Dio 1 Detekcija medicinskih proizvoda Cistanches Herba (Rou Cong Rong) korištenjem specifičnih nukleotidnih potpisa

Za više informacija kontaktirajte:Joanna.jia@wecistanche.com

Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1*, Zheng Zhang 1* i Shi-lin Chen 3

1 Ključna laboratorija za bioaktivne supstance i korišćenje resursa kineske biljne medicine, Ministarstvo obrazovanja, Institut za razvoj lekovitog bilja, Kineska akademija medicinskih nauka i Medicinski koledž Pekinške unije, Peking, Kina, 2 NHP istraživačka alijansa, Institut za biodiverzitet Ontarija (BIO ), Univerzitet Guelph, Guelph, ON, Kanada,

3 Ključna pekinška laboratorija za identifikaciju i procjenu sigurnosti kineske medicine, Institut kineske Materia Medica, Kineska akademija kineskih medicinskih nauka, Peking, Kina

Cistanche deserticola ima mnogo efekata, kliknite ovde da saznate više

Cistanches Herbaje ljekovita biljka koja ima svojstva detoksikacije i obično se koristi u Aziji. Zbog neravnoteže između ponude i potražnje, preljubnici se često dodaju radi zarade. Međutim, ne postoji regulatorni nadzor jer alati za kontrolu kvaliteta nisu dovoljni za identifikaciju jako prerađenih proizvoda. Tako je razvijen novi molekularni alat zasnovan na potpisima nukleotida i prajmerima specifičnim za vrstu. ITS2 regije od 251Cistanches Herbai sekvencirani su uzorci preljubih. Na osnovu SNP lokacija razvijena su četiri nukleotidna potpisa unutar 30-37 bp i šest prajmera specifičnih za vrstu, koji su validirani umjetnim eksperimentalnim mješavinama koje se sastoje od šest različitih vrsta i različitih omjera. Ova metoda je također primijenjena za otkrivanje 66Cistanches Herbaproizvode na tržištu, uključujući ekstrakte i kineske patentirane lijekove. Rezultati su pokazali korisnost nukleotidnih potpisa u identifikaciji spojeva u mješavinama. Tržišna studija je otkrila 36,4 posto falsifikata: 19,7 posto uključivalo je falsifikovanje s Cynomorium songaricum iliCistancheSinensis, a 16,7 posto uključivalo je zamjenu sa Cy. songaricum, Ci. sinensis, ili Boschniakia rossica. Rezultati su također otkrili da Cy. Songaricum je bio najčešći preljubnik na tržištu. Stoga preporučujemo upotrebu nukleotidnih potpisa specifičnih za vrstu za reguliranje falsifikovanja i provjeru osiguranja kvaliteta lanaca nabavke lijekova, posebno za prerađene proizvode čija je DNK degradirana.

Ključne riječi: Cistanches Herba, kineska patentna medicina, nukleotidni potpis, degradirana DNK, kontrola kvaliteta lijekova

UVOD

Cistanches Herba(Rou Cong Rong) je dobro poznati lijek koji je zabilježen u farmakopeji u Aziji (Kineska farmakopejska komisija, 2015; Japanska farmakopejska konvencija, 2016); ovaj lijek se dobiva od osušenih sočnih stabljikaCistanche deserticolaYC Ma iliCistanche tubulosatonik, jer nije toksičan i može se uzimati tokom dužeg vremenskog perioda (Li et al., 2016). Nadalje,CistanchesHerba je dobila čast da bude nazvana "pustinjski ginseng" zbog svoje velike ljekovite vrijednosti, posebno u jačanju muške seksualne funkcije (Zhang i Su, 2014; Gu et al., 2016). Postoji više od 100 kineskih patentiranih lijekova zabilježenih u kineskoj komisiji za farmakopeju (2015.) i drugim lokalnim službenim objavljenim standardima (Wang et al., 2012.). Kako se populacija starijih osoba povećava, postoji značajna potražnja zaCistanches Herbai njegove medicinske proizvode. Međutim, resursi sirovina postaju sve oskudniji. Zapravo, dvije izvorne vrsteCistanches Herbadodane su u crvenu knjigu o biljkama Kine kao divlje biljke zaštićene države (kategorija II) (Fu, 1991.). Ljekoviti materijali na tržištu uglavnom se uzgajaju u sjeverozapadnoj Kini.

