Optogenetsko frekventno kodiranje hipokampalnih teta oscilacija disocira radnu memoriju izvlačenje iz hipokampalnih prostorno-vremenskih kodova 3. dio

Optogenetski pejsing MS neurona dovodi do nefiziološke teta sinhronije

Iznenađujuće, optogenetske stimulacije od 8 Hz koje su povezane sa pejsingom theta oscilacija dovele su do smanjenih performansi kada se primenjuju tokom kodiranja ili preuzimanja epizodne memorije u zadatku NPOR, kao i pronalaženja prostorne radne memorije u DNMTStasku. Da bismo dalje razumjeli efekte pejsinga theta na hipokampalfiziologiju, analizirali smo fazno zaključavanje theta oscilacije prije i za vrijeme optogenetskih stimulacija od 8 Hz (dopunska slika 7a) i otkrili da je takva stimulacija dovela do povećane sinhronizacije faza kroz epohe stimulacije (dopunska slika 7b). Nadalje, analizirali smo unakrsnu korelaciju theta oscilacija preko dorzalnog CA1 (~1 mm udaljenost između elektroda duž septotemporalne ose (dopunska slika 7c) i otkrili da teta ritmovi pejsinga na 8 Hz dovode do povećane unakrsne korelacije između te dvije elektrode ( Dodatna slika 7d).

Genetika je nauka koja proučava genetsko nasleđe i varijacije, a pamćenje je aspekt koji izaziva veliku zabrinutost. Dakle, kakve veze genetika ima sa pamćenjem? Ovaj članak će istražiti pitanja vezana za pamćenje iz genetske perspektive.

Prije svega, znamo da su genetski geni osnova ljudskog fizičkog i intelektualnog razvoja, a da li su ti geni superiorniji utječe na pamćenje ljudi. Najnovija istraživanja pokazuju da na IQ i pamćenje ljudi utiču genetski faktori. Istraživanja pokazuju da genetski geni igraju ključnu ulogu u inteligenciji i pamćenju. Stoga se neki ljudi rađaju sa snažnijim pamćenjem, dok drugi moraju naporno raditi i trenirati kako bi poboljšali svoje pamćenje.

Drugo, faktori okoline su takođe važni faktori u razvoju pamćenja. Ne samo da nam je potrebna podrška genetskih gena, već i da poboljšamo svoje pamćenje kroz naučnu obuku i dobre životne navike. Na primjer, možemo inzistirati na svakodnevnom vježbanju, dovoljnom spavanju, pridržavanju principa usklađivanja obroka itd., što može pomoći u poboljšanju funkcije našeg mozga i pamćenja.

Konačno, obični ljudi ne prenaglašavaju utjecaj genetskih faktora na razvoj pamćenja. Budući da genetski faktori nisu apsolutni, pamćenje i inteligencija ljudi se i dalje mogu poboljšati poboljšanjem svojih napora i treninga. Uvijek trebamo održavati pozitivan i kontinuiran stav učenja, te stalno istraživati ​​i razvijati svoj potencijal pamćenja. Vjerujem da samo tako možemo postati pametniji i imati veći osjećaj postignuća. Ukratko, veza između genetike i pamćenja je vrlo bliska, ali ne treba prenaglašavati genetske faktore, već treba stalno poboljšavati svoje pamćenje i inteligenciju kroz samousavršavanje i trening.

Vidi se da moramo poboljšati svoje pamćenje. Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje jer je cistanche deserticola tradicionalni kineski ljekoviti materijal s mnogim jedinstvenim efektima, od kojih je jedno poboljšanje pamćenja. Djelotvornost mljevenog mesa proizlazi iz različitih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući kiselinu, polisaharide, flavonoide, itd. Ovi sastojci mogu promovirati zdravlje mozga na različite načine.

Kliknite na saznajte 10 načina za poboljšanje memorije

Diskusija

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 neurona dok izvodi optogenetsku stimulaciju MS neurona sa pod-sekundarnom rezolucijom za kontrolu theta ritmova i procjenu njihove uloge u fiziologiji hipokampusa i pamćenju. Važno je da smo uz pomoć ekscitatornog opsina i kodiranih ili 8 Hz stimulacija bili u mogućnosti dosljedno i snažno ukinuti ili ubrzati hipokampalni teta, respektivno.

U poređenju sa inhibicijom MS upotrebom bilo inhibitornog opsina ili farmakoloških jedinjenja (npr. muscimol), naš pristup omogućava poređenje dva suprotstavljena stanja unutar subjekta (pejsing naspram ukinutogtheta) uz održavanje nivoa aktivnosti u MS-PV ćelijama. Kombinirali smo zadatak linearnog praćenja koji nam je, zajedno s informacijsko-teoretskim pristupima, omogućio da razdvojimo prostorne i vremenske hipokampalne kodove. Ova metoda ublažava potrebu za proizvoljnim pragovima, omogućavajući standardizirani pristup analizi kalcija. Dok je veliki dio CA1 piramidalnih neurona izražavao mješavinu prostorno-vremenskih kodova, fokusirali smo naše analize na neurone omamljene posebno na mjesto, vrijeme ili pređenu udaljenost.

