Abstract

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight, dragocjena biljka homologna za hranu i lijekove iz porodice Orobanchaceae, široko se uzgaja u južnom Xinjiangu u Kini. Njegovi glavni bioaktivni sastojci feniletanoidnog glikozida,echinacosideiakteozid (verbaskozid), isporučuju višestruke farmakološke aktivnosti uključujući antioksidaciju, anti-inflamaciju i regulaciju imuniteta. Nestandardizirani tradicionalni postupci obrade često uzrokuju značajne gubitke ovih ključnih aktivnih spojeva, ograničavajući primenu u medicini i funkcionalnoj hrani.Cistanche tubulosadecoction komada. Ovo istraživanje imalo je za cilj optimizaciju savremenih parametara prerade svježegCistanche tubulosakriške kako bi se maksimizirao oporavak akteozida i ehinakozida i dodatno razjasnili antioksidativni stres i antiinflamatornu bioaktivnost, kao i osnovni molekularni mehanizam optimalno obrađenih komada dekokcije na ćelijskom nivou.

Eksperimenti sa jednim faktorom su izvedeni kako bi se pregledali odgovarajući rasponi za debljinu kriške, trajanje parenja i temperaturu sušenja u pećnici. Usvojena je trofaktorna trostepena metodologija Box-Behnkenove površine odgovora za uspostavljanje modela interakcije sa više faktora, koristeći sadržaj akteozida i ehinakozida kao dvostruke indikatore evaluacije. Nakon toga, napravljen je model mišje ćelije makrofaga stimuliran lipopolisaharidom (LPS) kako bi se simulirala peroksidacija lipida i akutna upalna oštećenja. Serija biohemijskih testova uključujući MTT, ROS fluorescentnu detekciju, ELISA i Western blot primijenjena je kako bi se procijenila potentnost antioksidativnog stresa i istražili putevi prijenosa signala.

Prema eksperimentalnim rezultatima, optimalni parametri obrade su određeni kao debljina reza od 0,6 cm, obrada parom u trajanju od 6 minuta i temperatura sušenja postavljena na 57 stepeni. Pod ovim praktičnim uslovima obrade, izmjereni sadržaji akteozida i ehinakozida dostigli su 7,25 % odnosno 31,62 %, pokazujući dobru konzistentnost s teorijskim predviđenim vrijednostima. Testovi zasnovani na ćelijama otkrili su da je to optimalno obrađenoCistanche tubulosaEkstrakti decoction-komada značajno su smanjili koncentracije dušikovog oksida (NO) i malondialdehida (MDA) u makrofagima RAW264.7 izazvanim LPS-om. U međuvremenu, značajno je povećao intracelularnu antioksidativnu aktivnost enzima superoksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT), laktat dehidrogenaze (LDH), zajedno sa povećanim sadržajem glutationa (GSH). Nivoi sekrecije proinflamatornih medijatora uključujući TNF-, IL-1 i IL-6 su takođe potisnuti na način ovisan o dozi. Western-blot detekcija je to potvrdilaCistanche tubulosaekstrakti su obuzdali prekomjernu fosforilaciju ključnih proteina unutar p38/AKT/JNK/NF‑κB signalnih kaskada.

Ukratko, ovaj optimizirani moderan protokol obrade učinkovito poboljšava prinose karakterističnih feniletanoidnih glikozida (akteozida i ehinakozida) uCistanche tubulosadecoction komada. Obrađeni biljni materijal ispoljava istaknute antioksidativne i antiinflamatorne efekte u modelu ozljede makrofaga izazvanog LPS-om, čiji se farmakološki mehanizam djelomično ostvaruje preko inhibicije prekomjerne aktivacije p38/AKT/JNK/NF-makrofagnog signala u akutnom aktivaciji. Ovaj rad pruža pouzdane tehničke parametre za standardiziranu industrijsku proizvodnju i pruža eksperimentalnu podršku za razvoj antioksidantne funkcionalne hrane dobivene izCistanche tubulosa.