Zbog značajne neravnoteže između ponude i potražnjeCistanchesHerba, mnogi preljubnici su ušli na tržište; ovi preljubnici nisu u skladu sa standardima i mogu ugroziti sigurnost droga. Poznati preljubnici uključuju osušene sočne stabljike Cynomorium songaricum Rupr. (Cynomorii Herba, Suo Yang na kineskom),Cistanchesinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan i Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch. i Flerov (Sun et al., 2012). Ovi preljubnici imaju morfološke karakteristike slične onima kodCistanchesHerba, što otežava tradicionalnu taksonomsku identifikaciju, posebno nakon što se materijal preradi u medicinske proizvode. Mikroskopska identifikacija nije dostupna jerCistanchesHerbanema definitivne ili jedinstvene mikroskopske karakteristike. Trenutni alati analitičke hemije nisu dovoljni za otkrivanje falsifikovanja Cistanches Herba jer slična jedinjenja postoje i u poznatim patvorenima Ci. salsa (Lei et al., 2001; Chen et al., 2007) i Ci. sinensis (Liu et al., 2013). Stoga je hitno potreban razvoj brze molekularne metode za autentifikaciju Cistanches Herba i njenih proizvoda za odgovarajuće sisteme kontrole kvaliteta u kineskoj patentnoj medicini i drugim industrijama medicinskih proizvoda.

Chen et al. prvi je predložio interni transkribovani razmak 2 (ITS2) kao univerzalni bar kod za ljekovito bilje (Chen et al., 2010). Sun et al. potvrdio je ITS2 regiju kao poželjan DNK bar kod za identifikacijuCistanchesHerba i njeni preljubnici (Sun et al., 2012). Međutim, ITS2 se ne može koristiti za razlikovanje kineske patentne medicine od degradirane DNK. Nedavno je sve veći broj studija pokazao da je "mini bar kod" korisna metoda za pojačavanje degradirane DNK (Hajibabaei et al., 2006; Meusnier et al., 2008; Dubey et al., 2011; Lo et al., 2015). Međutim, nukleotidni potpisi su prikladniji od mini barkodova, jer se oni koji se formiraju odnose na jedan ili više nukleotida koji su jedinstveni za jednu vrstu i mogu se učinkovito koristiti mnogim molekularnim tehnikama, kao što su DNK sonde, mikrofluidika i izotermna amplifikacija posredovana petljom ( de Boer et al., 2015.). Han et al. razvili nukleotidne potpise za Panax ginseng, Angelica Sinensis i Lonicera japonica i uspješno identificirali povezane kineske patentne lijekove (Liu et al., 2016; Wang et al., 2016a; Gao et al., 2017).

funkcionalni proizvodi koji sadržeCistanchesHerba. Konkretno, (1) smo razvili četiri nukleotidna potpisa i šest specifičnih prajmerskih parova za razlikovanje autentičnihCistanchesHerba i poznati preljubnici, (2) potvrdili su četiri nukleotidna potpisa u eksperimentima, uključujući mješavine poznatih taksonomskih vaučera koji se koriste za pripremu Cistanches Herba proizvoda koji sadrže i autentične i krivotvorene sastojke, i (3) izvršili istraživanje tržišta od 66CistanchesHerba proizvodi preko njihovih nukleotidnih potpisa.

