Dio 1: Ehinakozid povećava količinu sperme kod pacova ciljajući na hipotalamički androgenski receptor
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 i Xiaoying Zhang1,2
Molimo kliknite ovdje do 2. dijela
Muška neplodnost je glavni zdravstveni problem sa procijenjenom prevalencom od 4,2 posto muške neplodnosti širom svijeta. Naš rani rad je to pokazaoCistanche ekstraktištiti od oštećenja sperme kod miševa i toechinacoside(ECH) je jedna od glavnih aktivnih komponenti. Ovdje izvještavamo o ključnoj ulozi ECH-a, prirodnog proizvoda koji preokreće ili štiti od oligoastenospermije kod pacova. ECH je određivan HPLC, kvantitet i kvalitet sperme su procenjeni i nivoi hormona određen radio-imunosorbentnim testom. ECH je smanjio nivoe androgenih receptora (AR) i ključnih gena povezanih sa steroidogenima kao što je utvrđeno Western blot i qPCR analizom. Interakcija između ECH i AR procijenjena je indirektnom ELISA-om i molekularnim spajanjem. Rezultati pokazuju da ECH u kombinaciji sa hipotalamskim AR u džepu Met-894 i Val-713 inhibira prijenos AR iz citoplazme u jezgra u hipotalamusu. Dok je negativna povratna sprega o regulaciji polnih hormona bila inhibirana, pozitivna povratna informacija je stimulirana kako bi se povećala luteinizirajući hormon i testosteron, što je potom povećalo količinu sperme. Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da ECH blokira aktivnost AR u hipotalamusu kako bi povećao količinu sperme i zaštitio od oligoastenospermije kod pacova.
Proizvodnja testosterona u stanicama testisa snažno je regulirana osovinom hipotalamus-hipofiza-gonada (HPG) formiranjem homeostatske povratne petlje1. Hormon koji oslobađa gonadotropin (GnRH), koji luči hipotalamus, može stimulirati lučenje luteinizirajućeg hormona (LH) iz hipofize, što dalje stimulira proizvodnju testosterona u Leydigovim stanicama testisa. Testosteron se biosintetizira nizom steroidogenih enzima. Kao jedan od glavnih puteva, steroidogeni akutni regulatorni (StAR) protein može transportirati kolesterol iz intracelularnih izvora u mitohondrije2 gdje je izložen enzimu cijepanja bočnog lanca holesterola (CYP11A1), 3 -hidroksisteroid dehidrogenazi (HSD3), { {10}}hidroksilaza (CYP17A1) i 17 -hidroksisteroid dehidrogenaza (HSD 17) koje katalizuju konverziju holesterola u testosteron3,4. Testosteron se zatim negativno vraća na HPG element kako bi smanjio daljnje lučenje LH na način ovisan o dozi.
Efekat testosterona na povratnu petlju HPG ose javlja se vezivanjem za androgeni receptor (AR), koji se nalazi i u hipotalamusu i u hipofizi5. Kod miševa, ablacija AR i minimalna proizvodnja testosterona uzrokuje povećanje nivoa LH i folikulostimulirajućeg hormona (FSH), što sugerira da AR sudjeluje u regulaciji negativne petlje hranjenja. Klasični genomski mehanizam signalizacije testosterona javlja se kada testosteron difundira u ćeliju i veže se za AR. Ovaj kompleks ligand-receptor se zatim translocira u jezgro gdje se vezuje za elemente odgovora na androgene (ARE) u regulatornim regijama gena koji reagiraju na testosteron kako bi modificirali njihovu translokaciju. Testosteron također inducira neklasičan put djelovanja steroidnih hormona, karakteriziran brzim događajima koji dovode do aktivacije citosolnih signalnih kaskada koje normalno pokreću faktori rasta7,8. Klasični i neklasični putevi testosterona doprinose održavanju spermatogeneze i plodnosti. Međutim, funkcija AR je važnija u klasičnom putu jer testosteron djeluje na povećanje kvalitete sperme.
