Tokom proteklih nekoliko decenija, naučnici su postigli izuzetan napredak u poboljšanju zdravlja i produženju životnog veka

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

UVOD

Epitelne ćelije sočiva (LEC) formiraju monosloj ćelija koje oblažu prednju kapsulu sočiva i protežu se do ekvatorijalnog dela sočiva [1, 2]. Normalna konstrukcija i funkcija LEC-a su od suštinskog značaja za održavanje transparentnosti i metaboličke homeostaze čitavog sočiva[3]. Sve veći broj dokaza ukazuje da starenje LEC-a može uzrokovati modifikaciju, denaturaciju i agregaciju proteina sočiva uključujući enzime i kristaline, što na kraju dovodi do zamućenja sočiva ili čak katarakte [3-5]. Starosna katarakta (ARC) ostaje vodeći uzrok oštećenja vida i sljepoće, što ozbiljno utječe na kvalitetu života starijih osoba [6]. Trenutno ne postoje efikasne strategije za prevenciju progresije ARC-a. Stoga je potrebno razviti farmakološku intervenciju koja može poboljšati transparentnost sočiva i odgoditi napredovanje ARC-a.

Tokom proteklih nekoliko decenija, naučnici su postigli izuzetan napredak u poboljšanju zdravlja i produženju životnog veka koristeći nekoliko genetskih, dijetetskih i farmakoloških intervencija [7]. Metformin (MET) je jedan od opsežno proučavanih agenasa protiv starenja. Značajne studije sugeriraju da MET može ublažiti starenje i produžiti zdrav životni vijek u različitim sistemima životinjskih modela. MET ne samo da može produžiti životni vijek Caenorhabditis elegans već i poboljšati njegovo zdravlje i vitalnost [8]. MET može smanjiti akumulaciju oštećenja DNK povezana sa starenjem i oksidativnim stresom u matičnim stanicama srednjeg crijeva Drosophila kako bi produžio njihov životni vijek [9]. Prethodne studije također pokazuju da kronična primjena niskih doza MET poboljšava zdravlje i životni vijek miševa [10]. Štaviše, novi dokazi ukazuju na to da kada se pacijenti sa dijabetesom liječe MET-om, oni pokazuju koristi za preživljavanje, čak i kada se uporede s kontrolama koje nemaju dijabetes [11].

KSL09

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Pored aktivnosti MET-a koji promoviše životni vijek u različitim modelnim organizmima, MET cilja na više puteva ćelijskih signala za ublažavanje bolesti povezanih sa starenjem. Pokazalo se da MET modulira autofagiju uglavnom putem aktivacije protein kinaze (AMPK) aktivirane adenozin monofosfatom (AMP) i sprječava neurodegeneraciju i neuroinflamaciju kako bi igrao neuroprotektivnu ulogu u Parkinsonovoj bolesti [12]. Slično, MET poboljšava promjene povezane sa starenjem u sinusoidnoj endotelnoj ćeliji jetre putem AMPK i endotelnih puteva dušikovog oksida [13].cistanche dosage redditŠtaviše, hronična AMPK aktivacija MET-om sprečava kardiomiopatiju tako što povećava autofagiju kod OVE26 miševa sa dijabetesom [14]. Osim toga, MET ublažava kardiovaskularno pogoršanje povezano sa starenjem tako što povećava autofagiju i kalorijsku restrikciju [15]. Nadalje, MET tretman može inhibirati aterosklerozu povezanu sa starenjem kod ApoE-7- miševa i zečeva uzrokovanu ishranom s visokim udjelom masti, značajno sprječavajući kalcifikaciju aterosklerotskog plaka, smanjujući nivoe visokoosjetljivog C-reaktivnog proteina i potiskujući aktivaciju nuklearni faktor kapa B(NF-kB)put u krvnim sudovima [16-18].