Ključne riječi: Cistanche tubulosa; tehnologija obrade decoction-komada; acteoside; ehinakozid; antioksidativni stres; RAW264.7 makrofag; p38/AKT/JNK/NF‑κB signalni put

1. Uvod

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight pripada porodici Orobanchaceae, a njegova mesnata ljuskava stabljika je službeni ljekoviti dio. Ova pustinjska ljekovita biljka uglavnom je zasađena u sušnom južnom Xinjiangu u Kini. U tradicionalnoj kineskoj biljnoj praksi,Cistanche tubulosasluži kao klasična tonik biljka sa dokumentovanim terapeutskim funkcijama toniziranja bubrega-janga, obnavljanja esencije krvi i opuštanja pražnjenja crijeva. Klinički se primjenjuje za ublažavanje bolova-slabosti lumbusa i koljena, neplodnosti uzrokovane nedostatkom bubrega i zatvorom uzrokovanom suhoćom crijeva维普期刊.

Feniletanoid glikozidi predstavljaju najkritičnije bioaktivne markereCistanche tubulosa. Kineska farmakopeja propisuje da ukupan sadržaj ehinakozida plus akteozida ne smije biti manji od 1,50 % za kvalifikovane medicinske materijale. Ipak, trenutna mainstream proizvodnja odCistanche tubulosakomadići decokcije i dalje uglavnom prate drevne ručne tokove rada: namakanje svježe sirove biljke, temeljito vlaženje, rezanje i prirodno sušenje ili prerada vina na pari. Ovim konvencionalnim pristupima nedostaju precizne kvantitativne tehničke specifikacije. Termička nestabilnost feniletanoidnih glikozida često dovodi do teške degradacije aktivnog sastojka tokom obrade, što umanjuje kvalitetu finalnog proizvoda i ograničava proizvodnju velikog obima visokog kvaliteta. Trenutno, samo ograničeno istraživanje istovremeno kombinuje optimizaciju tehnologije obrade sa validacijom biološke aktivnosti; većina studija samo otkriva sadržaj hemijskih sastojaka bez provere ćelijske funkcije, stvarajući praznine za industrijsku transformaciju.

Oksidativni stres djeluje kao ključni patološki okidač za više kroničnih metaboličkih i upalnih bolesti. Prekomjerna akumulacija reaktivnih vrsta kisika (ROS) remeti redoks homeostazu, dodatno provocirajući prekomjernu aktivaciju makrofaga i masivno oslobađanje proinflamatornih citokina, formirajući začarani krug između oksidacije i upale. Postojeća farmakološka istraživanja su to dokazalaCistancheFeniletanoid glikozidi porijekla posjeduju antioksidativna i antiinflamatorna svojstva. Prethodni eksperimenti na životinjama su to pokazaliCistanche tubulosaukupni glikozidi su poboljšali ozljedu jetre kod modela glodara sepse aktiviranjem Nrf2/HO‑1 antioksidativne signalizacije. Komponente lignan-glikozida izolovane izCistanche tubulosamogao ublažiti LPS-provocirane upalne odgovore putem moduliranja PI3K/AKT puta u makrofagima RAW264.7. Međutim, nije sistematski procjenjivano da li komadići dekokcije proizvedeni u novooptimiziranim uvjetima obrade zadržavaju snažnu bioaktivnost protiv oksidativnog stresa. Konkretni molekularni regulatorni mehanizam još uvijek zahtijeva dublje istraživanje.

LPS-stimulirani makrofag RAW264.7 je dobro prihvaćen model in-vitro in-vitro inflamatorno-oksidativnog oštećenja, široko prihvaćen za procjenu antioksidativnih i anti-inflamatornih efekata prirodnih proizvoda. U ovoj studiji prvo smo izvršili jednofaktorski skrining, a zatim Box-Behnkenovu optimizaciju površine kako bismo dobili standardizirane tehničke parametre za rezanje-parom-sušenje koji ciljaju na visoke prinose akteozida i ehinakozida. Nakon dobijanja optimizovanih proizvoda od decoction-komada, pripremamo biljne ekstrakte i usvajamo model oštećenja ćelija RAW264.7 izazvan LPS-om. Više eksperimentalnih platformi, uključujući mjerenje biokemijskih markera oksidativnog stresa, kvantifikaciju citokina ELISA i Western-blot analizu puta, koristi se za pojašnjavanje efikasnosti antioksidativnog stresa i mehanizma transdukcije signala. Ovo istraživanje daje praktične parametre procesa za pilotsku proizvodnju visokog kvalitetaCistanche tubulosakomadići dekokcije sa stabilnom antioksidativnom aktivnošću i postavljaju eksperimentalne temelje za kasniji razvoj funkcionalne hrane i proizvoda dijetetskih suplemenata porijeklom iz XinjiangaCistanche tubulosaresurse.