Dok je prostorno kodiranje opsežno istraženo u CA1, vremenski kodovi i kodovi udaljenosti su nedavno dobili više interesa. Temporalni28,35–37 i kodovi udaljenosti37 su ekstrahovani stezanjem vizualnoprostornih znakova ili izvučeni analitički koristeći generalizirane linearne modele u paradigmama virtualne stvarnosti26,27,38. Ovdje predlažemo pristup za razdvajanje prostornih, vremenskih i daljinskih kodova korištenjem teoretskog pristupa informacija koji, zajedno sa našim zadatkom alternacije, omogućava analizu prostorno-tempora i multipleksiranih kodova u stvarnom svijetu u životinja koje se slobodno kreću. Velika količina CA1 piramidalnih neurona kodira multipleksirane informacije o lokaciji, udaljenosti i vremenu kao što je ranije objavljeno26,27,38 uz signale samopokretanja kao što su ubrzanje, brzina i orijentacija60.

Otkrili smo da frekventno skrembliranje i optogenetske stimulacije od 8 Hz drastično ukidaju ili ubrzavaju theta ritmove, respektivno, i dovode do smanjene ukupne aktivnosti u subpopulaciji piramidalnih ćelija CA1, a da pritom ne uzrokuju značajne promjene u aktivnosti stanica na mjestu, slično prethodnim izvještajima koji su koristili bilo farmakološku inhibiciju36, 46,47 ili optogenetski9,48 pejsing MS ili septalnih ulaza u hipokampus. Kako je poznato da su MS neuroni primarni pokretači hipokampalnih oscilacija, očekivali smo da će MS stimulacija biti povezana sa poremećenom aktivnošću ćelije u vremenu ili udaljenosti u uslovima smanjenog theta ritma, ali nije došlo do promjena kada je theta ukinut ili pejsing. Osim toga, pejsing hipokampalnih oscilacija na 8 Hz nije doveo do promjena u kvaliteti prostornih kodova kao što je ranije prijavljeno9 i nije promijenilo vremenske kodove kao što je uočeno u našoj paradigmi ponašanja.

Iako je objavljeno da vremenske (ali ne i mesto) ćelije mogu direktno zavisiti od inputa medijalnog entorhinalnog korteksa (MEC)61, nedavni eksperimentalni dokazi sugerišu da lezije MEC ne dovode ni do kakvih promena u fiziologiji hipokampalnih vremenskih ćelija62. Značajno, novije istraživanje je pokazalo da optogenetski pejsing MS nije poremetio prostorne kodove ćelija mreže u entorhinalkorteksu63, što dalje sugerira da MS aktivnost nije direktno uključena u prostorne kodove unutar hipokampalne formacije. Zajedno sa našim rezultatima, ovo ukazuje da bi temporalni kodovi mogli biti ili rezultat računanja zavisnih od MS unutar entorhinalkorteksa63 (1) ili biti generirani intrinzično unutar samog hipokampusa (2).

Dok su rane studije otkrile da je MS igrao ključnu ulogu u održavanju vremenskih ćelija i podržavanju radne memorije36, nedavni eksperimentalni dokazi pokazuju da bi tačan doprinos vremenskih ćelija performansama radne memorije mogao biti manji nego što se ranije mislilo62. S obzirom da MS-PV neuroni vjerovatno održavaju značajne nivoe aktivnosti tokom optogenetske stimulacije sa skramingom frekvencije (za razliku od inhibicijskih pristupa), naši rezultati snažno podržavaju ulogu precizno tempirane septalne aktivnosti u podržavanju radne memorije, što se ranije pretpostavljalo kao hipoteza. Iako smo uočili smanjene performanse pamćenja kada smo koristili optogenetsku stimulaciju tokom preuzimanja, stimulacija tokom faze kodiranja DNMTS zadataka nije bila povezana sa smanjenom memorijom u DNMTS zadatku. Pejsing tetaoscilacija na 8 Hz tokom faze kodiranja ili preuzimanja zadatka NOPR doveo je do narušenog preuzimanja memorije. Naše elektrofiziološke analize dalje otkrivaju da je takva stimulacija uzrokovala da se udaljeni regioni dorzalnog CA1 zahvate u istoj fazi, sa nefiziološkim zaključavanjem faze. Iako nismo direktno istražili uzročnu vezu između promjena faze i performansi memorije, utvrđeno je da su spiketiming i fazna precesija povezani s promijenjenom funkcijom radne memorije uprkos tome što smo kodiranje ostavili netaknutim64. Štaviše, ranije se pokazalo da je fazno zaključavanje piramidalnih neurona na tetaoscilacije prediktor performansi memorije65.

