Oksidativni stres, disfunkcionalni energetski metabolizam i destabilizirajući neurotransmiteri promijenili su cerebralni metabolički profil u modelu štakora simuliranog ronjenja sa zasićenjem helioksa na 4.0 MPa Ⅱ

Postupak ekstrakcije tkiva

Procedura ekstrakcije polarnih metabolita iz uzoraka tkiva bila je manja modifikacija kao što je objavljeno [18]. Prethodno izvagani uzorci smrznutog tkiva su odmrznuti na ledu, a zatim podvrgnuti mehaničkoj homogenizaciji u ledeno hladnom HPLC sistemu rastvarača metanol-hloroform-voda (400 μL, 400 μL, odnosno 285 μL na 100 mg moždanog tkiva) koristeći homogenizator tkiva (Precellys 24, Bertin Technologies, Villeurbanne, Francuska). Dobijeni homogenati su držani na ledu tokom perioda od 30 minuta, a zatim centrifugirani na 12,000 xg tokom perioda od 10 minuta na 4˚C. Supernatant svakog uzorka je zatim uklonjen i liofiliziran kako bi se dobio prašak koji sadrži polarne metabolite u zamrzivaču (FD-1A-80, BIOCOOL, Kina). Svaki uzorak praha je naknadno rekonstituisan sa 550 μL PBS pufera koji ima 0,1 posto TSP, a svi uzorci su zatim temeljito promiješani i centrifugirani na 12,000 xg tokom perioda od 20 minuta na 4˚C. Alikvot od 500 μL supernatanta je zatim prebačen u NMR epruvetu prečnika 5,0 mm (Norrel, UK). Princip ekstrakcije proteina u uzorku korteksa bio je kao što je prethodno opisano bez modifikacija. Tačna količina uzoraka korteksa sipana je u pufer za homogenizaciju (HEPES 25 mmol/L, pH 7,4, MgC12 5 mmo1/L, DTT 2 mmol/L, EDTA 1,3 mmol/L, EGTA 1 mmol/L, 0,1 posto Triton X-100, aprotinin, pepstatin A i leupeptin 10 ug/ml svaki) i homogenizirati ručno u ledenom kupatilu. Smjesa je centrifugirana na 1,000 xg tokom perioda od 10 min na 4˚C, a supernatant je korišten za kvantificirane koncentracije proteina korištenjem Bradfordovog testa.

Kliknite ovdje da biste saznali Cistanche antioksidacijsku funkciju

Biohemijski test

Osetljivi, kompetitivni enzimski imunosorbentni test (ELISA) primenjen je sa setovima za određivanje kvantifikacije metaboličkih enzima Na-KATPaze i AChE i neurotransmitera DA, E, NE, 5HT i GABA. ELISA je takođe odredila nivoe SOD, MDA i GPx u kortikalnom tkivu pomoću kompleta za analizu prema uputstvima proizvođača.

NMR mjerenje

Efikasna kvantifikacija metabolita tkiva postignuta je korištenjem analitičke platforme zasnovane na tečnom Bruker Avance-III NMR spektrometru visoke rezolucije opremljenom kriogenom sondom visoke osjetljivosti koja radi na frekvenciji od 600. 17 MHz za 1 H posmatranje na 298 K. Vodom potisnuta jednodimenzionalna 1 H ZGPR (TOPSPIN verzija 3.0, Bruker Biospin) impulsna sekvenca (RD-90˚-ACQ) je primijenjena na prikupiti NMR podatke za svaki uzorak. Četiri lažna skeniranja i 128 tranzijenta su snimljeni u vremenskom domenu od 32 K tačaka podataka koristeći širinu spektra od 20 ppm sa kašnjenjem relaksacije od 10,0 s i vremenom akvizicije od 2,73 s. Eksponencijalna funkcija proširenja linije od 0,3 Hz i popunjavanje nulom do 64 K tačaka podataka primijenjena je na sve slobodne indukcijske raspade (FID) prije Fourierove transformacije. Dodatne dvodimenzionalne NMR tehnike sa korelacionom spektroskopijom pulsirajućeg polja (gCOSY) i 2D homonuklearnom totalnom korelacionom spektroskopijom (TOCSY) korišćene su korišćenjem standardnih impulsnih programa na odabranim uzorcima da bi se potvrdili hemijski pomaci. U akviziciji svih spektra korišten je automatizirani izmjenjivač uzoraka za kontinuiranu isporuku uzoraka.

