Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Molimo kliknite ovdje do 2. dijela

I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4,* i Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1Graduate Institute of Neural Regenerative Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University, Taipei 11031, Taiwan

2Institut za molekularnu biologiju, Academia Sinica, Tajpej 11529, Tajvan

3Institut za kliničku medicinu, Medicinski fakultet, Nacionalni univerzitet Cheng Kung, Tainan 70403, Tajvan

4 Istraživački centar kliničke medicine, Nacionalna univerzitetska bolnica Cheng Kung, Medicinski fakultet, Nacionalni univerzitet Cheng Kung, Tainan 70403, Tajvan

5 Institut za biomedicinske nauke, Medicinski fakultet, Univerzitet Chang Gung, Taoyuan 33302, Tajvan

6Neuroscience Research Center, Chang Gung Memorial Hospital, Linkou 33302, Tajvan

7 Vodeći kontakt

*Korespondencija: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche može poboljšati pamćenje

SAŽETAK

Fenotipske varijacije su osnovni preduvjet za evoluciju stanica i organizma prirodnom selekcijom. Dok je uloga stohastičke genske ekspresije u fenotipskoj raznolikosti genetski identičnih ćelija dobro proučena, malo se zna o odnosu između ekspresije stohastičkog gena i individualnih varijacija ponašanja kod životinja. Pokazali smo da je specifična miRNA (miR-466f-3p) povećana u hipokampusu dijela pojedinačnih inbred miševa nakon zadatka Morrisovog vodenog lavirinta. Značajno je da miR- 466f-3p pozitivno reguliše morfologiju neurona, funkciju i prostorno učenje, imemorijasposobnosti miševa. Mehanički, miR-466f-3p potiskuje prevođenje MEF2A, negativnog regulatora učenja/memorija. Konačno, pokazujemo da je različita regulacija hipokampalnog miR-466f-3p rezultat randomizirane fosforilacije hipokampalnog cikličkog AMP (cAMP)-response element-binding element-binding (CREB) kod pojedinaca. Ovaj nalaz modulacije prostornog učenja imemorijaputem randomizirane signalne ose hipokampusa nakon neuronske stimulacije predstavlja demonstraciju kako varijacija u ekspresiji gena tkiva dovodi do različitog ponašanja životinja.

UVOD

Fenotipske varijacije među individuama daju evolucionu prednost jer obezbjeđuju raznolikost populacije na koju djeluje prirodna selekcija (Pavlicev et al., 2011). Genetska pozadina i faktori okoline doprinose stvaranju takvih prirodnih varijacija (Bendesky i Bargmann, 2011). Eksperimentalno, inbred miševi su često korišteni za proučavanje molekularne i ćelijske osnove prosječnih fenotipova i ponašanja kako bi se minimizirali efekti genetskih razlika među testiranim jedinkama (Caselas, 2011). Međutim, varijacije u obilju transkripta tkiva su prikazane između pojedinačnih izogenih miševa. Geni koji pokazuju vrlo varijabilne nivoe ekspresije često su povezani sa imunološkom funkcijom, odgovorima na stres i hormonskom regulacijom, tj. procesima osjetljivim na znakove okoline (Vedell et al., 2011). Neke od ovih studija su također pokazale da razlike u ekspresiji gena ili ćelijskoj signalizaciji, sa ili bez utjecaja faktora okoline kao što su lizanje majke, opskrba hranjivim tvarima u maternici, ili otpornost izazvana stresom u odnosu na osjetljivost (Bale, 2015; Danchin et al. ., 2011; Lorsch

et al., 2019; Pedersen et al., 2011.), može dovesti do razlika u fenotipovima i ponašanju (Casellas, 2011; Locke et al., 2015; Loos et al., 2015; Oey et al., 2015).