Primjetno, jedno ograničenje našeg pristupa uspostavljanju svojstava tempora i podešavanja udaljenosti je to što zahtijeva četiri puta više uzorkovanja nego obična linearna staza što povećava šanse za fotoizbjeljivanje kada se dodaju uvjeti stimulacije na eksperimentalnu vremensku liniju. Dok smo otkrili da optogenetske stimulacije u istoj sesiji ne utječu na prostorne kodove, noviji hardver za snimanje koji uključuje senzore povećane osjetljivosti mogao bi spriječiti fotoizbjeljivanje i omogućiti duže sesije snimanja, na taj način uzorkovanje vremenskih i udaljenih ćelija zajedno sa stimulacijama. Također smo otkrili da je skup neurona koji značajno i specifično kodiraju samo jednu varijablu mali u usporedbi s brojem konjuktivnih neurona, zbog čega su zahtjevi za uzorkovanjem za ove visoko specifične neurone mnogo veći.

Pružamo eksperimentalne dokaze da manipulacija MS-om ne mijenja brzinu lokomotora i da, obrnuto, brzina lokomotora diktira theta frekvenciju. Iako su kodovi mjesta i vremena sačuvani tokom naših MS stimulacija, dio (~6%) ćelija je direktno moduliran i mogao bi objasniti oštećenje pamćenja uočeno u našim testovima ponašanja. Ranije je prijavljeno da su PV interneuroni u hipokampusu dio mikrokruga koji je ključan u regulaciji konsolidacije memorije66,67, a naše optogenetske manipulacije mogle bi biti povezane sa utišavanjem dijela ovih ćelija. Štoviše, iako nismo primijetili promjene u frekventnim opsezima osim theta, ne možemo isključiti da bi se vrijeme šiljaka piramidalnog neurona CA1 moglo drastično promijeniti kada se skrembuju teta oscilacije, dok se pokazalo da stimulacija od 8 Hz ne rezultira povećanom aktivnošću hipokampusa18, što bi moglo objasniti diferencijalne efekte ti obrasci stimulacije na performanse radne memorije. Poremećaji pamćenja koje smo primijetili vjerovatno nisu bili holinergični: prvo, u našim imunohistološkim eksperimentima, nismo našli praktički nikakvu ekspresiju ChrimsonR u ChAT neuronima MS. Drugo, naše optogenetske stimulacije nisu bile povezane s promjenama talasanja hipokampusa, dok prethodni izvještaji ukazuju da stimulacija ChAT neuroni su povezani sa smanjenom frekvencijom talasanja45,57. ChrimsonR transfekcija neurona MS VGLUT2 je također malo vjerojatna jer je aktivacija ovih neurona povezana s direktnim povećanjem lokomotorne aktivnosti 68, što nismo primijetili.

Iako bi precizan vremenski raspored piramidalnih šiljaka CA1 mogao objasniti, barem djelomično, efekte MS stimulacije na pamćenje, treba uzeti u obzir alternativne mehanizme. Posebno, pored hipokampusa i entorhinalnog korteksa, MS PVneuroni projektuju i retrosplenijalni korteks3 i mogli bi biti odgovorni za neka od oštećenja pamćenja koja su ovdje uočena.

Ukratko, koristeći imidžing kalcija, optogenetiku i elektrofiziologiju, otkrili smo da se theta ritmovi mogu stimulirati ili ukinuti korištenjem stimulacije MS. Takva stimulacija je poremetila periodično kao i obnavljanje radne memorije. Ovi efekti nisu bili holinergični i nisu poremetili aktivnost talasanja hipokampusa. Konačno, dok je mali dio hipokampalnih neurona odgovorio direktno na optogenetsku stimulaciju MS-a, ćelije mjesta, vremena i udaljenosti nisu bile poremećene manipulacijama teta oscilacijama. Ovi rezultati zajedno sugeriraju da, iako MS ulaz u hipokampus igra bitnu ulogu u pamćenju, multipleksirani kodovi u CA1 piramidalnim neuronima možda nisu direktan supstrat za takve funkcije.

Metode

Životinje

Sve procedure su odobrene od strane Komiteta za brigu o životinjama Univerziteta McGill i Kanadskog vijeća za njegu životinja (protokol 2015-7650). Ukupno n=41 mužjaka (n=20) i ženki (n=21) starih 8–16 sedmica,B6;129P2 PV-Cre miševa (Jackson Laboratorij, RRID: IMSR{{ 10}}JAX:017320) su korišteni u ovoj studiji. n=5 miševa je korišteno za kombinovanje optogenetike sa snimanjem kalcijuma; n=3 miševa je implantirano za snimanje kalcijuma, optogenetiku i elektrofiziološku kontrolu; n=4 miševi su korišteni u elektrofiziološkim studijama; n=29 miševa je transficirano i implantirano za testove ponašanja. Miševi su smješteni pojedinačno u ciklusu 12-h svjetlo/mrak na 22 stepena i 40% vlažnosti sa hranom i vodom po volji. Svi eksperimenti su izvedeni tokom svjetlosnog dijela ciklusa svjetlo/mrak.