Identifikacija i potvrda metabolita

NMR signali zasnovani na lokaciji pojedinačnih rezonancija na spektru identifikovani su u softverskom paketu Chenomx NMR Suite v. 8.4 (Evaluation verzija). Potvrde nekih dodjela metabolita provedene su uzimajući u obzir kemijske pomake, konstante spajanja i množestvene obrasce metabolita kao informacije o skalarnim spregama izvađenim iz 1 H–1 H COSY, 1 H–1 H TOCSY, javnih NMR baza podataka kao što su COLMAR i Human Metabolome Baza podataka (HMDB) i literatura [18, 19].

Multivarijantna statistička analiza

Protokol pretprocesiranja korišten za prethodnu obradu svakog 1D 1 H NMR spektra bio je isti kao onaj opisan u našem prethodnom radu [20]. 1H NMR spektri su fazni i korigovani na osnovu korišćenja MestReNova (Mestrelab Research, SL, Španija), a spektralni region svakog metabolita je integrisan u jednu kantu. Rezonancije signala organskog rastvarača i rezidualnog H2O/HOD signalnog područja su uklonjene u svim 1D 1 H NMR spektrima. U svim spektrima je primijenjena 0.{{30}}03 Hz bucket procedura i normalizacija na zbir spektralnog intenziteta pomnoženog sa 10000. Za analizu u sljedećem koraku odabrane su samo najveće bucket vrijednosti u jednom vrhuncu kako bi se izbjegla pogrešna interpretacija diskriminantnih metabolita zbog preklapanja signala. Nakon toga, izdvojene su integralne kante od 47 metabolita i podvrgnute univarijantnoj i multivarijantnoj analizi podataka. Analiza diskriminacije analizom glavnih komponenti (PCA) i analiza diskriminacije parcijalnom analizom najmanjih kvadrata-diskriminantnom analizom (PLS-DA) i ortogonalnim projekcijama na latentne strukture diskriminantnom analizom (OPLS-DA) izvršena je korištenjem SIMCA-P plus 14.0 softverskog paketa (Umetrics , Umeå, Švedska) skalirani na podatke o jediničnoj varijansi. PCA i PLS-DA bodovni grafikoni su ilustrovani sa prvom i drugom glavnom komponentom (t[1], t[2]), dok je OPLS-DA rezultat koristio t[1] i ortogonalnu komponentu (to[1 ]). Parametri Q2 (cum), R2Y (cum) i R2X (cum) izračunati su kako bi se testirala robusnost modela diskriminacije protiv prekomjernog prilagođavanja [21]. Kao što je prethodno opisano, vrijednost procjene kvaliteta od Q2 � 0,4 smatra se pouzdanim modelom. Sedmostruka strategija unakrsne validacije i test permutacije 200 puta s prvom komponentom primijenjeni su kako bi se zaštitili od preopterećenja modela i dodatno potvrdili pouzdanost i pouzdanost modela. Ako je linija regresije Q2 imala negativan presek i vrijednosti Q2 postavljene u krajnjoj lijevoj tački bile su veće od svih Q2 vrijednosti desnih tačaka u permutiranom testu, uspostavljeni OPLS-DA model bio je robustan [22]. Zadana strategija 10-fold unakrsne provjere primijenjena je da se zaštiti od preopterećenja modela. Općenito, statistika procjene kvaliteta (Q2) � 0,4 se smatra pouzdanim modelom, kao što je prethodno opisano. Koeficijenti korelacije (r) i VIP vrednosti ekstrahovani iz OPLS-DA modela su korišćeni za identifikaciju metabolita koji su značajno doprineli razdvajanju između dve grupe. Dodatno, zbirne promjene metabolita između grupa izračunate su korištenjem funkcije. IA/IB, gdje IA i IB predstavljaju srednje vrijednosti za integral metabolita u A i B grupama, respektivno. Toplotna mapa i dijagrami su ucrtani kako bi se olakšalo razumijevanje varijacija metabolita među grupama.