2. Materijali i metode

2.1 Sirovine, reagensi i instrumenti

SvežeCistanche tubulosamesnate stabljike ubrane su u jesen iz Hotana, Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Kina. RAW264.7 ćelijska linija mišje monocit-makrofagne leukemije kupljena je od Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Kina). Acetonitril i metanol hromatografske kvalitete isporučio je Merck (Njemačka). Referentne standardne supstance ehinakozid i akteozid (čistoća veća ili jednaka 98 %) dobijene su od Pekinškog Instituta za metrologiju tehnološkog istraživanja u Pekingu. Dimetil sulfoksid (DMSO) je kupljen od Sigma‑VETEC (SAD). DMEM medij s visokim sadržajem glukoze, komplet za analizu ukupnog proteina BCA proizvodi su Thermo Fisher Scientific (SAD). Fetalni goveđi serum (FBS) je nabavljen od BI (Izrael). Rastvor dvostrukih antitijela na penicilin-streptomicin došao je iz HyClone-a (SAD). Komercijalni setovi za analizu NO, MDA, SOD, CAT, GSH nabavljeni su od Beyotime Biotechnology (Šangaj, Kina). Komplet za detekciju LDH i lipopolisaharida (LPS,E. coli055:B5) dobijeni su od Solarbio (Peking, Kina).

Ključni laboratorijski instrumenti uključivali su sistem tečne hromatografije visokih performansi Shimadzu (HPLC), LabTech rotacioni isparivač, brzi mlevač kineskog bilja na okretanje, termostatsku peć za sušenje mlazom, opremu za parno sušenje, mikroplater za čitanje na paru, multiplater BioTek SYNE1RGY Elektronska analitička vaga FA1204N, hlađena centrifuga CF1524R, biološki sigurnosni ormarić BSC‑1300IIA2 i invertni optički mikroskop BDS200‑PH.

2.2 Eksperimenti obrade sa jednim faktorom

SvežeCistanche tubulosamesnate stabljike izrezane su na kriške različite debljine (0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm, 1,2 cm). Kriške su kuhane na pari različito vrijeme (3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min, 21 min). Potom su materijali sušeni pod različitim temperaturnim gradijentima (ambijent 25 stepeni, 40 stepeni, 50 stepeni, 60 stepeni, 70 stepeni, 80 stepeni). Potpuno osušeni uzorci decokcionog komada su usitnjeni i prosejani kroz sito od 40-mesh za naknadnu kvantifikaciju komponenti HPLC-a.

2.3 Određivanje sadržaja akteozida i ehinakozida

Priprema rastvora uzorka: Precizno izmeriti 1,0 g praškastog praha za dekokciju u konusnu tikvicu sa čepom. Dodajte 100 mL 50 % rastvora metanola precizno. Izvršite namakanje od 30 minuta nakon čega slijedi ultrazvučna ekstrakcija od 40 minuta. Nakon hlađenja, dopuniti gubitak težine rastvarača sa 50 % metanola, ravnomjerno promiješati i ostaviti da se statički slegne. Supernatant je filtriran kroz mikroporoznu membranu od 0,22 μm za HPLC injekciju.

Priprema referentnog standardnog rastvora: Precizno odmeriti odgovarajuću količinu akteozida i ehinakozida referentnih supstanci, rastvoriti sa 50% metanola unutar volumetrijskih tikvica, pripremiti standardne rastvore serijskog gradijenta, filtrirati sa filterskom membranom od 0,22 μm.