Na osnovu ovih zapažanja, ova studija je pokušala istražiti može li MET odgoditi starenje ARC-a i osnovni molekularni mehanizam. Naši nalazi su sljedeći: (i) kronični tretman niskim dozama MET odgodio je starenje LEC-a kod prirodno ostarjelih miševa, čime je inhibirao neprozirnost sočiva; (i) AMPK put je inaktiviran, a autofagični tok je poremećen u senescentnim LEC-ovima; (i) ) hronično liječenje niskim dozama MET odgodilo je starenje LEC-a kod prirodno ostarjelih miševa aktiviranjem AMPK puta i pojačavanjem autofagije. Naši nalazi potkrepljuju navodnu ulogu MET protiv starenja i pružaju dovoljno dokaza da se MET može pokazati kao moguća terapijska opcija za ARC.

REZULTATI

Starenje LEC-a bilo je povezano s ARC-om kod prirodno ostarjelih miševa

Višestruki potencijalni mehanizmi ARC-a, uključujući efekte starenja, su opsežno istraženi.prednosti ekstrakta cistanche,Međutim, veza između starenja LEC-a i ARC in vivo ostaje nejasna. Pretpostavili smo da starenje LEC-a može rezultirati ARC in vivo. Stoga smo konstruirali mišji model ARC-a. Naši rezultati su otkrili da je transparentnost sočiva kod prirodno ostarjelih miševa (stariji miševi) značajno smanjena u odnosu na kontrolnu grupu (mladi miševi) (Sl.1a). Kao što je prikazano na slici 1b, incidencija katarakte u prirodno starijoj grupi bila je 95,23 posto. H&E test bojenja pokazao je da su LEC-ovi u kontrolnoj grupi bili okruglog oblika i pravilno raspoređeni, a gustina normalnih LEC-ova bila je relativno visoka, dok su LEC-ovi prirodno ostarjelih miševa bili ravnog oblika i raspoređeni neravnomjerno, a gustina senescent LECs je značajno smanjen (slika 1c). Pored toga, SA- -Gal bojenje je pokazalo da je omjer starenja LEC-a bio povišen kod prirodno ostarjelih miševa (slika 1d). Nadalje, analizirali smo ekspresiju proteina markera povezanih sa starenjem putem IHC bojenja i Western blot analize. IHC bojenje je pokazalo da je ekspresija p21 i p53 povećana u LEC-ovima prirodno ostarjelih miševa u poređenju sa mladim miševima (Slika 1e, f). Slično, dalje smo otkrili da je ekspresija proteina p21 i p53 veća u kapsulama sočiva prirodno ostarjelih miševa nego u kapsulama sočiva mladih miševa (slika 1g). Ovi rezultati sugeriraju da je starenje LEC-a povezano s ARC-om kod prirodno ostarjelih miševa.

KSL10

Cistanche može protiv starenja

Hronična primjena niskih doza MET poboljšala je transparentnost sočiva i ublažila starenje LEC-a Prije nego što smo testirali učinak metformina na ARC, utvrdili smo da li je kronična primjena malih doza MET bezbedna za miševe. Nakon 10 mjeseci MET tretmana, 28 miševa (18 u prirodno staroj grupi i 10 u MET grupi) umrlo je prirodnom smrću. Otkrili smo da su živi miševi u obje grupe bili zdravi, te da nije bilo značajne razlike u tjelesnoj težini i težini organa između obje grupe (Tabela 1). Stoga su ovi rezultati pokazali da je doza metformina korištena u studiji bila sigurna za životinje i da se može koristiti za naredne eksperimente.