Echinacoside(ECH) je jedna od bioaktivnih komponenti dobijenih iz ljekovitih biljnih vrsta Echinacea9 iCistanche10. Sa širokim spektrom farmakoloških aktivnosti, ekstrakti ehinacee su 1 Istraživački centar moderne biotehnologije, Škola za biotehnologiju i prehrambeno inženjerstvo, Anyang Institute of Technology, Anyang, Henan, 455000, Kina. 2Koledž veterinarske medicine, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi, 712100, Kina. 3Odjel za biomedicinske nauke, Veterinarski koledž Ontarija, Univerzitet Guelph, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Kanada. Prepisku i zahtjeve za materijale treba uputiti na XZ
jedan od najpopularnijih biljnih dodataka u Europi i SAD-u uglavnom zbog svojih antioksidativnih svojstava11 i njihove sposobnosti da spriječe prehladu12. Zanimljivo,Cistanche ekstrakti i ECH se tradicionalno koriste kao tonik za liječenje reproduktivne disfunkcije i za jačanje muške seksualne aktivnosti u tradicionalnoj kineskoj medicini10. Neki OTC proizvodi odCistanche ekstrakcije su razvijene kao hranljivi suplementi i dobijaju na popularnosti na tržištima zdrave hrane Kine i nekih drugih azijskih zemalja (China Food and Drug Administration)13. Međutim, osnovni mehanizmi djelovanja ECH ostaju nejasni.
Muška neplodnost je glavni zdravstveni problem sa procijenjenom prevalencom od 4,2 posto muške neplodnosti širom svijeta14. Dijagnoza muške neplodnosti trenutno se zasniva na proučavanju kvaliteta sperme uključujući analizu parametara sjemena kao što su koncentracija, pokretljivost i morfologija sperme15. Bisfenol A koji oponaša estrogen (BPA) je široko rasprostranjeni zagađivač životne sredine koji je proučavan zbog njegovog uticaja na plodnost muškaraca kod nekoliko vrsta životinja i ljudi16. BPA remeti osovinu hipotalamus-hipofiza-gonada, inhibira ekspresiju steroidogenih enzima testisa i sintezu testosterona kod muških štenaca17, uzrokujući stanje hipogonadotropnog hipogonadizma18. U ovoj studiji istražujemo efekte ECH na kvalitet sperme i nivoe hormona. Osim toga, BPA je odabran kao model za ozljede sperme kako bi se dalje proučavao zaštitni učinak ECH protiv lošeg kvaliteta sperme.
Cistanche ekstrakti
Rezultati
ECH povećava količinu sperme. Broj spermatozoida u repu epididimisa, vitalnost spermatozoida i pokretljivost spermatozoida prikazani su u tabeli 1. Tretman sa 80 mg/kg ECH i 15 mg/kg testosteron propionata (TP) značajno je povećao broj spermatozoida epididima. Međutim, nije bilo značajne razlike u vitalnosti spermatozoida i pokretljivosti spermatozoida.
ECH povećava nivoe testosterona i LH u serumu, encefalonu plus hipofizi i testisima. ECH tretman je značajno povećao nivoe LH u serumu, encefalonu plus hipofizi i testisima (slika 1A). U ECH(H) grupi, nivoi LH su značajno povećani za 1.1-put u serumu, 14-put u encefalonu plus hipofizi i 1.2-put u testisima. Testosteron je značajno povećan za 1,5 odnosno 13-put u encefalonu plus hipofizi i testisu, respektivno, ali ne i u serumu nakon tretmana ECH(H). Nakon tretmana TP, nivoi testosterona su značajno povećani za 1,6, 1,8 i 1.{16}}put u serumu, encefalonu plus hipofizi i testisima.
ECH je povećao ekspresiju gena za steroidogene enzime. ECH je značajno povećao ekspresiju ključnih steroidogenih enzima u testisima (slika 1B). Nivoi mRNA CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 i HSD17 u ECH(H) grupi su povećani više od 3- puta, dok nivoi StAR mRNA nisu pokazali značajne razlike sa svim ECH tretmanima (p > 0.05). TP nije značajno promijenio ekspresiju CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 i HSD17. Ovo se ogleda u sveobuhvatnoj analizi toplotne mape efekta ECH na ekspresiju steroidogenih enzima koja pokazuje da je ECH značajno povećao nivoe mRNA CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 i HSD17, a posebno HSD3 1/ 2 (slika 1C).