Univarijantna statistika integrala metabolita

Prosjek metabolita u svakoj grupi izražen je kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Univarijantna analiza je također provedena korištenjem ANOVA (analiza varijanse). Statistički značajne razlike između grupa procenjene su nesparenim t-testom od dva repa nakon konverzije log u softveru GraphPad Prism V 8.4.3 (Graph Pad Software Inc., San Diego, Kalifornija, SAD). Statistički značajne razlike definirane su vrijednostima p (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

Sistemska statistička analiza metaboličke korelacije i hijerarhijska klaster analiza

Izračunavanje Pearsonovog koeficijenta korelacije i hijerarhijska analiza klastera izvedeni su na osnovu relativnih integrala metabolita u R Studio (verzija 1.4.1717) sa malim skriptama. Za svaki par grupa, matrica korelacije je ilustrovana u mapi piksela kako je opisano u literaturi [21]. Ukratko, za svaku varijablu u jednoj grupi, korelacije sa p vrijednostima manjim od 0.05 su se smatrale značajnim statističkim korelacijama i držane su kako bi se konstruirala konačna mreža korelacija kako bi se ilustrovali latentni odnosi metabolita unutar grupe i poremećenih metaboličkih odnosa među grupama. Crveni kvadrati ukazuju na značajniju pozitivnu korelaciju. Plaviji kvadrati ukazuju na značajniju pozitivnu korelaciju. Bijeli kvadrati označavaju korelaciju bez značaja. Analiza najrelevantnijih cerebralnih metaboličkih puteva i mreža invokiranih kao ispitanici na HSD izvršena je pomoću alata MetaboAnalyst 3.0. Za izvršenu analizu topologije puta odabrana je biblioteka puteva Rattus norvegicus (pacova) sisara. Ovaj pristup je također korišten za pružanje procjena utjecaja na put, stope lažnog otkrivanja (FDR) i p vrijednosti.

Rezultati Kortikalni biohemijski indeksi iz HSD i CON grupa

Da bi se potvrdili efekti metaboličke promjene HSD-a na moždano tkivo, biokemijski parametri, uključujući metaboličke enzimske aktivnosti Na-KATP, AChE i LDH, neurotransmitera DA, E, NE, 5HT i GABA povezane s metabolizmom energije, i theproteini povezani sa oksidativnim stresomofSOD, MDA, i Gpx u tkivima ipsilateralnog korteksa HSD i CON pacova su također određeni (Tabela 1). U poređenju sa kontrolnom grupom, nivoi DA, E, NE i MDA su značajno povećani, dok je sadržaj Na-KATP, AChE, LDH, 5HT, GABA, SOD i Gpx smanjen u HSD modelu. Granica detekcije kompleta za analizu korišćenih u ovom radu navedena je u S3 tabeli u fajlu sa dodatnim materijalima.

Tabela 1. Kvantifikacija biohemijskih parametara mjerena je u CON i HSD životinjama tkiva korteksa pomoću ELISA-e sa setovima za analizu. (srednja vrijednost ± SD). ukazuje na statističku značajnost.