Adeno-povezani virusni vektori

Adeno-asociran virus AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene# 100834, dobijen od University of Pennsylvania Vector Core) korišten je u svim eksperimentima s kalcijumom. Adeno-asociran virus (AAV) serotipa dj (hibridni kapsid kreiran od osam različitih AAV serotipova) AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomato dobijen je iz Vector Core Facility na Univerzitetu zdravlja i nauke Oregon u Portlandu, Oregon. Iako je on gen za održavanje kućanstva, nismo uočili transfekciju u holinergičkim ćelijama (vidi "Rezultate" i Sliku 2b–e). Kao kontrola korišćena je eYFP konstrukcija bez ChrimsonR sekvence (nazvana YFP kontrola u ovom rukopisu).

Hirurške procedure

Miševi su anestezirani izofluranom (5% indukcija, 0.5-1% održavanje) i stavljeni u stereotaksički okvir (David Kopf Instruments). Tjelesna temperatura je održavana podlogom za grijanje, oči su hidratizirane gelom (Optixcare) , a karprofen (10 ml/kg) je davan supkutano. Lubanja je u potpunosti očišćena od vezivnog tkiva i urađene su male kraniotomije pomoću dentalne bušilice za naknadnu injekciju ili implantaciju.

Virusne injekcije. Sve virusne injekcije su izvedene pomoću staklene pipete spojene na Nanoject III (Drummond) injektor. 500 nl AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato (ili eYFP kontrole) je isporučeno u MS brzinom od 1 nL/s, na sljedećim koordinatama na osnovu referentnog stereotaksijskog atlasa miša69 (udaljenost od Bregme u mm): anteroposteriorno (AP) 0,85, mediolateralno (ML) 0, dorsoventralno (DV) −4,50 koristeći ugao od 5 stepeni u ravni ML. Nakon operacije životinje su praćene do oporavka.

Implantat sa optičkim vlaknima. Dvije sedmice nakon injekcije, miševi su anestezirani za implantaciju nakon iste hirurške procedure. Na istim koordinatama ugrađena je optička vlakna promjera 200 μm s keramičkim ferulom (Thorlabs). Implantati su cementirani na mjestu korištenjem C&B-Metabond® (Patterson dental). Crni lak za nokte nanesen je preko zubnog cementa kako bi se blokirala emisija svjetlosti tokom optogenetske stimulacije.

Elektrodni implantati. Niz od 7 volframovih mikroelektroda (~1 MΩimpedansa) spušten je u dorzalni CA1 koji se proteže kroz stratumpyramidale (pyr), stratum radiatum (rad) i stratum lacunosummoleculare (lm). Vijci postavljeni u kost iznad frontalnog korteksa i malog mozga služili su kao tlo i referenca, respektivno. Nakon postavljanja elektroda, uzemljenja i referentnog položaja, primijenjen je zubni cement kako bi se implantat trajno učvrstio na lubanji.

Implantat za snimanje kalcijuma. Ubrizgali smo AAV5.CamKII.GCaMP6fvirus (200 nL pri 1 nl s−1) u hipokampalni CA1 koristeći sljedeće koordinate: anteroposteriorno (AP) − 1.86 mm od bregme, mediolateralno(ML) 1,5 mm, dorsoventralno (DV) 1,5 mm. Dvije sedmice nakon injekcije, miševi su anestezirani izofluranom, a lobanja je očišćena. A<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

Simultano snimanje kalcijuma i elektrofiziološka snimanja. Da bismo kontrolisali efekte GRIN implantata na hipokampalne teta, kao i unakrsne razgovore između mini-skopa i optogenetskih ekscitacionih svjetala, priključili smo volframove mikroelektrode na GRIN sočiva. U tu svrhu postavili smo GRIN sočiva vodoravno pod mikroskopom malog povećanja u okruženju bez prašine. Mikroelektroda od volframa je lagano postavljena na gornju ivicu GRIN sočiva pomoću mikromanipulatora. Koristili smo poznati prečnik GRIN sočiva kao referentnu jedinicu da procenimo željeno izbočenje elektrode (~50 µm, dalje digitalno procenjeno nakon mikrofotografije preparata) prema našim planiranim koordinatama implantacije. Male količine (~50 µL) superljepka nanesene su na gornju ivicu GRIN sočiva sa elektrodom na mjestu i ostavljene da se suši oko 10 min, prije nanošenja sljedećeg sloja ljepila. Pet tankih slojeva je korišteno za održavanje elektrode pričvršćene na GRIN sočivo. Nakon implantacije ovih sklopova GRIN elektroda korištenjem gore opisanog protokola, izbočene žice su nježno savijene i skrivene ispod zaštitnog poklopca (1-1,5 cm visine) izvučene iz kruške ručne pipete za usisavanje kao zamjena za Kwik-Sil.

