1. DIO Ekstrakt Cistanche Tubulosa (Schenk) Wight poboljšava performanse stražnjih udova i ublažava ekspresiju teškog lanca miozina IId/IIx kod miševa imobiliziranih livenjem

Za više informacija kontaktirajte:Joanna.jia@wecistanche.com

1Odjel neuromedicinskih nauka, Institut za prirodnu medicinu, Univerzitet Toyama, 2630 Sugitani, Toyama 930-0194, Japan 2Odsjek za japansku orijentalnu medicinu, Visoka škola medicine i farmaceutskih nauka, Univerzitet Toyama, 2630 Sugitani, Toyama {{5} }}, Japan

Prepisku treba uputiti Chihiru Tohdi; chihiro@inm.u-toyama.ac.jp

Primljeno 14. juna 2019.; Revidirano 13. septembra 2019.; Prihvaćeno 17. septembra 2019.; Objavljeno 22. oktobra 2019

Akademski urednik: Wen-yi Kang

Copyright © 2019 Yoshiyuki Kimbara et al. Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod licencom Creative Commons Attribution, koja dozvoljava neograničenu upotrebu, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju pod uvjetom da je originalno djelo pravilno citirano.

Atrofija skeletnih mišića se susreće u mnogim kliničkim stanjima, ali farmakološki tretman još nije uspostavljen.Cistanche tubulosa(Schenk) Wight je biljni lijek koji se koristi u tradicionalnoj japanskoj i kineskoj medicini. U trenutnoj studiji istražili smo učinakEkstrakt C. tubulosa(CTE) na atrofiranom mišiću in vivo. Također smo istraživali imobilizaciju stražnjih udova kod miševa i osmislili novi tip gipsa za imobilizaciju stražnjih udova, koji se sastoji od trake nalik spužvi i tanke plastične cijevi. Koristeći ovu metodu, 3 od 4 grupe miševa (n 11 za svaku grupu) su gipsane imobilisane u zadnjim udovima i davan im je CTE ili vehikulum tokom 13 dana. Lažni postupak urađen je kod miševa četvrte grupe kojoj je dat vehikulum. Zatim su izrezani mišići triceps surae (TS). Da bismo analizirali učinak novog sistema gipsa i primjene CTE na atrofiju mišića, procijenili smo mokru težinu TS-a i površinu poprečnog presjeka miofibera (CSA). Također smo odredili nivoe ekspresije MyHC IId/IIx western blottingom, budući da je njihovo povećanje obilježje atrofije mišića neupotrebe, što sugerira sporo na brzu promjenu tipa miofibera. Osim toga, izvršili smo dva testa performansi stražnjih udova. Nova metoda gipsane imobilizacije značajno je smanjila mokru težinu TS i CSA miofibera. Ovo je bilo praćeno pogoršanjem funkcije stražnjih udova i povećanjem ekspresije MyHC IId/IIx. Primjena CTE nije promijenila mokru težinu TS ili CSA miofibera; međutim, pokazao je trend poboljšanja gubitka funkcije stražnjih udova i supresije povećane ekspresije MyHC IId/IIx kod miševa imobiliziranih livenjem. Naša nova metoda imobilizacije gipsa stražnjih ekstremiteta učinkovito je izazvala atrofiju mišića. CTE nije utjecao na mišićnu masu, ali je potisnuo prelazak sa sporog na brz tip miofibera kod miševa imobiliziranih gipsom, poboljšavajući pogoršanje funkcije stražnjih udova.

Cistanche deserticola ima mnogo efekata, kliknite ovde da saznate više

1. Uvod

Patofiziološka stanja povezana s atrofijom skeletnih mišića uključuju sarkopeniju [1], kaheksiju [2] i atrofiju skeletnih mišića uzrokovanu glukokortikoidima [3]. Atrofiju skeletnih mišića uzrokuje i produžena neupotreba [4], što može biti uzrokovano mirovanjem u krevetu [5], primjenom gipsa za liječenje prijeloma ili ozljeda ligamenata [6] ili svemirskim letovima [7]. Budući da razne bolesti mogu uzrokovati ovo stanje, ono pogađa veliki postotak populacije.

