Oligosaharidi ublažavaju akutnu ozljedu bubrega ublažavanjem klastera diferencijacije 44-posredovanih imunoloških odgovora u bubrežnim tubularnim stanicama

sažetak:Akutna povreda bubrega (AKI)je iznenadna epizodaoštećenje bubregakoji se obično javlja kod pacijenata primljenih u bolnice. Do danas nije razvijen idealan tretman za smanjenjeAKI ozbiljnost. Oligo-fukoidan(FC) interferira sa klasterom proteina površine renalnih tubularnih ćelija diferencijacije 44 (CD44) kako bi se spriječila intersticijska fibroza bubrega; međutim, uticaj oligosaharida na AKI ostaje nepoznat. U ovoj studiji, FC, galakto-oligosaharid (GOS) i frukto-oligosaharid (FOS) su odabrani za ispitivanje utjecaja oligosaharida na AKI. Dokazano je da se sva tri oligosaharida djelomično apsorbuju u crijevima. Otkrili smo da oligosaharidi ovisno o dozi smanjuju antigenost CD44 i potiskuju ekspresiju CD44, fosfo-JNK, MCP-1, IL-1 i TNF-a izazvanu hipoksijom u NRK-52E bubrežne tubularne ćelije. U međuvremenu, transfekcija CD44 siRNA i JNK inhibitor SP600125 smanjili su ekspresiju fosfo-JNK i citokina izazvanu hipoksijom. Ligand CD44, hijaluronan, suprotstavio se uticaju oligosaharida na CD44 i fosfo-JNK. Dva dana nakon operacije zbog ishemijsko-reperfuzijske ozljede, oligosaharidi su smanjili upalu bubrega, serumski kreatin, MCP-1, IL-1 i TNF- kod AKI miševa. 7 dana nakon operacije, ubrzan je oporavak bubrega. Ovi rezultati pokazuju da FC, GOS i FOS inhibiraju hipoksijom izazvanu CD44/JNK kaskadu i citokine u bubrežnim tubularnim ćelijama, čime se poboljšava AKI i upala bubrega kod AKI miševa. stoga,suplementacija oligosaharidaje potencijalna zdravstvena strategija za pacijente sa AKI.

Ključne riječi: akutna povreda bubrega; klaster diferencijacije 44; frukto-oligosaharid; galaktooligosaharid; oligo-fukoidan; upala

1. Uvod

Akutna povreda bubrega(AKI) karakterizira naglo smanjenje brzine glomerularne filtracije i posljedično povećanje serumskog kreatinina. Ovo oštećenje je uobičajeno kod pacijenata primljenih u bolnice i jedinice intenzivne njege, posebno kod starijih osoba. Ishemija, sepsa i nefrotoksičnost su glavni uzroci AKI koji često koegzistiraju i stoga kompliciraju dijagnozu i liječenje [1]. Teški AKI stavlja otpuštene pacijente u rizik od neželjenih događaja, kao što su hronična bolest bubrega, kardiovaskularni događaji, rak i infekcije [2]. AKI se brzo razvija i ne postoji efikasan tretman koji bi izbjegao ili smanjio njegovu težinu. Unos specifičnih nutrijenata može smanjiti oštećenje bubrežnih tubulara kod AKI [3]. Stoga će proučavanje utjecaja specifične prehrane na AKI pomoći u poboljšanju AKI i popratnih rizika s kojima se suočavaju otpušteni pacijenti.

Upala i regrutacija leukocitasu ključni posrednici AKI. Bubrezi, posebno bubrežne tubularne ćelije, stvarajuinflamatornih citokinatokom AKI, kao što su IL-1, IL-6, protein hemoatraktant monocita-1 (MCP-1) i faktor nekroze tumora- (TNF-) [4,5] . Ovi citokini dalje indukuju sistemsku upalu i regrutaciju leukocita. Iako nekoliko podskupina leukocita ima zaštitne efekte na AKI (kao što su T-regulatorne ćelije), većina neutrofila, monocita i dendritskih ćelija štetna je za oporavak AKI-ja [6]. Sistemska upala je takođe štetna za oporavak od AKI zbog visokog nivoa citokina [7]. Među citokinima koje luče bubrezi, MCP-1 je uglavnom odgovoran za regrutaciju leukocita, reaguje na različite citokine, uključujući IL-1 i TNF- [8,9], i igra važnu ulogu u patogenezi različitih povreda bubrega [10]. U humanim proksimalnim tubularnim ćelijama HK-2, ekspresija MCP-1 izazvana hipoksijom je posredovana putem c-Jun NH2- terminalne kinaze (JNK) [11]. Put p38 je također uključen u albumin-indukovanu MCP-1 ekspresiju u bubrežnim tubularnim epitelnim ćelijama [12]. Stoga, regulacija JNK i p38 puteva može uticati na upalu i regrutaciju leukocita u AKI.