ECH može proći krvno-moždanu barijeru i u manjoj mjeri krvno-moždanu barijeru. Da bi se procijenila androgena povratna sprega na HPG-osi, sposobnost ECH da uđe u hipotalamus procijenjena je u seriji PK studija. Koncentracije ECH su otkrivene u hipotalamusu nakon 12 h jednokratne oralne primjene 30 mg/kg ECH, a ECH je pokazao izraženu penetraciju hipotalamusa sa srednjim omjerom hipotalamus/plazma od 33,92 posto (slika 2A). Vrijednosti T1/2 bile su 2,61 ± 0,42 h i 1,88 ± 0,22 h u plazmi i hipotalamusu, respektivno (slika 2B). Međutim, vrlo ograničen pristup ECH testisu je otkriven korišćenjem HPLC. Koncentracije ECH u testisima bile su 0.083 ug/mL, 0.043 ug/mL i 0,028 ug/mL na 0,5 h, 1 h i 1,5 h nakon tretman.
ECH smanjuje translokaciju hipotalamusa AR u jezgro. Da bi se testirao efekat ECH na translokaciju AR, ekspresija AR u citoplazmi i jezgru testisa i hipotalamusa određena je primenom Western blot analize. Kao što je prikazano na slici 3A, ECH je višestruko smanjio AR protein u jezgri hipotalamusa u poređenju sa kontrolnom grupom. Tretman enzalutamidom, AR inhibitorom, smanjio je nivoe AR proteina u jezgrima hipotalamusa za 48- puta. Značajno je da je citoplazmatski AR bio veći kod tretmana ECH i tretmana enzalutamidom nego kod kontrola, što sugerira da ECH blokira transport AR iz citoplazme u jezgro u hipotalamusu. Kao što se očekivalo, ECH ne inhibira AR transport iz citoplazme u jezgro u testisu (slika 3B).
ECH je povećao ekspresiju gena povezanih s HPG osovinom. ECH je značajno povećao ekspresiju LH , LHR, GnRH 1 i Gnrhr u mešavini encefalona i hipofize, međutim, nije bilo značajne razlike u nivoima GnRH 1 nakon tretmana TP. Analiza toplotne karte pokazuje da je ekspresija GnRH 1 i LH bila najveća među genima povezanim sa HPG osovinom.
Slika 1. Utjecaj ECH na nivoe LH, testosterona i glavnih steroidogenih enzima. Napomena: (A) nivoi LH u serumu, encefalonu plus hipofizi i testisima (mIU/mL, srednja vrednost ± SD);
nivoi T u serumu, encefalonu plus hipofizi i testisima (ng/mL, srednja vrednost ± SD); (B) ekspresija glavnih steroidogenih enzima;
(C) hijerarhijsko grupisanje ekspresije mRNA različitih steroidogenih enzima u testisima. Zelena, zeleno-crvena i crvena boje predstavljaju nisko-,
srednja i visoka brojnost, respektivno, n=7. a,b,c Različita slova označavaju statistički različite grupe (p <>
Slika 2. Distribucija i farmakokinetički parametri ECH u hipotalamusu. Napomene: (A) omjer hipotalamusa/plazma (procenti) izračunati su na osnovu izloženosti plazmi i hipotalamusu ECH (koncentracija) na 0.5 h, 1.0 h, 1.5 h, 2.{101} {8}} h, 2,5 h, 3.0 h, 6.{14}} h, 9.{16}} h i 12.{18}} h nakon oralne primjene. (B) Farmakokinetički (PK) parametri ECH u plazmi i hipotalamusu. T1/2, poluživot; Cmax, vršna koncentracija; Vz/F, prividni volumen distribucije; MRT, srednje vrijeme zadržavanja; AUC, površina ispod krivulje koncentracija-vrijeme.