Prostorno učenje imemorijaformacija koju kontrolira mozak može se podijeliti u dva sistema: (1) egocentrična navigacija koja koristi samopokret i unutrašnje znakove i (2) alocentrična navigacija koja prvenstveno uključuje hipokampus i obližnje moždane strukture koja je stimulirana distalnim znakovima izvan organizama (Ekstrom et al., 2014). Sposobnost prostornog učenja imemorijaomogućava većini životinjskih vrsta da progresivno prilagođavaju svoje ponašanje kako bi se prilagodili u prostorno i vremenski promjenjivim okruženjima, što je ključno za njihov opstanak. Ovo se može procijeniti na laboratorijskim životinjama primjenom paradigmi ponašanja kao što je Morrisov vodeni labirint (MWM) (Vorhees i Williams, 2014). Posebno, pokazalo se da genetski identični inbred glodavci pokazuju fenotipske varijacije u prostornom učenju imemorija(Tsai et al., 2002), ali osnovni mehanizmi ove varijacije ponašanja ostali su nepoznati.

Formiranje novih sjećanja je složen proces koji zahtijeva genetsku transkripciju zavisnu od aktivnosti, sintezu novih proteina i

Slika 1. Korelacija između varijacije prostornog učenja imemorijasposobnost i miR-466f-3p indukcija

(A) MWM zadatak divljeg tipa inbred C57BL/6J miševa. Lijeva ploča: MWM performanse GLN miševa (tačke) i PLN miševa (kvadrati). Od ukupno 289 testiranih miševa, 180 je kategorizirano kao GLN i 109 kao PLN. Desni panel: probetest MWM zadatka (n=47 i 30 u svakoj grupi). Mjere zadržavanja četiri kvadranta i region platforme se upoređuju u histogramu. P, mjesto nestale platforme; T, ciljna zona bez P; R, desna zona; O, suprotna zona; L, lijeva zona. (B) RT-qPCR analiza ekspresije miRNA. Relativni nivoi ekspresije šest miRNA lociranih unutar klastera miR-466-669 i miR-132-3p, kao pozitivne kontrole obogaćene mozgom, analizirani su i normalizirani internom kontrolom U6 snRNA iz GLN i PLN mišjeg hipokampusa (n=9–18 po grupi). I, miR{16}}f- 3p; II, miR{18}}g; III, miR{19}}i-3p; IV, miR{21}}b-3p; V, miR{23}}f; VI, miR{24}}f; VII, miR{25}}str.

fino podešeno specifično neuronsko umrežavanje kaomemorijaengrame za stvaranje novih neuronskih veza i trajnu plastičnost (Asok et al., 2019.). Engrami hipokampusa, koji su rijetke populacije neurona u dentat gyrusu (DG), predstavljaju ansambl neurona koji pokazuju povećanu aktivnost nakonmemorijaformiranje. Dok neuroni DG engrama pokazuju vrlo različit obrazac ekspresije gena (Rao-Ruiz et al., 2019.), engram specifični molekularni mehanizmi koji su u osnovimemorijakonsolidacija ostaje uglavnom nepoznata. Poznato je da različiti faktori i signalni putevi pozitivno ili negativno regulišu učenje imemorijaidentificirani su procesi (Abraham et al., 2019; Humeau i Choquet, 2019). Među njima, aktivirani oblik cikličkog AMP (cAMP)-odgovornog proteina koji vezuje elemente (CREB) stimulira transkripciju gena kao odgovor na povećanje intracelularnog Ca2 plus u neuronima ovisno o aktivnosti (Kandel, 2012). S druge strane, camp/PKApathway repressesmyocyteenhancer factor 2 (MEF2) transkripciona aktivnost sprečavanjem nuklearnog izvoza njegovog ko-represora, HDAC5, i nuklearnog uvoza koaktivatora NFAT (Belfield et al., 2006). Nadalje, za razliku od CREB-a, aktivnost MEF2A ograničavamemorijaformiranje (Cole et al., 2012). Osim proteinskih faktora, mikroRNA (miRNA) su također uključene u regulaciju neuronskih funkcija, uključujući učenje i pamćenje (McNeill i Van Vactor, 2012). miRNA su male (22 nt) nekodirajuće RNK koje primarno djeluju kao post-transkripcijski regulatori ekspresije gena putem uparivanja baza specifičnih za sekvencu sa njihovim mjestima prepoznavanja u 30 neprevedenih regija (30 UTR) specifičnih mRNA (Daugaard i Hansen). miRNA sudjeluju u nizu signalnih puteva u postmitotskim neuronima i posreduju u ćelijskim procesima zavisnim od aktivnosti, uključujući rast i grananje dendrita, formiranje sinapsi i sazrijevanje. Regulirajući ekspresiju gena, oni također igraju važnu ulogu u dugotrajnim oblicima sinaptičke plastičnosti koji su u osnovimemorijaformiranje, pronalaženje i konsolidacija (Chen i Shen, 2013; Wang et al., 2012b).