Oligosaharidi su saharidni polimeri koji sadrže 3-10 monosaharida koji su neprobavljivi i predstavljaju glavnu komponentu ukupnih dostupnih prebiotika kao dijetetskih aditiva [13]. Većina frukto-oligosaharida (FOS) unesenih u ljudsko tijelo potpuno je fermentirana florom debelog crijeva, a mali dio se nalazi u urinu [14]. Galakto-oligosaharidi (GOS) se mogu apsorbirati u krvi i potom izlučiti urinom [15]. Ista situacija vrijedi i za fukoidan u smeđim morskim algama [16]. Apsorbirani oligosaharidi mogu utjecati na biokemijske reakcije i prepoznavanje stanica [17]. Naša prethodna studija otkriva da oligo-fukoidan (FC) ometa interakciju između površinskog proteina CD44 bubrežne tubularne ćelije i njegovih ekstracelularnih liganada, čime se sprečava intersticijalna fibroza bubrega [18]. Interakcija između CD44 i njegovih ekstracelularnih liganada promoviše JNK signalni put [19]. Stoga, svakodnevno uzimanje oligosaharida može smanjiti upalu bubrega kod pacijenata s AKI. Međutim, uticaj ovih polimera na AKI ostaje nepoznat. Ova studija je istraživala učinak FC, FOS i GOS na bubrežne tubularne ćelije tretirane hipoksijom i AKI miševe s ishemijsko-reperfuzijskom ozljedom (IRI). Rezultati su pokazali da tri oligosaharida potiskuju CD{16}posredovane bubrežne imune odgovore i smanjuju težinu nakon AKI. Stoga, upotreba ovih polimera kao dodataka ishrani predstavlja novu strategiju liječenja AKI

2. Materijali i metode

2.1. Materijali

FOS (prosečan stepen polimerizacije < 10), GOS (prosečan stepen polimerizacije < 8) i FC (prosečan stepen polimerizacije < 5) dobijeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD, Kat. br. F8052), Carbosynth (Berkshire, UK, kat. br. OG32134) i Hi-Q Marine Biotech International (Taipei, Tajvan). Oligosaharidi su otopljeni u dvostruko destiliranoj H2O i filtrirani korištenjem sterilnih filtera od 0,22 µm (Merck Millipore, Darmstadt, Njemačka). Hijaluronan (HA) i sve druge hemikalije reagensa su dobijene od Sigme. Antitela protiv JNK (sc-7345), fosfo-JNK (sc-6254), MCP-1 (sc-52701), IL-1 (sc{{17 }}), i TNF- (sc-52746) kupljeni su od Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, SAD). Antitela protiv p38 (9212) i fosfo-p38 (9211) dobijena su od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SAD). Antitijela protiv Ly6G (ab25377) i F4/80 (ab100790) kupljena su od Abcam-a (Cambridge, UK). Antitijela protiv HIF-1 (NB100-105) su kupljena od Novus Biologicals (Centennial, CO, USA).