In vivo postupci ponašanja

Habituacija. Miševi su nježno držani oko 5 minuta tijekom jedne sedmice, s progresivnim navikavanjem na proceduru začepljenja (optička vlakna, miniskop i elektrofiziološki pre-amplificirani kablovi). Životinje su zatim zakazane za vodu (pristup 2 sata dnevno).

Snimci miniskopa. Miniskopi (V3) su sastavljeni korišćenjem uputstava otvorenog koda (miniscope.org). Podaci o slikama su dobijeni pomoću CMOS senzora slike (Aptina, MT9V032) i multipleksirani preko laganog koaksijalnog kabla. Podaci su prikupljeni pomoću kutije za prikupljanje podataka (DAQ) spojenog preko USB host kontrolera (Cypress, CYUSB3013). Ponašanje životinja je zabilježeno korištenjem web kamere za potrošače (Logitech) postavljene iznad okoline. Podaci o kalcijumu i ponašanju snimljeni su korištenjem miniscope.org, izvornog softvera za prilagodbu DAQ-a. DAQ je istovremeno prikupljao bihevioralne i celularne tokove slika na 30 Hz kao nekompresovane.avi datoteke od 1000 kadrova za 15-minutne sesije snimanja, zajedno sa odgovarajućim vremenskim oznakama kako bi se omogućilo precizno vremensko usklađivanje podataka o ponašanju i slikanju kalcijuma.

In vivo elektrofiziološki snimci. Nakon 1 sedmice posthirurškog oporavka i jedne sedmice navikavanja na privezivanje, zabilježen je LFP od implantiranih miševa. Svi snimljeni signali sa implantiranih elektroda su pojačani tether predpojačivačem prije nego što su digitalizirani na 22 kHz korištenjem digitalnog sistema za snimanje (Neuralynx, SAD). Snimci svakog signala kanala su sačuvani zajedno sa video snimcima i TTL signalima sa laserske diode za naknadnu analizu.

Optogenetska stimulacija. Laserska stimulacija je isporučena preko optičkog kabla (200 μm prečnika) korišćenjem izvora svetlosti od laserskih diodnih vlakana (Doric Lenses). Intenzitet svetlosti je kalibrisan i talasna dužina korigovana korišćenjem Power Meter Bundle-a sa PM100D konzolom i S130C Slim Photodiode Sensorlight (Thorlabs). Svaka stimulacija pejsinga (uključujući 8 Hz) izvedena je pomoću kvadratnih impulsa od 5 ms. Za primjenu kodirane svjetlosne stimulacije, koristili smo Arduino mikrokontroler da generišemo oscilacijski signal bijelog šuma koji se direktno dovodi u analogni ulaz drajvera laserske diode. Za izvođenje nasumično odabrane frekvencijske stimulacije koristili smo standardni 5 s ON, 5 s OFF protokol, ali za svaku epohu stimulacije koristili smo Arduino mikrokontroler da nasumično biramo frekvenciju stimulacije u theta opsegu. Prilikom primjene optogenetske stimulacije tokom ponašanja, labavi komad termoskupljajuće cijevi postavljen je oko spoja između spojnog kabela i implantata mišjeg prstena kako bi se ograničila emisija vidljive svjetlosti. Intenzitet svjetlosti se izražava kao nominalna snaga, mjerena na vrhu sklopa implantata od optičkog vlakna – kabl (prije hirurškog postavljanja), i korigovana za odgovarajuću talasnu dužinu.

Testovi ponašanja

Linearna staza sekvencijalnog tona. Miševi su bili po rasporedu vode i mogli su pristupiti vodi samo 2 sata dnevno od 18 do 20 sati. Da bismo razdvojili prostorne, vremenske i šifre udaljenosti, gradimo linearnu stazu dugu 134 cm koristeći srednje sive Lego® kocke, što omogućava lake modifikacije i implementacije bez potrebno je trajno modificirati strukturu lavirinta. Piroelektrični senzori bili su postavljeni na svakom kraju linearne staze i bili su povezani na Arduino mikrokontroler. Svaka detekcija je aktivirala novi ton u nizu, ukazujući na napredak u isporuci. Korišteni su i isporučeni sljedeći tonovi pomoću apiezo zvučnika: bipovi od 1 s na 2000 Hz, bipovi od 250 ms na 3000 Hz i kontinuirani ton na 4000 Hz. Kada se aktivirao posljednji, kontinuirani ton, nagrada (10% saharoze u vodi) isporučena je na početnom kraju linearne staze u poklopcu Falcon epruvete od 15 mL. Promjene u smjeru trčanja prije aktiviranja sljedećeg tona smatrale su se greškama i nisu pokrenule isporuku nagrade. Učinak je mjeren kao broj tačnih pokušaja (bez greške) podijeljen sa brojem ukupnih pokušaja.