Kromatografska postavka: COSMOSIL C₁₈ analitička kolona; sistem mobilne faze: mobilna faza A: 0,1 % vodeni rastvor fosforne kiseline; mobilna faza B: acetonitril. Talasna dužina detekcije je postavljena na 330 nm; temperatura kolone 35 stepeni; protok 1 mL/min. Za kvantitativni proračun sadržaja akteozida i ehinakozida primijenjena je metoda eksternog standarda. Sveobuhvatni rezultat evaluacije=(sadržaj ehinakozida × 50 %) + (sadržaj akteozida × 50 %). Sveobuhvatni rezultati poslužili su kao kompozitni indikator procjene za performanse uslova obrade.

2.4 Eksperimentalni dizajn Box-Behnken Response-Surface

Na osnovu jednofaktornih eksperimentalnih ishoda, softver Design-Expert 13.0 je korišten za implementaciju Box-Behnken trofaktornog trostepenog eksperimentalnog aranžmana. Debljina kriške (X₁, cm), vrijeme obrade parom (X₂, min), temperatura sušenja (X₃, stepen) odabrani su kao nezavisne varijable. Sadržaj akteozida (Y₁, %) i sadržaj ehinakozida (Y₂, %) su vrijednosti odgovora. Provedeno je sedamnaest grupa eksperimenata. Nulti nivo za svaki faktor je odabran prema optimalnom parametru dobijenom u jednofaktorskim testovima. Nakon završetka ispitivanja površine odgovora, završena je analiza varijance modela, 3D crtanje površine odgovora i predviđanje stanja. Praktični verifikacioni eksperimenti su izvedeni nakon prilagođavanja teorijskih predviđenih parametara operativnim stvarnim proizvodnim vrednostima.

2.5 Ćelijska kultura i priprema uzoraka

Sirovina za decoction-piece proizvedena je u optimizovanim uslovima obrade. Biljni prah je ekstrahovan prema gore pomenutom protokolu za pripremu uzorka, koncentriran rotacionim isparavanjem i osušen u vakuumu da bi se dobio čvrsti prah ekstrakta. Osnovni rastvor je pripremljen rastvaranjem praha ekstrakta u DMSO, dalje razblažen kompletnim DMEM medijumom (koji sadrži 10% FBS i 1% penicilin-streptomicina) za ćelijske eksperimente; konačna radna koncentracija DMSO je kontrolirana ispod 0,1 % (v/v). Makrofagi RAW264.7 su kultivisani u DMEM kompletnoj podlozi pod 37 stepeni, 5% CO₂ vlažnom okruženju inkubatora.

2.6 Ispitivanje citotoksičnosti MTT

RAW264.7 ćelije su posađene na mikroploče sa 96 jažica pri gustini ćelija od 8 × 10⁴ ćelija/mL. Eksperimentalne grupe su uključivale kontrolnu grupu otapala (0,1% DMSO medij), grupu LPS-modela (konačna koncentracija LPS-a 1 ug/mL) i višestrukuCistanche tubulosagrupe za koncentraciju ekstrakta (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/mL). After 2‑h pre‑incubation with herbal sample, LPS (1 ug/mL final concentration) was supplemented to each group except solvent‑control group. Inkubacija je nastavljena 24 h. Zatim je dodan MTT reagens (5 mg/mL) i inkubiran 4 h. Odbacite supernatant, dodajte 150 μL DMSO po jažici, protresite na 37 stepeni 15 min. Vrijednost apsorpcije na talasnoj dužini od 490 nm očitana je na čitaču mikroploče i izračunata je stopa preživljavanja ćelija. Opseg bezbedne radne koncentracije određen je za prateće funkcionalne testove.

2.7 Intracelularno ROS mjerenje

Makrofagi RAW264.7 su inokulirani na ploče sa šest jažica pri gustini od 4 × 10⁵ ćelija po jažici. Nakon adherencije ćelija, izvršen je grupni tretman: grupa za kontrolu rastvarača, grupa LPS-modela i grupe za tretman ekstrakta CT (12,5, 25, 50, 100 ug/mL). Nakon predtretmana uzorkom od 2 sata, dodat je LPS 1 ug/mL osim kontrolne grupe rastvarača, inkubirajte 24 h. Intracelularni nivo ROS detektovan je metodom punjenja fluorescentnom sondom prema uputstvima kompleta. Intenzitet fluorescencije mjeren je čitačem fluorescentnih mikroploča (ekscitacija 488 nm, emisija 525 nm).