U nastavku predstavljamo dokaze o uzročnoj vezi između stohastičke ekspresije gena u tkivu i individualnih varijacija ponašanja kod životinja. Konkretno, pokazujemo da stohastička aktivacija hipokampalne CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A ose modulira individualnu varijaciju prostornog učenja imemorijasposobnost kod inbred miševa.

REZULTATI

Individualna varijacija prostornog učenja imemorijasposobnost je u korelaciji sa miR-466f-3p indukcijom iz specifičnog klastera miRNA

Identificirati miRNA uključene u regulaciju učenja imemorijaformacije, koristili smo zadatak MWM da razlikujemo inbred divljeg tipa C57BL/6J miševa sa dobrim ili lošim sposobnostima učenja i pamćenja (Slika 1A). Definirali smo miševe koji su završili zadatak u roku od 30 s u posljednjoj (6.) sesiji kao "dobre učenike" (GLN), dok su miševi koji nisu mogli pronaći platformu u roku od 30 s u posljednjoj sesiji smatrani "lošim učenicima" ' (PLN). Kao što je prikazano na slici 1A (lijevi panel), 62 posto miševa pripadalo je GLN grupi (180 od 289 miševa), pokazujući značajno smanjenje latencije bijega sa 98,1 s (1. sesija) na 21,8 s (6. sesija). Nasuprot tome, latencija bijega preostalih 38 posto miševa, PLN grupe (109 od 289 miševa), samo je umjereno smanjena između prve i šeste sesije (sa 111,8 s u 1. sesiji na 82,1 s u 6. sesiji) . Test sonde, koji je pokazao da su miševi zaista naučili zadatak tokom šest sesija, također je pokazao da su GLN miševi ostali duže u području platforme od PLN miševa (Slika 1A, lijevi par šipki na desnom panelu).

Zatim smo analizirali RNK iz hipokampusa GLN i PLN miševa hibridizacijom miRNA mikromreža (n=4 svaka grupa). Općenito, uočili smo relativno male razlike u profilima ekspresije miRNA hipokampusa kod GLN i PLN miševa. Međutim, primijetili smo da je svih 10 najboljih miRNA za koje su nivoi ekspresije bili viši kod GLN miševa nego kod PLN miševa (podaci nisu prikazani) izvedeno iz istog klastera miRNA specifičnog za glodare, miR-466-669, smještenog u intronu 10 gen mSfmbt2 (vidi dolje). Na osnovu reverzne transkripcije-kvantitativne lančane reakcije polimeraze (RT-qPCR) analize nivoa ekspresije odabranih miRNA u klasteru, odabrali smo miR-466f-3p za dalje istraživanje (slika 1B). Prosječna ekspresija ove miRNA bila je 15-put veća u hipokampusu GLN miševa u odnosu na PLN miševe. Značajno je da su prosječni nivoi hipokampalnog miR-466f-3p bili slični među PLN grupom, kontrolnom grupom kućnog kaveza (HC) i kontrolnom grupom za plivanje (slika 1C), čime su isključeni efekti povezani s vježbanjem tokom plivanje i dalje podržavajući ideju da je miR-466f-3p izazvan tokom prostornog učenja imemorijaformiranje.