Adekvatna tjelovježba i nutricionističke terapije su neophodne za liječenje mišićne atrofije [8]. Osim toga, neke studije su objavile da su farmakološke kontramjere, uključujući selektivne modulatore androgenih receptora, ljudska monoklonska antitijela protiv miostatina i selektivne agoniste grelinskog receptora, efikasne [9]; međutim, ovi pristupi još nisu uspostavljeni.

Gore opisana stanja atrofije mišića praćena su pomakom u profilu tipa miofibera i smanjenjem mišićne mase. Neiskorištenost mišića uzrokovana gubitkom neuralnog utjecaja i mehaničkim opterećenjem inducira sporo u brzu promjenu tipa miofibera i promjenu profila izoforme teškog lanca miozina (MyHC) [10], što je signalizirano povećanjem nivoa ekspresije MyHC IId/IIx [11, 12]. Umjesto toga, promjena tipa miofibera od brzog ka sporom je indukovana primjenom glukokortikoida, kaheksijom, sepsom i drugim faktorima [10].

Cistancheje biljni lijek porijeklom izCistanche deserticolaYC Ma,C. tubulosa(Schenk) Wight, ili C. salsa (CA Mey) Beck, prema japanskoj farmakopeji [13]. U tradicionalnoj japanskoj (Kampo) i kineskoj medicini koristi se za liječenje "sindroma nedostatka bubrega" koji karakterizira neplodnost, sistemska slabost mišića (posebno u leđima i donjim udovima) i slabost kostiju [14, 15]. Poznato je da sadrži različite sastojke, uključujući akteozid, ehinakozid i izoakteozid [16]. Ekstrakt ove biljke, ili njeni hemijski sastojci, pokazao je kardio-, hepato- i neuroprotektivne efekte; antiaging, antiumor, vazodilatacijski i afrodizijački efekti; antioksidativno i protuupalno djelovanje; i sposobnost poboljšanja pamćenja i učenja [15, 16]. Ipak, efikasnost ove biljke u prevenciji ili liječenju bolesti gubitka mišića nije potvrđena. Stoga smo u ovoj studiji istraživali efekteC. tubulosaekstrakt (CTE) kao tretman za atrofiju mišića.

U tu svrhu koristili smo imobilizaciju gipsa na stražnjim udovima kako bismo izazvali atrofiju mišića kod miševa, fokusirajući se, posebno, na materijale koji se koriste u gipsu. Prijavljeni su različiti sistemi livenja, uključujući gips od pariških odlivaka [17], odlivke od fiberglasa [18], polipropilenske mikrocentrifužne cevi [19], uređaje nalik odelu za zadržavanje od pamuka i čelične mreže [20], plastične pipete sa proksimalnim spužvasta podloga [21], odljevci od neelastične trake za zavoj i čelične žice obložene vinilom [22], umetanje žice u kombinaciji s metalnim pločama [23] i korištenje hirurške klamerice za kožu [24]. Idealan gips bi trebao biti minimalno invazivan i netraumatičan kako bi se izbjegle upalne promjene jer upala može izazvati atrofiju mišića [25]. Osim toga, testovi performansi stražnjih udova s ​​gipsom trebali bi biti mogući u završnim fazama eksperimenta. Nadalje, gips bi trebao biti lak za rukovanje bez posebnog znanja ili vještina; trebao bi biti lagan, jeftin, lak za kupovinu i ne bi trebao zahtijevati posebne uređaje za nanošenje i uklanjanje.