2.8 Detekcija NO, MDA, SOD, CAT, LDH i GSH

Nakon odgovarajućeg tretmana ćelija, supernatant ćelijske kulture je sakupljen za merenje NO primenom Griessove reakcije. Spojene ćelije su isprane sa prethodno ohlađenim PBS, lizirane na ledu, supernatant ćelijskog lizata je sakupljen nakon centrifugiranja (10 000 r/min, 4 stepena, 5 min). BCA komplet je odredio ukupnu koncentraciju proteina u svakom uzorku. Sadržaj MDA, GSH i indikatora enzimske aktivnosti SOD, CAT, LDH je analiziran striktno prateći operativne priručnike kompleta.

2.9 ELISA određivanje proinflamatornih citokina

RAW264.7 ćelije su primile predtretman uzorka i LPS stimulaciju ukupno 16 h. Supernatant ćelijske kulture je sakupljen i centrifugiran. Koncentracije TNF‑, IL‑1, IL‑6 u supernatantu su kvantificirane pomoću komercijalnih ELISA kompleta.

2.10 Western-blot analiza

Nakon 45 minuta koinkubacije LPS-a i uzorka, ćelije RAW264.7 su lizirane korištenjem RIPA pufera za lizu dopunjenog koktelom inhibitora proteaze-fosfataze. Ćelijski lizat je centrifugiran na 10 000 r/min pod 4 stepena 5 minuta. BCA komplet kvantificira ukupnu koncentraciju proteina. Proteini uzorka (50 ug po traci) su denaturirani u metalnom kupatilu od 100 stepeni tokom 5 minuta. SDS-PAGE gel elektroforeza odvojila je ciljne proteine, koji su zatim prebačeni na PVDF membrane. Membrane su blokirane 1 h sa 5% otopinom TBST obranog mlijeka. Primarna antitela koja ciljaju na p38, p-p38, AKT, p-AKT, JNK, p-JNK, NF-κB p65, p-NF-κB p65 i GAPDH inkubirana su preko noći na 4 stepena. Nakon ispiranja TBST-a, odgovarajuća sekundarna antitijela su inkubirana na sobnoj temperaturi 1 h. Nakon ponovljenog ispiranja, ECL ultra-osjetljivi hemiluminiscentni reagens je primijenjen za snimanje proteinskih traka. Primijenjena je kvantitativna analiza u sivim skalama za procjenu relativnog nivoa ekspresije proteina fosforilacije.

2.11 Statistička analiza

Softver GraphPad Prism 8.0.2 je korišten za statističko izračunavanje i crtanje grafikona. Rezultati eksperimentalnih kvantitativnih podataka izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Jednosmjerna ANOVA praćena post-hoc testovima višestrukog poređenja primijenjena je za međugrupno poređenje. \\(P<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Eksperimentalni rezultati

3.1 Ishodi eksperimenata sa jednim faktorom

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0,4 cm) ometa unutrašnje oslobađanje supstance, smanjujući sadržaj konačnog detektabilnog sadržaja. Pod fiksnim vremenom parenja (10 min) i temperaturom sušenja (60 stepeni), debljina kriške od 0,4 cm postigla je najvišu sveobuhvatnu ocjenu.

Rezultati trajanja obrade parom: kada je debljina kriške fiksirana na 0,4 cm i temperatura sušenja održavana na 60 stepeni, nedovoljno vrijeme parenja nije moglo dovoljno uništiti strukturu biljne ćelije tako da se aktivna jedinjenja teško rastvaraju. Kada je vrijeme kuhanja na pari premašilo 6 minuta, prekomjerno parenje je oštetilo biljno tkivo i izazvalo razgradnju ehinakozida i akteozida. Stoga je 6 minuta preliminarno identificirano kao poželjno trajanje obrade na pari.

Za eksperimente s gradijentom temperature sušenja u pećnici: fiksirana je debljina kriške 0,4 cm i vrijeme parenja 6 min. Sadržaj komponente je rastao s povećanjem temperature sušenja u određenom rasponu. Kada je temperatura sušenja prešla 60 stepeni, visokotemperaturno termičko razlaganje izazvalo je značajan pad sadržaja ciljne supstance. Stoga je 60 stepeni odabrano kao početni optimalni uvjet temperature sušenja za naknadnu optimizaciju površine odziva.