Cistancheima mnogo efekata i može poboljšati funkciju bubrega

MATERIJALI I METODE

Sakupljanje i priprema uzoraka

Ukupno je prikupljen 251 uzorak iz Unutrašnje Mongolije, Xinjianga i Ningxia, između ostalih područja; ovi uzorci su uključivali 214Cistanches Herbai 37 preljubnika i detaljno su navedeni u Dodatnoj tabeli S1. Odgovarajuće uzorke vaučera potvrdili su taksonomisti i deponovali u Herbarijum Instituta za razvoj ljekovitog bilja Kineske akademije medicinskih nauka, Peking, Kina. Ukupno 35 serija praha, začina i ekstrakataCistanchesHerba je kupljena u online prodavnicama i u običnim drogerijama u Pekingu i Čengduu (tabela 1). Ukupno, 31 serija kineske patentirane medicine koja sadržiCistanchesHerba je kupljena u različitim drogerijama (tabela 2), a deklarisani sastavi različitih kineskih patentiranih lijekova prikazani su u dodatnoj tabeli S3. Različite morfološke karakteristike različitih oblika doze prikazane su na slici 1.

Mješoviti uzorci: praškovi Ci.deserticola, Ci.tubulosa, Cy. songaricum, Ci. sinensis, B. rossica i O. coerulescens su umjetno pomiješani u različitim kombinacijama (u omjeru 1:1) prije ekstrakcije. Detalji ovih miješanih uzoraka prikazani su u legendi na slici 3. Osim toga, praškovi četiri preljubnice su pomiješani sa pravim Ci. deserticola u različitim omjerima težine: 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 i 60000:1 (Tabela 3). A dva originalna proizvoda su pomiješana u istim omjerima.

Uvarak: kriške Ci. deserticola i Cy. Songaricum se koristio za pripremu odvarka. Kriške (10 g) su kuhane u 300 mL dvostruko destilovane vode 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 i 240 minuta i zatim korištene za ekstrakciju DNK.

Ekstrakcija DNK, lančana reakcija polimeraze (PCR) amplifikacija i sekvenciranje

Uzorci, decokcija i miješani uzorci: Uzorci (40-50 mg) su mljeveni u fini prah preko Retsch MM400 laboratorijske miješalice (Retsch Co., Njemačka) na frekvenciji od 30 Hz. Genomska DNK je naknadno ekstrahirana sa biljnim univerzalnim genomskim DNK kompletom (Tiangen Biotech Beijing Co., Kina) prema uputama proizvođača. ITS2 je amplificiran univerzalnim prajmerima 2F/3R (Chen et al., 2010).

paralelno po seriji. Prašak kineskog patentnog lijeka je ispran sa 700 µL pufera za pretpranje [100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 20 mM etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA), pH 8,0;

700 mM NaCl; 2 posto polivinilpirolidona (PVP)-40; i 0,4 posto -merkaptoetanola] nekoliko puta dok supernatant nije bio bistar i bezbojan, nakon čega je smjesa centrifugirana na 7500 × g 5 minuta na sobnoj temperaturi. Talog je zatim korišten za ekstrakciju genomske DNK preko Plant Universal Genomic DNK Kit (Tiangen Biotech Beijing Co.) prema uputama proizvođača. Na kraju, DNK iz svake serije je koncentrisan u jednu epruvetu. Šest parova prajmera specifičnih za vrstu—SYF1/SYR1, HMRCF/HMRCR, GHRCF/GHRCR, CCRF/CCRR,

SCRF/SCRR i LDF/LDR—su dizajnirani preko Primer Premier-a

6.0 softver (Premier Co., Kanada) za pojačavanje Cistanches Herba i njegovih spojeva (detalji su prikazani u Tabeli 4). PCR je izveden u reakciji zapremine 50 µL koja sadrži 1 µL

KOD FX (Toyobo Co., Japan), 25 µL 2 × PCR pufera, 10 µL dNTP-a (2 mM), 1,5 µL svakog prajmera (10 µM) i 4 µL (∼50 ng) DNK šablona; preostali volumen se sastojao od dvostruko destilovane vode. Reakcije su izvršili

termocikler (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., SAD); termalni programi su navedeni u Tabeli 4. PCR proizvodi su ispitani putem elektroforeze u 3 posto agaroznom gelu i pročišćeni za dvosmjerno sekvenciranje pomoću ABI 3730XL sekvencera (Applied Biosystems Co.) u skladu sa Sanger metodom sekvenciranja. Zatim je testirana osetljivost šest prajmera kvantitativnim PCR testom u realnom vremenu (qRT-PCR) sa CFX96 Real-time System (Bio-rad Lab., SAD). Sistem je automatski izračunao pragove ciklusa preko modela "PCR Baseline Subtracted Curve Fit". qRT-PCR je izveden u reakciji zapremine 15 µL koja sadrži 7,5 µL SYBRⓍR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)

(Takara Bio Co., Japan), 1.0 µL svakog prajmera (10 µM) i 1,0 µL DNK šablona sa preostalom zapreminom koja se sastoji od dvostruko destilovane vode. qRT-PCR je izveden sa tri tehnička ponavljanja na osnovu kojih je izračunata standardna greška.