Prijavljeni su različiti životinjski modeli gubitka mišića. Rasterećenje stražnjih udova se često koristi [11, 12], ali ima nekoliko problema, uključujući nekrozu repa, koja može izazvati sistemsku upalu [25]; devijacija tjelesnih tekućina na kaudalnu stranu, što rezultira abnormalnostima krvnih sudova stražnjih udova [26]; izvanredna mikrogravitacija na zadnjim udovima, koja može snažno utjecati na ekspresiju proteina, uključujući i mitohondrijalne enzime [27]. Svi ovi faktori mogu uticati na tok gubitka mišića. Različita metoda inducira mišićnu atrofiju uskraćujući mišiću neuronske ulaze (na primjer, putem transekcije išijadičnog živca) [28]; budući da su mišići podložni trofičkim faktorima terminalnih neurona [29], ova metoda, koja dovodi do neuobičajenog gotovo potpuno denerviranog statusa, može promijeniti proces atrofije mišića. Životinje koje su podložne sistemskim poremećajima koji izazivaju atrofiju mišića, kao što su dijabetes melitus [30], zatajenje bubrega [31], primjena kortikosteroida [32] i starenje ili ubrzano starenje [33, 34], mogu se koristiti kao modeli ljudi bolesti; međutim, ova sistemska stanja takođe mogu ometati proces atrofije mišića.

Stoga smo odabrali imobilizaciju stražnjih udova da izazovemo atrofiju mišića, i pokušali smo stvoriti novu metodu za izvođenje iste kod miševa, pomoću koje smo istraživali efekte CTE-a na atrofiju mišića.

CistancheTretmani dodacima prehraniBubregBolestiBoostsSnaga

2. Materijali i metode

2.1. Biljni materijal i ekstrakcija.

CTE je kupljen od Alps Pharmaceutical Industry Co., Ltd. (Hida, Gifu, Japan).

C. tubulosa mesnate stabljike su sakupljene iz Shinjang Uyghur Aptonom Rayona, Narodna Republika Kina. Ukupno 193 kg miješanog praha C. tubulosa potopljeno je u 1.883 l 30 postotnog etanola. Smeša je refluksovana 2 h na 55-64 stepena. Prinos ekstrakta bio je 7,2 posto i sadržavao je 3,36 posto akteozida i 12,72 posto ehinakozida.

2.2. Miševi.

Odrasli ddY (stari 12 sedmica) mužjaci miševa (Japan SLC, Shizuoka, Japan) smješteni su odvojeno u plastične kaveze i držani na 12-h ciklusu svjetlo/mrak u vivarijumu sa reguliranom temperaturom (25 ± 2 stepena). Svim životinjama je dozvoljen ad libitum pristup vodi i jedenju (Labo MR stoka; Nosan Corporation, Yokohama, Kanagawa, Japan).

Svi eksperimenti i protokoli na životinjama izvedeni su u skladu sa Smjernicama za njegu i korištenje laboratorijskih životinja Sugitani kampusa Univerziteta Toyama. Broj odobrenja za eksperimente na životinjama je A2016INM-3. Svi napori su uloženi kako bi se smanjio broj životinja koje se koriste.

2.3. Indukcija atrofije mišića stražnjeg ekstremiteta i CTE administracija.

Miševi su podijeljeni u 4 grupe (n 11 po grupi): 2. dan svi miševi su anestezirani, a dlake su im uklonjene od bedra do skočnog zgloba kremom za depilaciju (Epilat krema; Kracie, Tokio, Japan). Zatim, 3 od 4 grupe gipsane ( plus ) grupe su imobilizirane prema sljedećoj proceduri, kao što je prikazano na slikama 1(a)-1(g):

Korak 1. Izrežite traku za brtvljenje od EPDM gumene pjene (Cemedine Corporation, Tokio, Japan) u traku od 12 8 25 mm (Slika 1(a)).

Korak 2. Držite zadnji ud u plantarnom položaju skočnog zgloba i vrlo nježno ga omotajte u zglobu skočnog zgloba zaptivnom trakom (Slika 1(b)).

Korak 3. Izrežite mekanu PVC izolacijsku kapu TIC-22 (Nichifu Corporation, Osaka, Japan) i prekrijte manžetnu zaptivne trake. Upotrijebite dvostranu traku (PRO SELF zgodna dvostrana traka J-1300; Nitoms Inc., Tokio, Japan) kako biste ih zalijepili (slika 1(c)).

Korak 4. Skupite odrezane krajeve kapice; izrežite vodootpornu ljepljivu traku visokih performansi (traka za napajanje; Asahipen Corporation, Osaka, Japan) na pribl. 4 48 mm veličine i pričvrstite skupljene krajeve (Slika 1(d)).

