detekcija intracelularne koncentracije kalcija u PASMC pacova

PASMC su posađene u {{0}}ploče sa staklenim pokrovnim stakalcima. Kada su ćelije dostigle 80 posto konfluencije, medij za kulturu je zamijenjen DMEM-om bez seruma. Dvadeset četiri sata kasnije, ćelije su napunjene sa 7 μmol/L Fluo 4-AM na 37 stepeni tokom 30 min u vlažnoj atmosferi od 5 posto CO2. Preostala boja je isprana Hanksovim rastvorom balansirane soli (HBSS) koji sadrži sledeće (u mmol/L): 1,26 CaCl2, 0.49 MgCl2·6H2O, 0.41 MgSO4·7H2O, 5,33 KCl, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHCO3, 137,93 NaCl, 0,34 Na2HPO4 i 5,56 D-glukoza, bez fenol crvenog. Ćelije napunjene Fluo 4-AM bile su izložene jednom od tri uslova tretmana: (1) kontrolna grupa (con grupa), u kojoj su ćelije inkubirane sa DMEM bez seruma; (2) NE grupa, u kojoj su ćelije inkubirane sa DMEM bez seruma sa dodatkom 1 μmol/L NE tokom 10 minuta; i (3) NE plus ECH (100 μmol/L) grupa (NE plus ECH100 grupa), u kojoj su ćelije inkubirane sa DMEM-om bez seruma dopunjenom sa 1 μmol/L NE tokom 10 minuta i 100 μmol/L ECH za 20 min. Intenzitet fluorescencije je uočen i fotografisan fluorescentnom mikroskopijom (IX71, Olympus, Tokyo, Japan)[11]. Za svaki uzorak prikupljeno je šest vidnih polja (200×). Intracelularna koncentracija kalcija je kvantificirana mjerenjem srednjeg intenziteta fluorescencije korištenjem softvera Image Pro-Plus 6.0.

Statistička analiza

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost±SD. Kada je odgovarajuća, značajna razlika procijenjena Dunnett-ovim testom ili Student-Newman-Keulsovim testom za višestruka poređenja nakon jednosmjerne analize varijanse (ANOVA). Nivo vjerovatnoće P<0.05 was="" considered="">

Rezultati Vasorelaksantni efekti ECH na izolovanu plućnu arteriju

Na početku eksperimenta, kumulativni dodatak ECH od 30 do 300 μmol/L nije imao značajan uticaj na bazalnu napetost plućne arterije. Nakon što je vazokonstrikcija izazvana NE dostigla plato, ECH je kumulativno dodat (30-300 μmol/L) u intaktni endotel (E plus, slika 2C) ili prstenove bez endotela (E–, slika 2C). U intaktnim endotelnim prstenovima, kumulativno dodavanje ECH širi krvne žile na način ovisan o koncentraciji, uz maksimalnu

postotak opuštanja majke od 89,22 posto ±0,32 posto pri 300 μmol/L i EC50 od 51,60±0,57 μmol/L (Slike 2A i 2C). Slično, u prstenovima bez endotela, ECH je također proširio krvne žile na način ovisan o koncentraciji, ali sa značajno nižim maksimalnim odgovorom od 67,72 posto ±1,69 posto (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Učinci ECH na intracelularno oslobađanje kalcija i ekstracelularni priliv kalcija

Prstenovi bez endotela bili su izloženi 1 μmol/L NE sve dok nije postignuta maksimalna kontrakcija. U ekstracelularnim uslovima bez Ca2 plus, prstenovi su uravnoteženi u rastvoru KH bez Ca2 plus koji sadrži 0.2 mmol/L EGTA prije početka eksperimenata. Nakon tri ispiranja rastvorom KH bez Ca2 plus i EGTA, prstenovi su prethodno inkubirani sa ECH (30, 100 i 300 μmol/L) tokom 20 minuta, a zatim ponovo izloženi 1 μmol/L NE. Proizvedeno prstenje

neodržive kontrakcije koje su se brzo vratile na početnu liniju, u poređenju sa početnim kontrakcijama izazvanim NE, koje su služile kao referenca. Maksimalna kontrakcija kontrole bila je 33,27 posto ±2,94 posto (Slike 3A i 3E), ali je značajno smanjena na 24,54 posto ±2,97 posto i 10,60 posto ±2,07 posto u prstenovima prethodno tretiranim sa 100 i 300 μmol/L ECH, respektivno.<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Uloge različitih inhibitora u vazorelaksaciji plućne arterije pacova izazvanoj ECH

Vazorelaksacija plućne arterije kod štakora izazvana ECH ispitivana je u prisustvu ili odsustvu sljedećih inhibitora: L-NAME (eNOS inhibitor), IMT (inhibitor ciklooksigenaze), TEA (inhibitor Ca2 plus aktiviranog K plus kanala velike provodljivosti), BaCl2 ( unutrašnji ispravljač K plus inhibitor kanala), 4-AP (inhibitor K plus kanala zavisan od napona) i Gli (inhibitor K plus kanala osjetljiv na ATP). Prstenovi su bili maksimalno kontrahovani sa 1 μmol/L NE, a zatim L-NAME (100 μmol/L), IMT (10 μmol/L), TEA (1 mmol/L) Dodani su BaCl2 (1 mmol/L), 4-AP (1 mmol/L), odnosno Gli (10 μmol/L). Kada je dostignut novi plato, dodavan je ECH na kumulativni način od 30 do 300 μmol/L. Krivulje koncentracija-odgovor u prisustvu različitih inhibitora prikazane su na slici 4. Vazorelaksantni efekat ECH na prstenove plućne arterije kontrahirane sa 1 μmol/L NE značajno je blokiran L-NAME (100 μmol/L), TEA ( 1 mmol/L) i BaCl2 (1 mmol/L), sa maksimalnim relaksacijama od 64,41 posto ±3,20 posto, 84,38 posto ±0,70 posto, odnosno 75,27 posto ±0,93 posto (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Identifikacija PASMC pacova

At low magnification, spindle cells were densely packed, and almost all the cells were stained positively for PASMCs (the PASMC purity was >95 posto) (Slika 6A). Smeđe obojeni miofilamenti su jasno uočeni u citoplazmi pri velikom povećanju (slika 6B).

Cistancheechinacosidemogu odoletiapoptoza

Utjecaj ECH na intracelularnu koncentraciju kalcija u PASMC pacova

NE (1 μmol/L) značajno povećava koncentraciju intracelularnog kalcijuma (n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">