Analiza sekvence: Sekvence su uređene i ručno sastavljene preko CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., SAD).

ITS sekvence iz GenBank-a su označene putem Hidden Markov modela (HMM) kako bi se dobile ITS2 sekvence (Keller et al., 2009). Sekvence su zatim poravnane pomoću softvera MEGA 5.0 pomoću metode poravnanja "Muscle" (Edgar, 2004; Tamura et al., 2011).

Cistancheima mnogo efekata i može poboljšatibubregfunkcija

REZULTATI

Razvoj nukleotidnih potpisa i parova prajmera specifičnih za vrstu za Cistanches Herba i Adulterants

Stope uspješnosti PCR amplifikacije i sekvenciranja za 251 uzorak bile su 100 posto kada je korišten par prajmera 2F/3R. Poravnana dužina Cy. songaricum ITS2 sekvence bile su 229 bp (dodatna slika S1). Analiza sekvenci iz herbarijskih vrsta i onih bliskih vrsta preuzetih iz GenBank-a (dodatna tabela S2) otkrila je dva mjesta polimorfizma jednog nukleotida (SNP) za Cy. songaricum. Na osnovu SNP-ova, jedan Cy. songaricum-specifični 30- bp nukleotidni potpis (5′-caattatttg aggtgcattg taagaagcgt-3') je razvijen (Slika 2A). Rezultati alata za pretragu osnovnog lokalnog poravnanja (BLAST) u NCBI su pokazali da je ovaj nukleotidni potpis bio jedinstven za Cy. songaricum (Tabela 5). Sličnom analizom sekvenci iz blisko povezanih vrsta, otkriveno je jedan do dva SNP-a iz Ci. sinensis, B. rossica i O. coerulescens. Na osnovu SNP-a, nukleotidni potpisi za ostala tri preljuba također su razvijeni na sličan način, uključujući potpis od 34 bp (5′-cgatggtctc ccgtgcgcga,ggatgcacgg ccgg-3′) za Ci. Sinensis, potpis od 37 bp (5′- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtc-3') za B. rossica, i potpis od 31 bp (5′-gtctgtcgtg tcggatggtgtg tcggatggtg6 za B. rossica}) (Slike 2BD). BLAST analiza u NCBI je također otkrila da su ovi nukleotidni potpisi bili specifični i da nisu prisutni ni u jednoj drugoj vrsti (Tabela 5).

Cistanches Herbaa njegove preljubne tvari mogu se istovremeno pojačati iz mješavina preko 2F/3R univerzalnog para prajmera. Stoga smo dizajnirali prajmere specifične za vrstu za amplifikaciju nukleotidnog potpisa poravnavanjem ITS2 sekvenci. Četiri specifična para prajmera — SYF1/SYR1, CCRF/CCRR, SCRF/SCRR i LDF/LDR — dizajnirana su da pojačaju nukleotidne potpise Cy. songaricum, B. rossica, Ci. sinensis, odnosno O. coerulescens (tabela 4). Dužine amplikona bile su 123, 72, 131 i 71 bp, respektivno.

Osim toga, analizirano je ukupno 214 ITS2 sekvenci iz eksperimentalnih materijala Cistanches Herba. Dva kratka specifična prajmera—HMRCF/HMRCR i GHRCF/GHRCR za Ci. deserticola i Ci. tubulosa, odnosno dizajnirani su da pojačaju kratke regije degradiranih uzoraka (Tabela 4). Dužine amplikona bile su 132 i 134 bp, respektivno.