Nakon toga, primijenjen je kronični MET u malim dozama kako bi se procijenilo može li MET inhibirati zamućenost sočiva i ublažiti starenje LEC-a u prirodno ostarjelim miševima. Kao što se i očekivalo, transparentnost sočiva u MET grupi je znatno poboljšana u poređenju sa transparentnošću sočiva u prirodno ostarjeloj grupi (Sl.2a). Osim toga, morfološka zapažanja su potvrdila da je sočivo MET grupe pokazalo smanjenje neprozirnosti. Incidencija katarakte u prirodno starijoj grupi bila je 95,23 posto, dok je u MET grupi bila 19.00 posto (slika 2b). H&E test bojenja je otkrio da je gustina LEC u MET grupi bila znatno veća nego kod prirodno ostarjelih miševa (slika 2c). Štaviše, LEC-ovi MET grupe su bili relativno okruglog oblika u poređenju sa onima iz grupe prirodno stare (Sl.2c). SA- -Gal bojenje je pokazalo da je omjer starih LEC-a značajno smanjen u MET grupi u poređenju sa onim u prirodno ostarjeloj grupi (slika 2d). IHC analiza je otkrila da je ekspresija p21 i p53 smanjena više u LEC-ovima MET grupe nego u prirodno ostarjeloj grupi (Sl. 2e, f). Slično, Western blot analiza je otkrila da je ekspresija proteina p21 i p53 značajno smanjena u kapsulama sočiva MET grupe u poređenju sa onima u prirodno ostarjeloj grupi (slika 2g). Ovi rezultati su ukazivali na to da bi kronična primjena niskih doza MET mogla poboljšati transparentnost sočiva i ublažiti starenje LEC-a.

KSL11

Hronična primjena niskih doza MET-a umanjila je starenje LEC-a kod prirodno ostarjelih miševa putem AMPK aktivacije. Ogromna količina podataka podržava zaključak da je aktiviranje AMPK dovoljno da produži životni vijek u modelnim organizmima, povećavajući njegovu privlačnost kao cilj dugovječnosti [19,20] . Uzimajući u obzir ovu teoriju, procijenili smo ekspresiju AMPK puta u LEC miševa. Relativni nivo FAS mRNA je smanjen u prirodno starijoj grupi i povećan u MET grupi (slika 3a). Kao što je prikazano na slici 3b,c, ekspresija fosforilisanog AMKa (Thr172) i fosforiliranog ACC (Ser79) smanjena je u LEC-ovima prirodno ostarelih miševa u poređenju sa onima kod mladih miševa. Međutim, ekspresija fosforiliranog AMKa (Thr172) i fosforiliranog ACC (Ser79) bila je povišena u LEC-ovima MET grupe u poređenju sa onima u prirodno ostarjeloj grupi. Osim toga, western blot analiza je otkrila da je ekspresija proteina fosforiliranog AMPKa(Thr172) i fosforiliranog ACC (Ser79) značajno smanjena u kapsulama sočiva prirodno ostarjelih, a nivoi ekspresije proteina fosforiliranog AMPKa (Thr172) i ACC (fosforiliranog) Ser79) su povećane u kapsulama sočiva MET grupe (slika 3d). Ovi podaci su otkrili da je AMPK put inaktiviran u LEC-ovima prirodno ostarjelih miševa. Nadalje, kronična primjena niskih doza MET-a oslabila je starenje LEC-a kod prirodno ostarjelih miševa putem AMPK aktivacije.

Hronična primjena niskih doza MET-a obnovila je autofagični tok kako bi se ublažilo starenje LEC-a kod prirodno ostarjelih miševa Prethodne studije su pokazale da autofagija može igrati važnu ulogu u borbi protiv štetnih efekata starenja [21,22]. Da bismo dalje analizirali molekularne i ćelijske promjene u sočivu nakon MET tretmana, odredili smo ekspresiju LC3 i p62 jer su oni široko prihvaćeni kao biomarkeri nivoa autofagije. Kao što je prikazano na slici 4a, relativni nivo ekspresije p62 mRNA značajno je povećan u prirodno ostarjeloj grupi u poređenju sa kontrolnom grupom; međutim, relativni nivo ekspresije mRNA p62 bio je značajno smanjen u MET grupi u poređenju sa onim u prirodno ostarjeloj grupi.cistanche genghis khanPored toga, IHC bojenje je otkrilo da su nivoi proteina 1 lakog lanca 3 (LC3-II/l) i p62 povezanog s mikrotubulama povećani u LEC-ovima prirodno ostarjelih miševa. Nadalje, naši rezultati su pokazali da su nivoi LC3-II/l i p62 značajno smanjeni u LEC-ovima MET grupe (Slika 4b, c). Nivoi proteina LC3-ll i p62 su bili značajno povećani u kapsulama sočiva prirodno ostarjele grupe (slika 4d). Sve u svemu, nagađali smo da je autofagni tok oslabljen u LEC-ovima prirodno ostarjelih miševa i da bi se mogao obnoviti kroničnom primjenom niskih doza MET-a kako bi se ublažilo starenje LEC-a kod prirodno ostarjelih miševa.