Korak 5. Stavite mali komad (cca. 5 30 mm) trake od aluminijske folije (AL-30; Nichiban Corporation, Tokio, Japan) na prednju stranu gornjeg kraja poklopca (Slika 1 (e)).

Korak 6. Izrežite plastičnu traku (vinil električna izolaciona traka br. 21; Nitto Denko Corporation, Osaka, Japan) na pribl. 19 × 40 mm i zamotajte kapu (slika 1(f)).

Korak 7. Izvedite isti postupak na kontralateralnom stražnjem ekstremitetu (Slika 1(g)).

Period imobilizacije korišten u ovoj studiji bio je 13 dana, a gipsi su zamijenjeni ako je nastupilo jedno ili više od sljedećih stanja: jak edem pedale, nekroza stražnjih udova, teške ulceracije na koži, olabavljenje gipsa zbog destrukcije ili dislokacija gipsa iz gipsa gležanj. U preostaloj grupi izvršena je samo depilacija (lažni postupak), a vehikulum (fiziološki rastvor) je davan 13 dana od dana nakon depilacije (2. dan). Među 3 gipsane ( plus ) grupe, 2 su primijenjene CTE (50 i 100 mg/kg/dan; gips ( plus )/CTE-50 grupa i gips ( plus )/CTE-100 grupa), a jednom je davan vehikulum (gips ( plus )/grupa nosioca), takođe od 2. dana. CTE je rastvoren u fiziološkom rastvoru i davan dnevno putem oralne sonde tokom 13 dana.

2.4. Procjena funkcije stražnjih udova i mišićne snage stražnjih udova.

Dana 14, miševi grupe gipsa ( plus ) su ponovo anestezirani nakon primjene CTE, a gipsi su uklonjeni. Sljedećeg dana (15. dan), svi miševi su testirani na funkciju stražnjih udova i snagu mišića, koristeći sljedeća dva testa:

2.4.1. Mjerenje brzine hoda.

Četvrtasta drvena platforma širine 15 mm držana je vodoravno oko 50 cm od tla. Miš je zatim stavljen na platformu, a brzina hoda je procijenjena dok je životinja prelazila platformu ručnim bilježenjem štopericom vremena hodanja na udaljenosti od 50 cm. Prethodno je svaki miš bio naviknut na platformu tako što je dva puta prošao kroz nju kao trening.

2.4.2. Test greške stopala.

Da bismo procijenili snagu mišića stražnjih udova, izveli smo "test krivulje stopala", u kojem je svaki miš ponovo postavljen na platformu, a broj iskliznuća stražnjih udova s ​​platforme je tabelarno prikazan. Ovaj test je modificirana verzija testa statičkog štapa, u kojem se vazdušne šipke fiksiraju pomoću G-stezaljke, a miševi se natjeraju da ih prelaze [35]. Testiranje stopala je obavljeno tri puta, a zabilježen je srednji broj koraka u tri sesije. Između sesija je postojao interval odmora od najmanje 15 minuta.

2.5. Histološke i morfometrijske analize mišića tricepsa Surae.

Nakon procjene funkcije stražnjih udova, miševi su duboko anestezirani i eutanatizirani perfuzijom fiziološke otopine. Zatim su mišići tricepsa surae (TS) izrezani s obje strane stražnjih udova; uzorci sa zadnjeg lijevog ekstremiteta su fiksirani u 4% paraformaldehida u PBS rastvoru tokom 24 h, zatim prebačeni u 30% rastvor saharoze u PBS-u i inkubirani za krioprotekciju i kriosekciju. Nakon toga, preseci debljine 12- μm su isečeni duž male ose iz srednjeg dela trbuha svakog mišića pomoću kriostata (Leica 3050S; Leica sistemi, Nußloch, Nemačka). Sedam do deset uzastopnih sekcija postavljeno je na staklena stakalca obložena antistrip (MAS-GP tip A, Matsunami Glass Industry, Osaka, Japan), odmah osušena fenom, čuvana na 30 stepeni i obojena hematoksilin-eozinom (HE bojenje , ScyTek Laboratories, Logan, Utah, Sjedinjene Američke Države). Odabran je jedan reprezentativni dio po životinji, u kojem je kratak osi svakog miofibera bio jasno vidljiv, a njegova površina poprečnog presjeka (CSA) izmjerena je pomoću slike J (Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, Maryland, Sjedinjene Države) .