3.2 Box-Behnken Response-Surface Optimizacija i verifikacija

Sedamnaest grupa Box-Behnken eksperimentalnih serija je završeno prema matrici dizajna. Rezultati analize varijanse su pokazali da su regresijski modeli za sadržaj akteozida i ehinakozida postigli statističku značajnost (\\(P<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >debljina kriške.

Matematičkim proračunom modela, teorijski optimalni parametri obrade bili su: debljina kriške 0,600 cm, vrijeme obrade parom 5,685 min, temperatura sušenja 57,009 stepeni. Uzimajući u obzir stvarnu izvodljivost industrijskog rada, parametri su podešeni na debljinu kriške 0,6 cm, vrijeme parenja 6 min, temperatura sušenja 57 stepeni. Izvedena su tri paralelna eksperimenta validacije. Pod ovim praktičnim uslovima izmjereni sadržaj akteozida iznosio je 7,25 %, a sadržaj ehinakozida 31,62 %. Odstupanje između izmjerenih vrijednosti i teoretskog predviđanja ostalo je ispod 5 %, što je dokazalo da je ovaj model površine odgovora bio pouzdan i primjenjiv za vođenje proizvodnje komada dekokcije u stvarnom svijetu.

3.3 Cytotoxicity Screening of Optimized‑Processed Cistanche tubulosaEkstrakt u RAW264.7 ćelijama

Rezultati citotoksičnosti MTT otkrili su da koncentracija ekstrakta u rasponu od 0-100 ug/mL nije imala očiti toksični učinak na makrofage RAW264.7, čak je pokazala i blagu tendenciju podsticanja proliferacije stanica. Kada se koncentracija tretmana popela na 200 ug/mL i 400 ug/mL, stopa preživljavanja ćelija značajno se smanjila u poređenju sa grupom za kontrolu otapala, pokazujući citotoksičnost zavisnu od koncentracije. Stoga su gradijenti koncentracije od 12,5 ug/mL, 25 ug/mL, 50 ug/mL, 100 ug/mL odabrani kao sigurne radne koncentracije za naknadne ćelijske testove vezane za oksidativni stres i upalu.

3.4 Cistanche tubulosaEkstrahujte smanjeni intracelularni nivo ROS u makrofagima stimulisanim LPS

U poređenju sa kontrolnom grupom otapala, intracelularni ROS fluorescentni intenzitet grupe LPS-modela se izuzetno značajno povećao (\\(P<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration Cistanche tubulosaekstrakta, intracelularna akumulacija ROS-a je opala u zavisnosti od doze. Svaka grupa za liječenje lijekom pokazala je statistički značajno smanjenje ROS u odnosu na grupu LPS-modela (\\(P<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 Efekti na sadržaj NO i MDA

NO služi kao klasični inflamatorni medijator koji oslobađaju aktivirani makrofagi. MDA je zlatni standard biomarker koji odražava oksidativnu povredu lipidne peroksidacije. U poređenju sa grupom za kontrolu rastvarača, LPS stimulacija je značajno povećala sadržaj NO i MDA u ćelijama RAW264.7 (\\(P<0.001\)). Different dosages of Cistanche tubulosatretman ekstraktom mogao bi značajno smanjiti koncentraciju NO. Za indikator MDA: grupa od 12,5 ug/mL nije dovela do statistički značajnog poboljšanja; Koncentracione grupe od 25-100 ug/mL primetno su smanjile nivo MDA (\\(P<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Utjecaj na biohemijske indikatore povezane s antioksidansima SOD, CAT, LDH, GSH

Nakon LPS izazova, intracelularna SOD, CAT, LDH enzimska aktivnost kao i sadržaj GSH su naglo opali u odnosu na grupu za kontrolu rastvarača (\\(P<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed Cistanche tubulosaEkstrakti dekokcijskih komada mogli bi obnoviti ćelijski endogeni antioksidativni odbrambeni kapacitet protiv oksidativnih uvreda izazvanih LPS-om.