DISKUSIJA

Neliječena katarakta je vodeći uzrok sljepoće širom svijeta koju karakterizira zamućenje kristalnog sočiva [23]. Epidemiološke studije su pokazale da je starost dominantan faktor rizika za kataraktu, poznatu kao ARC, a jedini tretman je hirurško uklanjanje [24]. Prethodne studije su pokazale da je starenje LEC-a glavni uzrok ARC-a [25]. Do danas nije bilo efikasnih terapeutskih agenasa koji bi inhibirali zamućenje sočiva i umanjili starenje LEC bez neželjenih nuspojava. Fokus ove studije bio je da se proceni molekularna biološka osnova za starenje LEC i mehanizam zaštite normalnih LEC od starenja. Naši rezultati su otkrili da je inaktivacija AMPK i oštećenje autofagije povezano sa starenjem LEC-a i ARC-a. Nadalje, otkrili smo da MET može zaštititi LEC od starenja i inhibirati zamućenje sočiva aktiviranjem AMPK i pojačavanjem autofagije.

Starenje je temeljni biološki proces praćen općim padom funkcije tkiva. Kako se životni vijek produžava, disfunkcije povezane sa starenjem, kao što je ARC, postaju ozbiljne zdravstvene

pitanja [26]. Prijavljeno je da je starenje LEC-a uključeno u pojavu i razvoj ARC-a [5]. Naši rezultati su otkrili da su LEC-ovi prirodno ostarjelih miševa bili ravnog oblika i neravnomjerno raspoređeni, a gustina LEC-a je značajno smanjena (sl. 1c, d). Osim toga, ekspresija gena povezanih sa starenjem (p21 i p53) je povećana u LEC-ovima prirodno ostarjelih miševa (sl. 1e, f, g). Naši rezultati su implicirali da je starenje LEC-a povezano s pojavom i razvojem ARC-a. Stoga, može biti potrebno precizno razumijevanje molekularnih mehanizama koji leže u osnovi starenja LEC-a da bi se pružilo obrazloženje za nove strategije liječenja.

MET je najčešće propisivani oralni hipoglikemijski lijek za dijabetes tipa 2 u svijetu. Novi dokazi ukazuju da MET ima blagotvorne efekte na zdravlje osim onih povezanih s poboljšanjem glikemije [27]. Potvrđeno je da su mehanizmi MET važni za ciljanje osnovnih puteva u biološkom starenju, kao što je aktiviranje AMPK, povećanje autofagije, inhibiranje upale i ispoljavanje antioksidativnih efekata [28]. Kod ljudi, MET se koristi u kliničkoj praksi više od 60 godina; ima visok sigurnosni profil i jedinstveno je pozicioniran da interveniše u nekoliko ključnih puteva odgovornih za starenje i bolesti povezane sa starenjem. Međutim, efekti MET-a na ARC i regulatorni mehanizam tih efekata nikada nisu prijavljeni. Posljedično, u našoj studiji, kronična primjena niskih doza MET kod prirodno ostarjelih miševa poboljšala je transparentnost sočiva (slika 2a) i umanjila starenje LEC in vivo (slika 2).