2.6. Western blotting.

Ukupni protein iz desnog TS ekstrahovan je sljedećom metodom. Desni TS je mleven makazama i odmah zamrznut u tečnom azotu, čuvan na 30 stepeni, a kasnije homogenizovan da bi se napravio lizat tkiva. Odmrznuti mišići su inkubirani ledeno hladni 30 minuta u 2 mL M-PER rastvora ekstrakta proteina sisara (Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, SAD), a zatim homogenizovani. Homogenati su zatim centrifugirani na 4 stepena i 4000 g tokom 10 minuta, a supernatanti su sakupljeni.

10 ug ukupnog proteina u svakom mišićnom lizatu je napunjen i odvojen natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezom (SDS-PAGE), nakon čega je uslijedio elektrotransfer na nitroceluloznu membranu (0.2 μm, # 1620112, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornija, Sjedinjene Američke Države). Nespecifično vezivanje je blokirano sa 5 posto nemasnog suhog mlijeka (obrano mlijeko u prahu, 190-12865, FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) u fiziološkom rastvoru puferiranom Tris sa 0,05 posto Tween 20 (TBS-T). Membrane su zatim inkubirane preko noći na 4 stepena sa primarnim antitelom rastvorenim u rastvoru za poboljšanje imunoreakcije Can Get Signal 1 (Toyobo, Osaka, Japan). Nakon miješanja i ispiranja s TBS-T, membrane su inkubirane 1 h na sobnoj temperaturi sa sekundarnim antitijelom konjugiranim s peroksidazom rena (HRP-) razrijeđenim u Can Get Signal rastvoru za poboljšanje imunoreakcije 2 (Toyobo, Osaka, Japan). Signali na membranama detektovani su elektrohemiluminiscencijom pomoću luminola. Zatim je izvršena denzitometrijska analiza pomoću softvera CS Analyzer (Atto, Tokio, Japan). Antitijela su odabrana i razrijeđena na sljedeći način: mišje anti-MyHC IId/IIx monoklonsko antitijelo (1 : 1000, klon A4.1025, #05-716, Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, Sjedinjene Države), mišje anti-GAPDH monoklonsko antitijelo za kontrolu opterećenja (1: 3500, G041 ABM, Vancouver, Kanada), i HRP-konjugirano kozje antimišje IgG poliklonsko sekundarno antitijelo H&L (1: 2000, Abcam, Cambridge, Ujedinjeno Kraljevstvo).

2.7. Statističke analize.

Svi rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna greška srednje vrijednosti (SEM). Statistička značajnost poređenja među grupama potvrđena je jednosmjernom ANOVA-om i post hoc Dunnettovim testovima ili Tukeyjevim HSD testom; Kruskal-Wallisov test i post hoc Dunnovi testovi; ili dvosmjerna ANOVA sa ponovljenim mjerama i post hoc Dunettovim testom. Smirnov-Grubb-ov test je korišten za isključivanje izvanrednih vrijednosti. Za sve statističke procjene, p vrijednosti manje od 0.05 smatrane su statistički značajnim, a sve analize su izvedene korištenjem GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornija, Sjedinjene Države).

CistancheDijetetski dodaci protiv starenja i jačaju snagu

3. Rezultati

3.1. Zdravlje životinja i učinak CTE na tjelesnu težinu.

U vizualnom izgledu, zadnji udovi miševa imobiliziranih gipsom bili su atrofični, u usporedbi s onima u gipsanim ( )/veznim grupama miševa. Imobilizacija gipsom dovela je do značajnog gubitka tjelesne težine do kraja faze istraživanja. Nasuprot tome, promjene tjelesne težine nisu bile značajne kod miševa grupe gips ( )/nosač. Dvije grupe gipsa ( plus )/CTE nisu pokazale značajne promjene u tjelesnoj težini u poređenju sa grupom gipsa ( plus )/vozilo (Slika 2).