3.7 Inhibicijski učinak na otpuštanje proinflamatornih citokina TNF-, IL-1, IL-6

Rezultati ELISA detekcije pokazali su da LPS stimulacija snažno potiče lučenje TNF-, IL-1, IL-6 iz RAW264.7 makrofaga (\\(P<0.001\)). With the increase of Cistanche tubulosakoncentracija tretmana ekstrakta, količina oslobađanja ova tri ključna proinflamatorna citokina je progresivno potisnuta, što predstavlja jasnu korelaciju doza-odgovor. Potvrđeno je da biljni ekstrakt ispoljava snažnu antiinflamatornu funkciju ograničavanjem lučenja proinflamatornih citokina iz aktiviranih makrofaga.

3.8 Uredba o fosforilaciji signalnog puta p38/AKT/JNK/NF‑κB

Eksperimentalni podaci Western-blot-a pokazali su da su omjeri p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK i p-NF-κB/NF-κB značajno povišeni u grupi LPS-modela naspram grupe otapala (\\P kontrolna grupa<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage Cistanche tubulosaintervencija ekstrakcije značajno je smanjila omjer p-p38/p38 i p-JNK/JNK (\\(P<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that Cistanche tubulosaEkstrakt decoction-piece-a ublažio je oksidativno-inflamatornu ozljedu suzbijanjem hiperfosforilacijske aktivacije p38/AKT/JNK/NF-κB signalne mreže.

4. Diskusija

Tradicionalni zahtjevi obrade zabilježeni u kineskoj farmakopeji zaCistanche tubulosauglavnom uključuju uklanjanje nečistoća, pranje, vlaženje, rezanje i sušenje, bez specificiranja preciznih numeričkih parametara za debljinu kriške, trajanje parenja i temperaturu sušenja. Nestandardna ručna obrada dovodi do velike fluktuacije u kvalitetu komercijalnih proizvoda od decoction-komada. Feniletanoidni glikozidi (ehinakozid i akteozid) su termički labilna bioaktivna jedinjenja. Neodgovarajuće vrijeme zagrijavanja ili temperatura će pokrenuti hemijsku razgradnju i smanjiti ljekovitu vrijednost. Naši eksperimenti sa jednim faktorom otkrili su da bi i nedovoljno i prekomerno isparivanje, kao i previsoka temperatura sušenja, prouzrokovali gubitak ciljnih komponenti glikozida. Daljnjom Box-Behnken multifaktorskom optimizacijom dobijeni su praktični proizvodni parametri: debljina kriške 0,6 cm, parenje 6 min, sušenje 57 stepeni. Pod ovim uslovima, sadržaj akteozida i ehinakozida dostigao je 7,25 % i 31,62 %, što je daleko premašilo farmakopejski minimalni prag kvaliteta. Ovaj optimizirani protokol pruža izvodljive kvantitativne tehničke reference za standardiziranu industrijsku preradu porijeklom iz XinjiangaCistanche tubulosa.

Oksidativni stres i upala su usko povezani patološki procesi. Višak ROS inducira peroksidaciju lipida i stvara MDA, koji dalje aktivira urođene imune makrofage. Aktivirani makrofagi luče obilje NO i višestruke proinflamatorne citokine, koji nasuprot tome pojačavaju unutarćelijsku proizvodnju ROS-a, formirajući samopojačavajući oksidativno-upalni začarani krug. Prirodne antioksidativne supstance biljnog porijekla mogu prekinuti ovu patološku petlju podizanjem endogenog antioksidativnog enzimskog sistema i ograničavanjem prijenosa upalnog signala. U ovoj in-vitro studiji, optimalno obrađenoCistanche tubulosaEkstrakti decoction-komada snizili su nivoe ROS, NO i MDA, dok su poboljšali aktivnosti SOD, CAT, LDH i sadržaj GSH u makrofagima RAW264.7 stimulisanim LPS. Istovremeno je inhibirao lučenje proinflamatornih citokina TNF-, IL-1, IL-6, pokazujući integrisani antioksidativni stres i antiinflamatorni kapacitet.