KSL12

Opšte je poznato da MET aktivira AMPK put koji je potencijalni mehanizam MET-a da ispoljava efekat protiv starenja [29]. AMPK, senzor stanične energije, igra ključnu ulogu u regulaciji stanične energetske ravnoteže [30]. Nekoliko studija je ilustrovalo da AMPK služi kao integrator i posrednik nekoliko puteva i procesa koji povezuju energiju sa dugovječnošću. U našoj studiji otkrili smo da je inaktivacija AMPK bila karakteristika starenja LEC-a kod prirodno ostarjelih miševa (Sl.3). Kasnije se pokazalo da MET stimuliše put AMPK kako bi se spriječilo starenje LEC (Slika 3). Kao utvrđeni aktivator AMPK, uloga MET-a u prevenciji starenja općenito se pripisuje njegovim efektima na moduliranje nizvodnih signalnih puteva, kao što je restauracija autofagije, aktivacija Sirt1 i Foxo1 i supresija mTOR [31,32]. Naša studija je pružila novu liniju dokaza koji naglašavaju važnost funkcije AMPK koju aktivira MET u prevenciji pojave ARC-a.

Kao što je gore spomenuto, AMPK komunicira s brojnim putevima i proteinima kako bi izvršio efekat protiv starenja, uključujući povećanje autofagije. Autofagija, koja se pojavljuje kao ključni proces za osiguranje dugovječnosti, privukla je široko interesovanje kao potencijalna terapijska meta za bolesti povezane sa starenjem. Autofagija je fluidan, složen biološki proces u više koraka. Kompletan proces autofagije naziva se autofagijski tok, koji se široko koristi da odražava nivo autofagije. Kao indikator autofagije, LC3-Il je čvrsto vezan za autofagozomalnu membranu koju razgrađuju lizozomalni enzimi.produžetak životnog vijeka cistancheSlično, p62, supstrat specifičan za autofagiju, obično se razgrađuje u autofagolizozomu, a njegova ekspresija indirektno odražava nivo autofagije. U ovoj studiji, naši nalazi su implicirali da je nivo autofagije izrazito opao u senescentnim LEC-ovima (slika 4), dok je MET preokrenuo oštećenje autofagije povezano sa starenjem (slika 4). Molekularni mehanizam MET protiv starenja pripisuje se primarnoj funkciji AMPK u stanicama jer općenito pojačava autofagiju putem AMPK aktivacije [33]. Štaviše, pokazalo se da MET direktno povećava autofagiju, čime doprinosi prevenciji starenja [34]. Međutim, potrebne su detaljnije studije da bi se razjasnili osnovni mehanizmi, dokazujući da MET povećava autofagiju putem nezavisnog ili zavisnog AMPK puta.

Pokazalo se da prevalencija ARC-a nije povezana sa seksom u populacijama azijskog porijekla [35, 36]. Stoga, nismo smatrali seks kao faktor koji može uticati na ARC. Naše istraživanje treba tumačiti uzimajući u obzir gore navedena ograničenja.

ZAKLJUČAK

Ukratko, dokazali smo da inaktivacija AMPK puta i oštećenje autofagije povezano sa starenjem mogu doprinijeti starenju LEC-a i pojavi ARC-a. Osim toga, podaci iz naših eksperimenata otkrili su da MET efektivno odlaže starenje LEC-a i formiranje ARC-a putem aktivacije AMPK puta i povećanja autofagije. Naši nalazi su osnovna linija za dalje istraživanje molekularnih mehanizama koji su korisni u ulozi MET-a tokom procesa starenja ARC-a i biće informativni za intenzivnije studije o razvoju novih strategija protiv pojave i razvoja ARC-a.

MATERIJALI I METODE Reagensi

MET je kupljen od kompanije Bristol-Myers Squibb (Kina). Antitijela protiv p21 (ab188224), p53 (ab131442), fosforiliranog AMKa(p-AMPK)(Thr172)(ab133448), AMPKa1(ab32047), -ab32047 SQSTM1/p62 (3340-1) su nabavljeni od Abcam (MA, USA). Antitijela protiv LC3 (12741) i fosfo-acetil CoA karboksilaze (p-ACC) (Ser79) (3661) su kupljena od Cell Signaling Technology ( MA, SAD).