Prepoznavanje mjesta novog objekta. Prvog dana, miševima je bilo dopušteno da slobodno istražuju tamno sivo otvoreno polje veličine 45 × 45 cm koje je sadržavalo vizualne elemente (velike bijele horizontalne i vertikalne rešetke) na svojim zidovima 10 minuta. Drugog dana, dva identična predmeta (podloga za ruku) su predstavljena 10 min. Trećeg dana, miševima je dozvoljeno da istražuju isto otvoreno polje dok je lokacija jednog od dva objekta bila pomjerena. Da bi se kontrolisale potencijalne pristrasnosti prostornih preferencija, i početna, kao i pomerena pozicija objekata, bili su randomizirani. Miševi su pripisali nasumični redoslijed testiranja koji je ostao identičan tokom tri dana testiranja. Ponašanje je snimljeno video kamerom (Logitech) i analizirano van mreže. Analiza ponašanja urađena je slijepo za genotip i tretman. Istraživanja objekata su definirana kao epohe u kojima miševi imaju nos unutar 1 cm od objekta. RI je izračunat na sljedeći način:

Automatsko odgođeno nepodudaranje s uzorkom zadatka. Miševi su bili zakazani za vodu i obučeni u kontinuiranom T-labirintu za odgođeni zadatak uzorka koji nije podudaran. Ukratko, svako ispitivanje je podijeljeno u dvije faze: uzorak i test. U fazi uzorka, jedna ruka je bila blokirana, a miševi su bili prisiljeni da istražuju suprotnu ruku, gdje su dobili nagradu od 50 µL 10% vode saharoze. Nakon završetka faze uzorkovanja, miševi su bili podvrgnuti kašnjenju (10 s) u početnom odjeljenju. Zatim, tokom faze testiranja, obje ruke su mogle biti istraživane, ali samo suprotna (neistražena) ruka je bila mamac tako da su miševi morali mijenjati lokacije između faze uzorka i faze testiranja. Miševi su podvrgnuti 10 pokušaja (uzorak + test) dnevno, tokom 10 uzastopnih dana, a dnevna stopa uspješnosti je izračunata kao broj tačnih pokušaja podijeljen ukupnim brojem pokušaja.

Postmortem histološke analize

Nakon završetka testiranja ponašanja, miševi su duboko anestezirani mješavinom ketamina/ksilazina/acepromazina (100, 16, 3 mg/kg, respektivno, intraperitonealna injekcija) i perfuzirani transkardijalno sa 4% paraformaldehida (PFA) u PBS. Mozgovi su ekstrahovani i naknadno fiksirani preko noći u PFA na 4 stepena i nakon toga isprani u PBS dodatnih 24 h na 4 stepena. Mozak i sekcije su krioprotecirani u otopini 30% etilen glikola, 30% glicerola i 40% PBS do upotrebe. Svaki mozak je zatim isječen na 50 µm pomoću vibratoma: svaka sekcija je sekvencijalno sakupljena u 4 različite epruvete od 1,5 mL kako bi se omogućila različita analiza (lokacija elektrode, imunohistohemija).

Imunohistology. Koristeći jednu epruvetu sakupljenih dijelova mozga (25% uzorkovanja) za svaku analizu, sekcije su ispirane 3 × 5 minuta u PBS-u da bi se uklonio krioprotektivni rastvor. Sekcije su inkubirane preko noći sa PGT (0.45% želatina i 0.25% tritona u PBS) na 4 stepena. Zatim su kriške inkubirane sa primarnim antitelima: ili 1:200 kozji anti-holin-acetil -transferaza iz Milliporea ili 1:500 mišji anti-PVmonoklonalni IgG1 iz Sigma-Aldrich u PGT na sobnoj temperaturi 48 h odnosno 2 h. Nakon ispiranja od 10, 20 i 30 minuta, sekcije su zatim inkubirane sa sekundarnim antitelima [1:2000 magareća antikoza u kombinaciji sa Alexa 488 ili 1:500 kozjim anti-mišjim IgG1 spojenim sa Alexa 488 (Life Technologies za)] u PGT 45 min. Nakon pranja od 10, 20 i 30 minuta u PBS-u, sekcije su zatim postavljene na stakalce i trajno pokrivene Fluoromount medijumom za montažu koji je sadržavao DAPI. U ovu studiju uključeni su samo miševi sa histološki potvrđenim ugradnjom implantata. Za GRIN sočiva, površina sočiva je morala biti<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

Analiza podataka

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 cm s−1 na linearnoj stazi).