Validacija nukleotidnog potpisa i metode specifičnog temeljnog premaza na bazi umjetnih mješavina i dekocija

Efikasnost amplifikacije novih parova prajmera je potvrđena iz mešavine. PCR proizvodi su dobijeni putem svakog para prajmera za svaku ciljanu vrstu, kao što je prikazano

cq vrijednosti B. rossica ili O. coerulescens mogle su se dobiti čak i kada je udio uzoraka bio 30000:1 ili 40000:1, a rezultati amplifikacije Ci. sinensis, Ci.tubulosa, a Ci deserticola je mogao biti otkriven kada je omjer bio 20000:1. Ali za Cy se nisu mogli dobiti nikakvi uočljivi rezultati. songaricum kada je činio proporciju od 20000:1.

Da bi se provjerilo funkcionira li metoda nukleotidnog potpisa s obrađenim materijalima, dekocijama Ci. deserticola i Cy. pripremljeni su songaricum. Rezultati su pokazali da kratki barkod iz Ci. deserticola je mogla biti pojačana, čak i nakon što su uzorci kuhani 210 min. Osim toga, nukleotidni potpis Cy. songaricum je mogao biti amplificiran nakon što su uzorci kuhani 150 min, dok PCR produkti nisu detektovani nakon što su uzorci kuhani 210 ili 240 min (Slika 4). Rezultati sekvenciranja su pokazali da je kratki nukleotidni potpis uspješno dobiven iz dekokcije.

Istraživanje tržišta falsifikovanja putem nukleotidnog potpisa i specifičnih prajmera

Navedena metoda je primijenjena za detekcijuCistanchesHerba proizvodi na tržištu. Trideset pet serijaCistanchesHerba kriške, prašci i ekstrakti su amplificirani i sekvencionirani korištenjem šest dizajniranih specifičnih prajmera (rezultati elektroforeze u agaroznom gelu prikazani su na dodatnoj slici S2, a sekvence su navedene u dodatnom listu podataka 1). Analiza sekvenci putem njihovih nukleotidnih potpisa otkrila je da je pet serija rezova autentično. Jedna serija odrezaka i jedna serija praha su zamijenjeni sa Cy. songaricum i jedan ekstrakt su zamijenjeni sa Ci. sinensis. Ostalih šest serija praha bile su mješavine: pet je bilo krivotvoreno sa Cy. songaricum i Ci. sinensis i jedan su falsifikovani sa Cy. songaricum (Tabela 1). Uz to, jedna serija kriške je zamijenjena Salvia miltiorrhiza.

Cistanches Herba u kineskim patentnim lijekovima je podvrgnuta različitim procesima koji otežavaju autentifikaciju. Ispitana je sposobnost šest parova prajmera da pojačaju specifične regije nukleotidnog potpisa iz kineskih patentnih lijekova (rezultati elektroforeze u agaroznom gelu prikazani su na dodatnoj slici S2). Većina kineskih patentiranih lijekova sadrži komponente različitih vrsta vrsta. Na primjer, pilule Shihu Yeguang (ZCY34) sadrže 25 sastojaka, uključujući Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu) i Ginseng Radix et Rhizoma (Ren Shen). Od ovih sastojaka, Cistanches Herba bi se mogao posebno pojačati preko para prajmera GHRCF/GHRCR. Direktno sekvenciranje PCR proizvoda otkrilo je vrlo čiste tragove. Međutim, vidljiva traka nije se mogla dobiti sa parom prajmera HMRCF/HMRCR.

Drugi primjer su Kangguzhi Zengsheng pilule (ZCY44). Tu je još osam sastojakaCistanchesHerba u ovom kineskom patentiranom lijeku, ali nije bilo vidljivih traka dobivenih ni GHRCF/GHRCR ni HMRCF/HMRCR, što je značilo da nemaCistanches Herbabio prisutan. Međutim, preljubni region Cy. songaricum je uspješno amplificiran specifičnim parom prajmera SYF1/SYR1. Rezultati sekvenciranja su pokazali kratki nukleotidni potpis Cy. songaricum je uspješno nabavljen.

Cistancheima mnogo funkcija i imaprotuupalnoefekti