Metaboliti identifikovani u 1H NMR spektrima uzoraka moždanog tkiva

Slika 3 prikazuje tri reprezentativna 1H NMR spektra iz korteksa (slika 3A), hipokampusa (slika 3B) i strijatuma (slika 3C) HSD pacova. Prema 1 H NMR podacima uzoraka moždanog tkiva identifikovan je širok spektar istaknutih metabolita, a to su anioni organske kiseline (laktat (Lac), malonat (Maln), sukcinat (Suc), malat (Mal), fumarat (FMA). ), 2-hidroksibutirat (2-HB), acetat (Ace), format (For), taurin (Tau), askorbat (Asc), 2-hidroksibutirat (2HIB)), aminokiseline (leucin (Leu), izoleucin (Ile), valin (Val), alanin (Ala), glicin (Gly), tirozin (Tyr), fenilalanin (Phe), aspartat (Asp), glutamin (Gln), glutamat (Glu) , treonin (Thr), serin (Ser), lizin (Lys), asparagin (Asn)), neurotransmiteri (-aminobutirat (GABA)), metaboliti povezani sa energijom (kreatin (Cre), adenozin trifosfat (ATP), adenozin monofosfat ( AMP)), metaboliti srodni fosfolipidima (Ofosfoetanolamin (PEA), O-fosfoholin (Pcho), sn-glicero{14}}fosfoholin (GPC)) i drugi (mio-inozitol (MI), nikotinamid adenin dinukleotid (NAD plus ), nikotinična kiselina (Nic), N-acetilaspartat (NAA), nikotinamid-adenin-dinukleotid fosfat (NADP plus), UDP-N- galaktoza (UDPGa), uridin (Uri), uracil (Ura), cistidin (Cyt) , uridin 5'- monofosfat (UMP), inozin 5'-monofosfat (IMP), inozin (Ino), holin (Cho), karnitin (Car), glutation (GSH). S1 Tabela prikazuje detaljne informacije o dodjeli metabolita.

Promjene metaboličkog profila otkrivene metabolomskom analizom

PCA, istraživački i nepristrasan pristup analizi 1H NMR spektra iz svih ekstrakata mozga u različitim regijama mozga, prvi put je napravljen da otkrije glavne metaboličke trendove vođene hiperbaričnom izloženošću 400 msw okruženje zasićenja helioksom. Grafikon raspršenja PC1 u odnosu na PC2 dobijen iz PCA (S1A–S1C slika) integralnih podataka u kanti otkrio je određenu diskriminaciju sa određenim preklapanjem između dvije klasifikacije. Nadzirana istraživanja modela PLS-DA (S1A'–S1C' slika) i OPLS-DA (slike 4A–4C) pokazala su jasnu klasnu diskriminaciju metaboličkih profila između grupa. Slika 4 prikazuje grafikone rezultata OPLS-DA modela za regiju korteksa (A), regiju hipokampusa (B) i regiju strijatum (C), pokazujući jasnu diskriminaciju između HSD grupa i kontrola. Visoka objašnjena varijacija i dobrota predviđanja koja se ogleda u vrijednostima R2X i Q2 (S1A'–S1C' slika, slika 4A-4C) i dijagramima testa permutacije (slika 4'-4C'A) ukazuju na robusnost generisanih nadziranih modela. Koeficijent korelacije (r) ekstrahovan iz dijagrama S-linije, varijabilne važnosti u projekciji (VIP) i p-vrijednosti iz neparametarskih univarijatnih testova prikupljeni su da bi se procijenili značajni metaboliti odgovorni za klasno-diskriminirajuće obrasce. Stoga, ispunjavajući bilo koji od tri kriterijuma (apsolutna vrijednost r veća od 0.50, vrijednost VIP veća od 1.0, zajedno sa p vrijednošću manjom od 0.05), odabrali smo panel statistički značajnih metabolita (Tabela 1) odgovorna za razdvajanje između CON i HSD grupa. U Tabeli 1, vrijednosti fold-change veće od 1 ukazuju na povećani nivo u HSD grupi, dok vrijednosti fold-change manje od 1 ukazuju na smanjeni nivo u HSD grupi. Srednje vrijednosti SD diskriminativnih metabolita navedene su u tabeli S2. Koristeći hijerarhijsku klaster analizu metabolita i metodu prosječnog povezivanja, generirana toplotna mapa (slike 5A-5C) sa dendrogramima omogućava bolju vizualizaciju tri metaboličke promjene u području mozga uzrokovane hiperbaričnom izloženošću u okruženju zasićenom helijumom kisikom.