Automatsko praćenje ponašanja. Da bismo izdvojili informacije o položaju, brzini i smjeru glave miševa, koristili smo DeepLabCut70,71. Ukratko, obučili smo model da detektuje mišje uši, nos, tijelo i bazu repa. Smjer glave je procijenjen korištenjem ugla između svakog uha ili nosa i tijela, ovisno o dostupnosti mjerenja. Podaci o lokaciji su interpolirani na učestalost uzorkovanja kalcijumom pomoću linearne interpolacije. Brzina je ekstrahirana izračunavanjem Δd/Δt gdje je d udaljenost i t vrijeme, a rezultat je naknadno izglađen primjenom Gaussovog filtera sa sigma=33 ms za uklanjanje artefakata detekcije. Signali brzine su korišteni za identifikaciju perioda lokomotorne aktivnosti i izračunavanje mjesta, vremena i modulacije udaljenosti aktivnosti posebno za te periode.

Analiza kalcijuma. Analiza podataka sa slikanja kalcijuma izvršena je korišćenjem MATLAB-a 2020a i Python-a 3.8.4. Video snimci su analizirani pomoću Miniscope Analysis pipeline-a (https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnalysis). Ukratko, kruta (rotacija i translacija) korekcija pokreta je primijenjena pomoću NoRMCorre72, a video zapisi su prostorno smanjeni (3×) prije spajanja. Tragovi kalcijuma su ekstrahovani korišćenjem CNMFe51 koristeći sledeće parametre: gSig=3 piksela (širina Gausovog jezgra), gSiz=20 piksela (približni prečnik neurona), pozadina_model='prsten', prostorni_algoritam='hals', min_korekcija=0.8 (minimalni prag korelacije piksela), min_PNR {{17 }} (minimalni prag omjera pik-šum).

Sirovi tragovi kalcijuma su filtrirani kako bi se uklonile fluktuacije visoke frekvencije i binarizirani: Ukratko, neuroni su se smatrali aktivnim kada je normalizirana amplituda kalcijevog signala premašila dvije standardne devijacije, a derivat prvog reda bio je iznad 0 (vidi ref. 52 za ​​dodatne detalje o metodologiji52). Da bi se izdvojili neuroni koji se prilagođavaju specifičnim varijablama, lokacija, vrijeme i udaljenost su binovani (lokacija: binovi od 3 cm; vrijeme: binovi od 1 s; udaljenost: binovi od 3 cm). Iz binariziranih signala, izračunali smo marginalnu vjerovatnoću da ćelije budu aktivne P Að Þ koje koristimo kao zamjenu za neuronsku aktivnost. Što je još važnije, onda izvodimo vjerovatnoću aktivnosti ili 'vjerovatnost da budemo aktivni s obzirom na stanje promjenjive' PA j Si koristeći binirane varijable:

gdje je M ukupan broj mogućih stanja ponašanja, a P(Si∩Aj) zajednička vjerovatnoća da se životinja nalazi u košu I istovremeno sa nivoom aktivnosti j (0 ili 1). Da bismo procijenili značaj dobijene MIvrijednosti, onda smo generirali 1000 promiješanih surogata koristeći nasumične kružne permutacije. Odabrali smo kružne permutacije jer uklanjaju vremensku vezu između neuronske aktivnosti i ponašanja, dok i dalje čuvaju vremensku strukturu kalcijevih tranzijenta i na taj način dovode do konzervativnijih rezultata (za razliku od potpune randomizacije svake tačke podataka, što naduvava vrijednost značajnosti rezultata). Budući da pomiješani surogati nisu bili sistematski normalno raspoređeni, koristili smo neparametarski pristup gdje p-vrijednost (pN) odgovara broju tačaka podataka iz pomiješane distribucije koji je veći od stvarnih podataka za svaki koš, podijeljen s brojem permutacija52, 73.

Da bismo odredili modulaciju stanica optogenetskim stimulacijama, koristili smo sličan pristup, ali smo izračunali MI između neuronske aktivnosti i binariziranih signala stimulacije (na taj način tretirano kao bihevioralno stanje). Ista procedura kružnog miješanja korištena je za izdvajanje statističke značajnosti.