Molekuli porodice mitogen-aktiviranih protein-kinaza p38, JNK zajedno sa AKT i NF-κB sačinjavaju centralno čvorište za transdukciju signala koje posreduje inflamatorno-oksidativnim odgovorima makrofaga. Nakon LPS stimulacije, uzvodni signal pokreće aktivaciju fosforilacije p38, JNK i AKT, što sekvencijalno promovira fosforilaciju NF-κB p65 podjedinice i nuklearnu translokaciju. Aktivirani NF‑κB djeluje kao transkripcijski faktor i pokreće transkripciju velikih serija proinflamatornih citokina i gena povezanih sa oksidativnim stresom. Naši Western-blot rezultati su to pokazaliCistanche tubulosaekstrakt može potisnuti fosforilaciju p38, JNK, AKT i NF‑κB p65. Stoga zaključujemo da se njegova antioksidativni stres i antiinflamatorna bioaktivnost postižu, barem djelomično, blokiranjem prekomjerne aktivacije p38/AKT/JNK/NF-κB signalne ose.

U okviru trenutnog istraživanja postoji nekoliko ograničenja. Sve funkcionalne verifikacije ograničene su na in-vitro nivo ćelijske kulture. Potrebni su daljnji in-vivo eksperimenti na životinjskom modelu kako bi se potvrdile in-vivo farmakodinamičke performanse optimiziranih komada dekokcije. Osim toga, u ovoj studiji je usvojen ukupni mješoviti ekstrakt iz komada dekokcije, tako da ne možemo razlikovati pojedinačni doprinos ehinakozida, akteozida i drugih manjih sekundarnih metabolita. Naknadno istraživanje može izolovati monomerna jedinjenja kako bi se uporedila odgovarajuća potencija antioksidativnog stresa i sprovelo ispitivanje efekta kompatibilnosti. Čak i tako, naš sadašnji rad i dalje pruža praktične parametre obrade i tehnologije i preliminarne mehaničke dokaze za razvojCistanche tubulosa‑srodni proizvodi za zdravstvenu njegu.

5. Zaključak

U zaključku, modernizovani tok obrade optimizovan Box-Behnken metodologijom odgovorne površine (debljina kriške 0,6 cm, parenje 6 min, temperatura sušenja 57 stepeni) može značajno povećati sadržaj akteozida i ehinakozida uCistanche tubulosadecoction komada. Ekstrakti pripremljeni od ovih optimalno obrađenih biljnih kriški pokazuju istaknuti antioksidativni stres i antiinflamatorne efekte protiv oštećenja makrofaga RAW264.7 izazvanog LPS-om. Osnovni mehanizam je u korelaciji sa obnavljanjem intracelularnog antioksidantno-odbrambenog sistema i inhibicijom prekomerne aktivacije p38/AKT/JNK/NF‑κB upalnog signalnog puta. Ova studija pruža solidnu eksperimentalnu osnovu za standardiziranu industrijsku proizvodnju i funkcionalno-hranu eksploatacijuCistanche tubulosaresurse.

Reference

Lin J, Yu H, Zhao Y, et al. Ekstrakcija ehinakozida izCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight i istraživanje njegovog zaštitnog efekta na ozljedu jetre kod pacova sa sepsom. Food Sci Technol, 2023, 43:e010523.

Guo J, Tang S, Miao Y, et al. Protuupalni efekti lignanskih glikozida izCistanche tubulosaproizlazi iz ćelija makrofaga RAW264.7 izazvanih LPS/IFN-om putem PI3K/AKT puta. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2021, 22(10):1380‑1391.

Rani V, Deep G, Singh RK, et al. Oksidativni stres i metabolički poremećaji: Patogeneza i terapijske strategije. Nauke o životu, 2016, 148:183‑193.

Park JH, Kim JH, Jang S I. Anti-inflamatorno dejstvo dise-necionil cis-kelaktona u LPS-stimulisanim ćelijama RAW264.7 i njegova inhibitorna aktivnost na rastvorljivu epoksid hidrolazu. Heliyon, 2023,9(10):e21032.

Chung YC, Song S J. Isobavachin ublažava upalne odgovore u makrofagima izazvane lipopolisaharidom supresijom MAPK i NF-κB signalnih puteva. Journal of Ethnopharmacology, 2024,321:117501.

He X, Li Y, Deng B. PI3K/AKT signalni put u upali, smrti ćelija i formiranju glijalnih ožiljaka nakon traumatske ozljede kičmene moždine. Cell Proliferation, 2022,55(9):e13275.