AR je meta ECH. Da bi se potvrdili odnosi između ECH i AR, uspješno je sintetiziran ECH-ovalbumin (ECH-OVA) (slika 5A,B). Molekularna težina ECH-OVA je veća od OVA, tako da imaju različite stope mobilnosti (slika 5A), a apsorbancijski vrh ECH-OVA je između ECH i OVA (slika 5B),
Cistanche ekstrakti
Slika 3. Utjecaj ECH na transport AR u testisima i hipotalamusu. Napomene: (A) Uticaj ECH na transport AR u hipotalamusu. Nivoi AR proteina određeni su Western blot analizom i trake predstavljaju denzitometrijsku kvantifikaciju nuklearnog AR normaliziranog na Lamin B i citoplazmatskog AR normaliziranog na GAPDH. Svaka vrijednost predstavlja srednju vrijednost ± SD šest nezavisnih eksperimenata. a,b,c Različita slova iznad traka označavaju statistički različite grupe (p < 0.05);="">B) Učinak ECH na transport AR u testisima.
što sugerira da je ECH uspješno konjugiran sa OVA. Indirektni rezultati ELISA (slika 5C) pokazuju da anti-AR antitijelo može otkriti AR protein prisutan u jamicama koje sadrže ECH-OVA (označeno anti-OVA antitijelom) što sugerira da se ECH može vezati za AR protein.
ECH se kombinuje sa AR džepom Met-894 i Val-713. Jedinjenje ECH je spojeno na AF2 mjesto na površini ljudskog AR, a teorijski način vezivanja ECH i AR prikazan je na slici 5D. Kompozicija ECH usvojila je kompaktnu konformaciju u džepu ljudskog AR-a. Dvije fenilne grupe ECH vezuju se na hidrofobnom domenu AR džepa i održavaju bliske hidrofobne kontakte sa ostacima Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737 , Met-894 i Ile-898, dok su druge dvije strane ECH bile postavljene na ulazu džepa i ostvarile samo nekoliko kontakata. Detaljna analiza je pokazala da i Met-894 (dužina veze: 2,4 Å) i Val-713 (dužina veze: 2,7 Å) formiraju vodonične veze sa hidroksil grupama ECH, što je bila glavna interakcija između ECH i ljudski AR.
ECH ublažava reproduktivna oštećenja izazvana BPA. Kako bi se istražio učinak ECH na reproduktivno oštećenje, kvalitet sperme i nivoi polnih hormona i steroidogenih enzima ispitani su kod miševa izazvanih BPA. Kao što je prikazano na slici 6, tretman BPA značajno je smanjio broj spermatozoida i pokretljivost spermatozoida za 26,5 posto i 39,2 posto, respektivno. Primena ECH-a sprečila je smanjenje broja spermatozoida i pokretljivosti spermatozoida za 35,5 procenata i 30,1 procenata, respektivno. Primena BPA je takođe rezultirala značajnim smanjenjem lučenja LH i T, a ECH je značajno povećao nivoe LH i T za 24,1 procenata i 18,3 procenata, respektivno, u poređenju sa tretmanom samo BPA (slika 6A,B). Nivoi mRNA StAR, CYP17A1, 3 -HSD i 17 -HSD u tretmanu BPA-ECH su značajno povećani u poređenju sa tretmanom BPA (slika 6C,D).
Slika 4. Promjene u ekspresiji gena povezane s HPA nakon tretmana ECH. Napomene: (A-D) trake predstavljaju nivoe mRNA LH , LHr, Gnrh 1 i Gnrhr u encefalonu plus hipofizi. a,b,c Različita slova iznad traka označavaju statistički različite grupe (p < 0.05).="" (e)="" hijerarhijsko="" grupisanje="" ekspresije="" mrna="" različitih="" steroidogenih="" enzima.="" zelena,="" zeleno-crvena="" i="" crvena="" boje="" predstavljaju="" nisku,="" srednju="" i="" visoku="" brojnost,="" respektivno,="" n="7." kontrolna="" (tretirana="" normalnim="" fiziološkim="" rastvorom="" 10="" ml/kg),="" ech(l)="" (tretirana="" sa="" ech="" 5="" mg/kg),="" ech(m)="" grupa="" (tretirana="" sa="" ech="" 20="" mg/kg),="" ech(h)="" (tretirana="" sa="" ech="" 80="" mg/kg),="" tp="" (tretirana="" sa="" tp="" 15="">