Metabolički poremećaji uočeni u različitim regijama mozga HSD pacova

Gore spomenuta multivarijantna analiza i univarijantna analiza koristeći visinu metabolita u različitim grupama pružile su sjajnu radnu cijev za identifikaciju diskriminativnih metabolita otkrivajući potencijalne neurološke metaboličke promjene povezane s HSD događajima. Povišeni AMP, FMA, Nic i Phe i smanjenje Ala, Asn, Car, Cho, Cyt, GABA, GSH, Ino, Lac, Pcho, Phe, Tyr, Ura i Uri pronađeni su u tkivu korteksa HSD-a u poređenju sa CON grupom (slika 5A, tabela 1). U međuvremenu, u hipokampusu, Ala, GSH, Lac, Uri, Cyt, GABA, Tyr i Ura su se takođe smanjili, a AMP se povećao u HSD grupi, kao i u korteksu. Štaviše, povećani Thr i smanjeni Gly, ATP, Tau, Imp, Suc, Asc i DMA su izraženi u ekstraktima hipokampusa HSD grupe u odnosu na kontrole (Slika 5B, 5D, Tabela 1). U poređenju sa grupom CONS, sadržaj Cyt, GABA, Ura, Cho i Thr također se smanjio kao i u korteksu i hipokampusu. Dodatno, povećani nivoi aminokiselina razgranatog lanca (BCAA, uključujući Leu, Ile, Val) i Lys i smanjeni nivoi Gln, NAA, NAD plus, NADP plus, Asp, serije metabolita ATP, Tau, IMP, i Suc, koji se također smanjio u hipokampusu, i još dva metabolita, Ino i Pcho, koji su također smanjeni u korteksu, uočeni su u strijatumskim tkivima pacova HSD grupe (Slika 5C, 5D, Tabela 1). Toliko mnogo metabolita uvijek ukazuje na implicirane molekularne puteve sa složenošću i raznolikošću. Integralne vrijednosti diskriminantnih metabolita su kvantificirane, a statistički značajne kratke promjene njihovih koncentracija između helioks-saturacije-hiperbarično izložene i kontrolne grupe sumirane su u S2 tabeli i tabeli 2 za tri regiona mozga.

Slika 4. Ortogonalna diskriminantna analiza parcijalnih najmanjih kvadrata (OPLS-DA) skor dijagrami i dijagrami testa permutacije koji diskriminiraju efekat 400 msw izlaganja helioksu na 1H NMR spektre iz kontrolnih grupa u korteksu (CONC, n=8, HSDC, n=8, A i A') (R2X=0.38; Q2=0.46), hipokampus (CONH, n {{12} }, HSDH, n=8, B i B') (R2X=0.37; Q2=0.43), i strijatum (CONS, n=8, HSDS, n=8, C i C') (R2X=0.39; Q2=0.40). Vrijednosti Q2 parametra u grafikonima OPLS-DA rezultata, koje su bile jednake ili veće od 0,40, zajedno sa Q2 vrijednostima krajnje lijeve tačke u permutiranim modelima bile su veće od svih ugrađenih Q2 vrijednosti desnih tačaka (permutacija testirati 80 puta), što ukazuje da su uspostavljeni OPLS-DA modeli validni.

Pcho, koji se također smanjio u korteksu, primijećen je u strijatumskim tkivima pacova HSD grupe (Slika 5C, 5D, Tabela 1). Toliko mnogo metabolita uvijek ukazuje na implicirane molekularne puteve sa složenošću i raznolikošću. Integralne vrijednosti diskriminantnih metabolita su kvantificirane, a statistički značajne kratke promjene njihovih koncentracija između helioks-saturacije-hiperbarično izložene i kontrolne grupe sumirane su u S2 tabeli i tabeli 2 za tri regiona mozga.