Na slici 1C, podaci otkrivaju da su nivoi ekspresije hipokampalnog miR-466f-3p preko 42 posto GLN miševa bili najmanje 1.5-put veći od prosječnog nivoa ekspresije HC kontrolnih miševa, dok su nivoi u 15 posto PLN miševa bili upola manji od HC miševa. Otprilike 25 posto GLN miševa i 55 posto PLN miševa imalo je slične nivoe miR-466f{{10}}p (0.8- do 1.2- preklopiti u odnosu na HC). Pearson-ov dijagram korelacije koji pokazuje pozitivnu korelaciju između nivoa miR-466f-3p i postotnog trajanja na platformi tokom testa sonde prikazan je na slici 1D. Također smo izvršili miR-466f-3p i U6 malu nuklearnu RNK (snRNA) in situ hibridizaciju (ISH) moždanih rezova i kod GLN i PLN miševa (Slika 1E). Statistička analiza miR- 466f-3p signala putem ISH je potvrdila da je indukcija miR-466f- 3p zaista veća u DG GLN miševa u odnosu na

PLN miševi, dok nije pronađena razlika kada su upoređivani U6 snRNA signali (desni histogram, slika 1E). Iako miR-466-3p signali nisu bili jednaki među pojedinačnim ćelijama granula u DG, oni su se i dalje značajno i sveprisutno povećali u hipokampusu GLN miševa u poređenju sa PLN miševima. Stoga se indukcija miR-466f-3p nije dogodila samo u malom dijelu ćelija, npr. u neuronima engrama. Ovi podaci ukazuju da je povećanje miR-466f-3p tokom MWM zadatka usko povezano sa boljim prostornim učenjem imemorijasposobnost među značajnom proporcijom GLN miševa.

Također smo analizirali prosječne nivoe ekspresije nekoliko miRNA specifičnih za mozak pomoću RT-qPCR. Među njima, miR-132-3p je povećan u hipokampusu miša nakon MWM zadatka, ali nismo uočili značajne razlike između GLN i PLN grupa (bar par VII, Slika 1B). Nivoi ekspresije miR-335-5p i miR-22 bili su slični među grupama GLN, PLN i HC (Slika S1A). Dakle, za razliku od miR-466f-3p, hipokampalna ekspresija ovih miRNA tokom MWM treninga nije u korelaciji sa prostornim učenjem imemorijasposobnosti miševa.