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 cm s−1, skup podataka za obuku je generisan korišćenjem 90% podataka. Preostalih 10% podataka korišteno je za testiranje. Greška dekodiranja izračunata je korištenjem 50 pokretanih surogata i skupa od 160 ćelija korištenjem nasumično odabranih tačaka podataka sa zamjenom. Pretpostavlja se da je svaki neuron nezavisan jedan od drugog, što u praksi nije slučaj i dovodi do većih grešaka u rekonstrukciji, ali smanjuje vrijeme računanja. Posteriorna vjerovatnoća populacije izvedena je iz sljedeće jednačine:

Praćenje ćelija tokom više dana. Neuroni su praćeni tokom više dana korišćenjem CellReg74: https://github.com/zivlab/CellReg (v1.5.3). Ukratko, prostorni otisci su poravnati pomoću krutog poravnanja radi ispravljanja rotacija i translacija. Nakon poravnanja, smatrali smo da su kandidatski skupovi ćelija isti neuron ako je njihova maksimalna udaljenost<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

Elektrofiziološka analiza. Elektrofiziološka analiza podataka obavljena je korištenjem MATLAB-a 2020a korištenjem obrade signala i wavelet alata. Talasić konvolucija je primijenjena na LFP signale koristeći kompleksne Morletove talase ('cmor1–1.5' u MATLAB-u) kada je bila potrebna preciznost u vremenskom i frekvencijskom domenu. Pokretni prozor Furijeova konvolucija (2 s prozor u theta opsegu, 5 s prozor u gama opsegu, 10 ms pokretni koraci) korišćena je kada je tačnost frekvencijskog domena bila privilegovana u odnosu na tačnost vremenskog domena (npr. toplot dominantna frekvencija pri pejsingu pomoću optogenetike). Analiza spektralne gustine snage je izvršena kada su miševi trčali na 5 cm s-1 ili više, osim ako nije drugačije opisano.

Snaga oscilacije. OS je izračunat kao omjer spektralne gustine kumulativne snage oko vršne frekvencije oscilacije ±1 Hz i kumulativne snage opsega u theta (4-12 Hz) opsegu. Ova metrika postaje 1 kada sva spektralna gustina snage padne u vršnu frekvenciju oscilovanja (npr. 8 Hz ako se stimuliše na toj frekvenciji).

Detekcija i analiza SWR-a. Za praćenje SWR-a, miševima je bilo dozvoljeno da slobodno istražuju otvoreno polje 10 min tokom snimanja. Stimulacije (šifrovane ili 8 Hz) su izvedene sa paradigmom od 5 s ON, 5 s OFF. Za analizu su uzeti u obzir samo periodi tihog mirovanja. U tu svrhu, izračunali smo z-skod omjer theta/delta snage nakon filtriranja za svaki frekvencijski opseg, izvodeći Hilbertovu transformaciju i uzeli u obzir samo periode u kojima je rezultirajuća vrijednost bila ispod 0. Da bismo otkrili SWR-ove, filtrirali smo LFP signale u 150–250 Hz frekvencijski pojas i naknadno z-score. Talasanje je detektirano korištenjem funkcije findpeaks u MATLAB-u, sa sljedećim parametrima: prag=4 sd, minpeakwidth=0 s, minpeakdistance=0.03 s.

Reference

1. Colgin, LL Ritmovi hipokampalne mreže. Nat. Rev. Neurosci. 17, 239–249 (2016).

2. Tóth, K., Freund, TF & Miles, R. Dezinhibicija hipokampalpiramidnih ćelija pacova pomoću GABAergičnih aferenata iz septuma. J. Physiol.500, 463–474 (1997).

3. Unal, G., Joshi, A., Viney, TJ, Kis, V. & Somogyi, P. Sinaptičke mete medijalne septalne projekcije u hipokampusu i ekstrahipokampalnim korteksima miša. J. Neurosci. 35,15812–15826 (2015).

4. Simon, AP, Poindessous-Jazat, F., Dutar, P., Epelbaum, J. & Bassant, M.-H. Svojstva aktiviranja anatomski identificiranih neurona u medijalnom septumu anesteziranih i neanesteziranih sputanih pacova. J. Neurosci. 26, 9038–9046 (2006).

5. Scotty, F. et al. Izrazita elektrofiziološka svojstva glutamatergičnih, holinergičkih i GABAergičnih neurona septohipokampusa pacova: nove implikacije na ritmičnost hipokampusa. J. Physiol. 551,927–943 (2003).

6. Manseau, F., Danik, M. & Williams, S. Funkcionalna glutamatergična neuronska mreža u području medijalnog septuma i dijagonalne trake. J.Physiol. 566, 865–884 (2005).

7. Amilhon, B. et al. Populaciona aktivnost parvalbumina interneurona hipokampusa na theta frekvenciji. Neuron 86, 1277–1289 (2015).

8. Etter, G. et al. Optogenetska gama stimulacija spašava poremećaje pamćenja u mišjem modelu s Alchajmerovom bolešću. Nat. Commun. 10, 1–11 (2019).

9. Zutshi, I. et al. Hipokampalni neuronski krugovi odgovaraju na optogenetski pejsing theta frekvencija generiranjem ubrzanih frekvencija oscilacija. Curr. Biol. 28, 1179–1188.e3 (2018).

10. Bender, F. et al. Theta oscilacije regulišu brzinu lokomocije putem puta od hipokampusa do bočnog septuma. Nat. Commun. 6,8521 (2015).

For more information:1950477648nn@gmail.com