Ozbiljne komplikacije na zadnjim udovima imobiliziranih miševa, kao što su nekroza kože ili gangrena, nisu primijećene niti je bilo abnormalno ponašanje u vivarijumu. Međutim, blage komplikacije, uključujući edem stopala, površinske ulceracije na koži i trljanje stražnjih udova, uočene su kod svih miševa imobiliziranih gipsom (slika 1(h)). Popuštanje i dislokacija gipsa, što je dovelo do zamjene gipsa, također je uočeno u većini slučajeva.

3.2. Utjecaj CTE-a na snagu mišića i performanse mišića.

Grupa zabacivanja ( plus )/vozilo je pokazala značajno povećan broj proklizavanja stražnjih udova u testu stopala (slika 3(a)), a brzina hoda je bila značajno sporija od one u grupi zabacivanja ( )/vozila (slika 3(b) )).

Tretman CTE rezultirao je tendencijom prema smanjenju proklizavanja stražnjih udova ovisnom o dozi. U grupi sa gipsom ( plus )/CTE-100, tretman je imao tendenciju smanjenja (p 0.0604) proklizavanja stražnjih udova u poređenju sa grupom gipsa ( plus )/vozilo (Slika 3(a)). Što se tiče brzine hoda, obje grupe cast ( plus )/CTE-50 i cast ( plus )/CTE-100 nisu pokazale značajne razlike u brzini hoda u poređenju sa grupom cast ( plus )/vozilo, iako postoji bio je blagi, neznačajni trend ovisan o dozi prema većoj brzini (slika 3(b)).

3.3. Mokra težina TS i Myofiber CSA.

Mokra težina TS-a je značajno smanjena sa imobilizacijom gipsa u poređenju sa grupom gipsa ( )/vozilo (Slika 4(a)). Primjena CTE nije utjecala na mokru težinu TS.

Također je analiziran srednji CSA miofibera u svakoj grupi. U grupi gips ( plus )/vozilo, nađeno je značajno smanjenje CSA miofibera u poređenju sa grupom gips ( )/vozilo (Slika 4(b)). Myofiber CSA je dalje klasifikovan i analiziran prema distribuciji frekvencija, kao što je prikazano na slici 4(c). Najčešća CSA klasa u grupi cast ( )/vozilo bila je veća od one u grupi cast ( plus )/vozilo; postotak miofibera u klasi 1350- 2250 μm2 CSA bio je, ili je imao tendenciju da bude, značajno veći u grupi cast ( )/vozilo nego u grupi cast ( plus )/vozilo, a suprotan trend je bio očigledan u grupe CSA klase 0 900 μm2 (slika 4(c)). Na distribuciju CSA nije utjecala primjena CTE-a u dvije grupe s gipsima ( plus )/CTE, u poređenju sa grupom gips ( plus )/nosač (Slika 4(c)). Reprezentativne slike miofibera prikazane su na slici 4(d).

3.4. Utjecaj CTE na MyHC IId/IIx nivoe ekspresije u TS.

Western blotting je izveden u šest reprezentativnih uzoraka iz svake grupe (Slika 5(a)). Ovi uzorci su odabrani na osnovu njihove derivacije od životinja koje su pokazale performanse testa stopala i greške najbliže srednjim vrijednostima za njihove grupe.

U grupi gips ( plus )/vozilo, MyHC IId/IIx je značajno povećan u poređenju sa grupom gips ( )/vozilo. Ovo povećanje je ovisno o dozi potisnuto primjenom CTE. U grupi cast ( plus )/CTE-100, MyHC IId/IIx ekspresija je imala tendenciju smanjenja u poređenju sa grupom cast ( plus )/vehicle (p 0.0810) (Slika 5(b)) . Ekspresija GAPDH, koja je korištena kao interna kontrola, nije se značajno razlikovala između grupa (Slika 5(c)).

Cistanchetubuloza ima mnogo efekata