miR-466f-3upregulacija potiče rast neurita i formiranje dendritične kičme

Da bismo potvrdili da je miR-466f-3p zaista eksprimiran u neuronima, izveli smo miRNA ISH u kombinaciji sa imunofluorescentnim (IF) bojenjem NeuN i MAP2 u primarnim neuronima hipokampusa. Rezultati su pokazali da je slično kao i druge miRNA (Cohen et al., 2011; Thomas et al., 2017), miR-466f-3p uglavnom eksprimiran u području neuronske some, uz neke dodatne signale u dendritima (slika S2A). Razumjeti molekularnu i ćelijsku osnovu povezanosti pojačano reguliranog miR-466f-3p s učenjem imemorijaformiranje, prvo smo privremeno prekomjerno eksprimirali miR-466f-3p zajedno sa dsRed fuzionim polipeptidom pod kontrolom ubikvitinskog promotora iz pFUGW-miR-466f-3p- dsRed plazmid u DIV10 primarne hipokampalne neurone (slika S2B). Putem miRNA ISH, potvrdili smo da je miR-466f-3p signal jači u miR-466f-3p grupi prekomjerne ekspresije u odnosu na vektorsku kontrolu ili mutant miR{{ 12}}f-3p grupa (strelice, slika S2B). Paralelno, uspostavili smo i platformu za ispitivanje efekta gubitka funkcije miR-466f-3p inhibicijom miR-466f-3p koristeći miR-spužvu koja se nalazi u 30 UTR EGFP mRNA eksprimirane iz pFUGW-miR-spužva-EGFP plazmida (slika S2C). EGFP reporter u spužvastom plazmidu služio je i kao indikator efikasnosti transfekcije i kao senzor aktivnosti stanične miRNA (Kluiver et al., 2012). U značajnom dijelu transficiranih HEK293T ćelija, EGFP signal se smanjio nakon ko-ekspresije s divljim tipom miR-466f-3p, ali ne i s mutantnim miR-466f{{32 }}p, zbog inhibicije translacije EGFP mRNA vezivanjem miR-466f-3p za miR-spužvu u 30 UTR (uporedite četiri lijeve slike i dva his-programa, slika S2C) . Nasuprot tome, nismo primijetili smanjeni EGFP signal nakon ko-ekspresije kontrolnog sunđera koji kodira osam kopija kodirane sekvence iz pFUGW-SCR- spužva-EGFP plazmida sa miR-466f-3p ili njegov mutant (uporedite četiri desne slike i dva histograma).

Kao što je prikazano na slici 2A, ektopična ekspresija miR-466f-3p rezultirala je morfološkim promjenama neurona, posebno pojačanim izrastanjem neurita u odnosu na kontrolne neurone transficirane vektorom pFUGW- koji ekspresira dsRed dsRed ili mutantni miR-466f-3p-ekspresirajući plazmid pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. Podaci kvantifikacije pokazali su da prosječan broj dendritskih grana po neuronu nije bio značajno različit između grupe miR-466f-3p-preko ekspresije (traka II) i vektorske ili mutantne kontrole (barovi I i III) (desno gornji histogram, slika 2A). Međutim, srednja ukupna dužina dendrita i srednja dužina primarnih dendrita su se povećale nakon prekomjerne ekspresije miR-466f-3p (uporedite traku II sa trakama I i III, desni donji histogram na slici 2A). Paralelno s tim, inhibirali smo endogeni miR-466f-3p pomoću miR-spužve. Kao što se vidi, nije bilo značajne razlike u broju dendritskih grana između miR-466f-3p-inhibicije i kontrolne grupe (uporedite traku IV sa trakama I i V, desni gornji histogram, slika 2A) , ali grupa miR-466f-3p-inhibicije pokazala je značajno smanjenje srednje ukupne dužine dendrita, kao i srednje dužine primarnih i sekundarnih dendrita u odnosu na druge grupe (uporedite traku IV sa trakom I i V, desni donji histogram na slici 2A). Nadalje, IF bojenje je pokazalo da prekomjerna ekspresija miR- 466f-3p, ali ne i inhibicija, također povećava gustinu dendritskih bodlji (Slika 2B, gornji paneli i donji lijevi histogram). Također smo izvršili zajedničko bojenje za protein postsinaptičke gustine 95 (PSD-95) i izbrojali gustinu kolokaliziranih dendritskih bodlji kako bismo ustanovili tačan broj ekscitatornih sinapsi (slika 2B, donji desni histogram), što je otkrilo da miR{{40 }}f-3p prekomjerna ekspresija povećala je gustinu PSD-95-pozitivnih bodlji u poređenju s drugim kontrolnim grupama. Međutim, miR-466f-3p inhibicija nije značajno promijenila gustinu PSD-95-pozitivnih bodlji u odnosu na kontrolne grupe (Slika 2B, donji desni histogram). Zajedno, ovi podaci ukazuju da u odsustvu neuronske stimulacije, sama inhibicija miR-466f-3p ne utiče na gustinu ekscitatornih sinapsi ili ukupne dendritske bodlje.