Životinje i tretman

Mužjaci C57BL6J miševa koji su bili stari 3 i 8 mjeseci kupljeni su od Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (Peking, Kina). Miševi su držani u uslovima kontrolisane temperature (temperatura, 20-25 stepen i relativna vlažnost, 55±15 procenata) sa ciklusom svetlosti/mraka od 12 sati, sa slobodnim pristupom hrani i vodi. Sve procedure i protokoli koji se provode na životinjama odobreni su od strane etičkog komiteta Medicinskog univerziteta u Harbinu.

Miševi su podijeljeni u sljedeće tri grupe: (i) kontrolna grupa sa mladim miševima (stari 3 mjeseca, tjelesne težine=29.72±1,66 g, n =40) koji su primali standardnu prečišćenu ishranu za miševe i vodu ad libitum; Kada su miševi bili stari 10 mjesec, 120 miševa je nasumično podijeljeno u dvije grupe: grupu prirodnog uzrasta i MET grupu. (i) prirodno ostarjela grupa (stariji miševi, stari 20 mjeseci, tjelesne težine=32.98±1,93 g, n=60) primala je standardnu pročišćenu ishranu miševa i vodu ad libitum; (ii)MET grupa ( 20 mjeseci, tjelesne težine=31.21±2.81 g,n=60) održavan je na standardnoj prečišćenoj mišjoj ishrani i vodi sve dok miševi nisu navršili 10 mjeseci starosti; nakon čega su započeli tretmani. Miševi u MET grupi hranjeni su ishranom sa dodatkom 0,1 posto MET (Bristol Myers Squibb, Kina) i slobodno zalijevani tokom 10 mjeseci.

izolacija sočiva i kapsula za sočiva

Miševi su eutanazirani putem cervikalne dislokacije. Čitavo oko je odmah izrezano svim eksperimentalnim životinjama i stavljeno u sterilnu fiziološku otopinu. Očni nerv je postavljen prema gore i fiksiran pincetom. Zatim je napravljen rez na optičkom živcu koji ulazi u oko, a sklera je povučena unazad kako bi se otkrilo sočivo.cistanche nzNakon toga, pincetom smo nježno uklonili fragmente cilijarnog tijela pričvršćene za ekvatorijalnu ravan sočiva. Fotografije svježeg sočiva su odmah snimljene, a sočivo je brzo fiksirano sa 4 posto paraformaldehida na sobnoj temperaturi. Cijele kapsule sočiva su brzo oljuštene od preostalog sočiva, brzo zamrznute u tekućem dušiku i pohranjene na 80 stepeni C za naknadne eksperimente.

Hematoksilin i eozin (H&E)

Svježe sočivo je odmah fiksirano sa 4 posto paraformaldehida na sobnoj temperaturi i stavljeno u parafin. Za histološki pregled, tkiva su izrezana na kriške od 4- μm. Nakon deparafinizacije i rehidracije, pripremljeni parafinski rezovi su obojeni rastvorom hematoksilina (H) u trajanju od 8 minuta, nakon čega je uslijedilo 5 urona u 1 posto kiselog etanola (1 posto HCl u 70 posto etanola)

i ispiranje destilovanom vodom. Nakon toga, preseci su bojeni rastvorom eozina (E) tokom 3 min, nakon čega je usledila dehidracija stepenastim alkoholom i čišćenje ksilenom. Morfološke promjene su uočene pod mikroskopom (Nikon, Eclipse, Japan).