Slika 5. Heatmap i statistički korelacijski grafikoni izvedeni iz bucket vrijednosti diskriminirajućih metabolita iz korteksa (A, A', HSDC uzorci leže u gornjem panelu, a CONC leži u donjem panelu), hipokampusa (B, B', HSDH grupa leži u gornjem panelu, a CONH leži u donjem panelu), i strijatum (C, C', HSDS uzorci leže u gornjem panelu, a CONS leži u donjem panelu) tkiva HSD i CON pacova. Metaboliti na toplotnoj mapi su organizovani hijerarhijskim grupisanjem na osnovu ukupne sličnosti u obrascima nivoa. Venov dijagram (D) koji ilustruje preklapanje metabolita između HSDC-CONC, HSDH-CONH i HSDS-CONS poređenja.

Analiza korelacije metabolita

Odnos između ili između metabolita bio je tako složen na slici 5A'-5C'. Za energetske metabolite, pozitivne korelacije za Lac vs Ala u HSDC, AMP vs IMP u HSDH, ATP vs Pcho u HSDS, Suc vs GABA/Gln/Tyr/NAA u HSDS, i negativne korelacije za Lac vs Thr i GSH vs Suc u HSDH, Suc vs Val u HSDS su bili prisutni u dijagramima korelacije metabolita. Za neurotransmitere, pozitivne korelacije za GABA vs Car u HSDC, GABA vs Cho u CONH, i GABA vs Suc/Ino/Gln u HSDS bile su prisutne u dijagramima korelacije metabolita. Negativne korelacije za GABA vs FMA u CONC i GABA vs NAA/Ura/NADP plus u CONS bile su prisutne u dijagramima korelacije metabolita. Za metabolite koji se odnose naoksidativni stres, thepozitivne korelacijeza GSH vs Asn u HSDC i CONC, Tau vs Lac u HSDH, Tau vs Suc/Ala u CONH, negativne korelacije za GSH vs Suc u HSDH, Tau vs Thr u HSDH bile su prisutne u korelaciji metabolita parcele.

Analiza metabolomskog puta

Kvantitativna analiza puteva koja se sastoji od analize obogaćivanja puteva i uticaja na put od topologije puta otkrila je visoko statistički značajne modulacije izazvane HSD na seriju metaboličkih puteva. Rezultati uticaja putanje, zajedno sa stopom lažnog otkrivanja (FDR) i p vrijednostima, opisani su na slici 6. Putevi su se smatrali značajno obogaćenima ako su vrijednosti p bile niže od 0.05; profilisani metaboliti (pogoci) u odnosu na ukupne metabolite puta (status podudaranja) bili su veći od 1; a rezultati uticaja (koji ukazuju na uticaj značajno pogođenih metabolita na put na osnovu mere topologije mreže relativne centralnosti između) bili su veći od 0. Putevi u korteksu (slika 6A) sa najvećom vrednošću metaboličkog uticaja bili sufenilalanin, tirozin, ibiosinteza triptofana>metabolizam fenilalanina> metabolizam pirimidina > metabolizam alanina, aspartata i glutamata. Putevi u hipokampusu (slika 6B) sa najvećim metaboličkim uticajem bili su biosinteza fenilalanina, tirozina i triptofana > metabolizam glutationa > metabolizam glicina, serina i treonina > metabolizam purina > metabolizam pirimidina > metabolizam alanina i glutamata > metabolizam glutamota . Putevi u striatumu (slika 6C) s najvećim metaboličkim utjecajem bili su metabolizam alanina, aspartata i glutamata > metabolizam nikotinata i nikotinamida > metabolizam purina.

Pitajte za više:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel: plus 86 15292862950