Analiza -galaktozidaze povezane sa starenjem (SA- -Gal) Aktivnost -galaktozidaze povezane sa starenjem (SA{{5}Gal) mjerena je korištenjem kompleta za bojenje SA- -Gal (Sigma, CS{ {12}}030). Prema uputama proizvođača, dijelovi tkiva, nakon serije tretmana, ispirani su fiziološkom otopinom puferovanom fosfatom (PBS) u trajanju od 5 minuta (triput), a zatim inkubirani u SA{10}} gal otopini za bojenje (pH 6,0) na 37 stepeni bez CO2 tokom 24 h. Slike su snimljene pod svetlosnim mikroskopom (Nikon, Eclipse, Japan). Postotak SA- -gal-pozitivnih ćelija procijenjen je kao srednji broj pozitivnih ćelija/srednji broj ukupnih ćelija.

Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu (gRT-PCR) Ukupna RNK iz kapsula sočiva miševa ekstrahirana je pomoću TRlzol reagensa. Reverzna transkripcija je izvedena sa ExScript RT Reagent Kitom (Invitrogen). Kvantitativna analiza lančane reakcije polimeraze reverzne transkripcije (qRT-PCR) izvedena je korištenjem SYBR Green Supermixa

komplet (Takara, Tokio, Japan), sa -aktinom kao endogenom kontrolom. Transkripcije su istražene za nekoliko ciljnih gena, uključujući FAS (naprijed, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'i revers,5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (naprijed,5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{ 10}} i obrnuto,5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') i -actin (naprijed, 5 '-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3'i obrnuto,5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG.{{20}' nivoi ekspresije svakog gena su bili

metoda. normalizirano na -aktin i izračunato korištenjem 2-△△ct r imunohistohemijskog (IHC) bojenja Ukupno 5 reprezentativnih odjeljaka iz svake od 10 odabranih sočiva po grupi korišteno je za imunohistohemijsku (IHC) analizu za procjenu ekspresije p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 i p62. Nakon što su pripremljeni uzorci inkubirani na 60 stepeni u trajanju od 2 h, propušteni su kroz ksilen i ocjenjivani alkoholni niz za deparafinizaciju. Nakon toga, uzorci su kuhani u 0,1 M limunske kiseline (pH 6,1) 30 minuta i ohlađeni na sobnu temperaturu. Nakon tri puta ispiranja sa PBS-om, uzorci su natopljeni sa 0,3 posto H2O, kako bi se inhibirala aktivnost endogene peroksidaze. Nakon toga su dodana primarna antitela i ohlađena na 4 stepena C, preko noći. Odgovarajuća sekundarna antitela su inkubirana 1 h na 37 stepeni C. Nakon ispiranja sa PBS, uzorci su inkubirani u diaminobenzidinu (DAB) dok se ne razvije željeni intenzitet mrlje. Slike imuno obojenih ćelija snimljene su mikroskopom Nikon Eclipse (Nikon, Eclipse, Japan).

Western blot analiza

Ukupni proteini iz kapsula sočiva miševa ekstrahirani su puferom za radio-imunoprecipitacijski test (RIPA) s koktelom inhibitora proteaze (Pierce, SAD), a za kvantifikaciju koncentracije proteina korišten je komplet bicinhoninske kiseline (BCA) (Thermo Fisher Scientific, SAD). . Ukupni protein (40 ug) je analiziran pomoću natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforeze (SDS-PAGE) i elektroforetski prebačen na membrane poliviniliden difluoridnog filtera (PVDF) (Millipore, Njemačka). Membrane su inkubirane preko noći sa primarnim antitelom na 4 stepena C. Sledećeg dana, membrane su inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelima 1 sat na 37 stepeni C. Imunoreaktivne trake su vizualizovane korišćenjem metode hemiluminiscentnog supstrata sa Super Signal West Pico komplet (Pierce Biotechnology, SAD). Izvedena su tri nezavisna eksperimenta.

Statistička analiza

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost±standardna devijacija (SD). Statističke analize su rađene korišćenjem softvera GraphPad Prism 7.0 i Microsoft Excel-a. Protein je kvantifikovan korišćenjem softvera Image J. Studentov t-test i analiza varijanse (ANOVA) korišteni su za izračunavanje statističke značajnosti eksperimentalnih podataka. Razlike sa P-vrijednošću<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">