2.2. Cell Culture

Proksimalne bubrežne tubularne ćelije pacova (NRK-52E) i linija makrofaga miša RAW264.7 kupljene su od Instituta za istraživanje i razvoj prehrambene industrije (Hsinchu, Tajvan); kultivisan u DMEM-u sa dodatkom antibiotika/antigljivične otopine i 10% fetalnog telećeg seruma; i čuva se na 37 ◦C i 95% vlažnosti u CO2 inkubatoru. Nakon postizanja 70% konfluencije, ćelije su uzgajane u mediju bez seruma i inkubirane preko noći prije eksperimenta. Za eksperiment hipoksije, NRK-52E ćelije i Anaero Pack (Mitsubishi Gas Chemical America, New York, NY, SAD) stavljeni su u pravougaone tegle (Mitsubishi Gas Chemical America), a cjelokupna postavka je stavljena u 37 ◦C inkubator 4 h. Ćelije su potom kultivisane preko noći u normalnim uslovima.

2.3. Western blot analiza

Ukratko, 15 µg NRK-52E proteinskog lizata je primijenjeno na svaku traku, a rezultati su analizirani Western blot-om. Relativni nivoi proteinskih traka su kvantifikovani iz pet nezavisnih eksperimenata pomoću Quantiscan softvera iz Biosofta (Cambridge, UK).

2.4. Kratka interferirajuća (si)RNA transfekcija CD44

CD44 siRNA pacova (4390771) kupljena je od Thermo Scientifica (Waltham, MA, SAD). Nakon rasta do 70% konfluencije, ćelije su transficirane siRNA pomoću Lipofectamine 2000 transfekcionog reagensa (Thermo Scientific) prema uputama proizvođača.

2.5. Test ćelijske proliferacije

Nakon što su hipoksične NRK-52E ćelije kultivisane 24 h, isti medijum je korišćen za kultivaciju ćelija RAW264.7 u 96-ploči sa jažicom (2000 ćelija/bunariću). Nakon 24 h inkubacije, proliferacija ćelija RAW264.7 je analizirana upotrebom SRB Assay Kit (Abcam, Kat. br. ab235935) prema uputstvima proizvođača.

2.6. CD44 testovi antigenosti

Rekombinantni CD44 štakora je dobijen od R&D Systems (Minneapolis, MN, SAD, Kat. br. 6577-CD) i korišten za proizvodnju reakcije vezivanja sa HA prema uputama proizvođača. Ukratko, 20 ng/mL rekombinantnog CD44 pacova pomiješano je sa različitim koncentracijama FC, FOS ili GOS tokom 10 minuta kako bi se istražio utjecaj oligosaharida na antigenost CD44. Smeše su analizirane korišćenjem CD44 ELISA kompleta (Abcam, kat. br. ab213928) prema uputstvima proizvođača.

2.7. Eksperimentalne životinje i bubrežni IRI

Osmonedeljni muški 129S1/SvImJ miševi su kupljeni od Lasco Technology (Taipei, Tajvan). Sve eksperimente na životinjama odobrio je Komitet za eksperimentalnu njegu i upotrebu životinja Medicinskog univerziteta Taipei (br. odobrenja LAC-2019-0511) i formiran od strane NIH Vodiča za njegu i korištenje laboratorijskih životinja. Za indukciju IRI, miševi (težine 21-23 g) bili su podvrgnuti bilateralnom stezanju bubrežne pedikule u trajanju od 30 minuta provođenjem bočne incizije [20]. Miševi su preoperativno anestezirani inhalacijskom anestezijom izofluranom. Lažno operisani miševi su podvrgnuti sličnoj operaciji, osim stezanja bubrežnih pedikula. Svi miševi su hranjeni oligosaharidima kroz oralnu gavažu od 1 dan prije do 2 dana nakon IRI operacije. Eksperimentalni miševi su podijeljeni u sljedećih pet grupa sa n=8 za rezultate 3. i 7. dana: (1) lažna grupa; (2) AKI grupa; (3) AKI grupa hranjena sa FC (10 mg/kg/dan); (4) AKI grupa hranjena sa FOS (10 mg/kg/dan); i (5) AKI grupa hranjena sa GOS (10 mg/kg/dan). Miševi su žrtvovani 3 ili 7 dana nakon operacije, a krv je sakupljena i analizirana pomoću biohemijskog analizatora i ELISA kompleta. Nivo kreatinina u serumu kod svakog miša je analiziran kako bi se procijenio razvoj AKI. Morfologija bubrega je ispitivana periodičnom kiselinom–Schiff (PAS) bojenjem i imunohistohemijskim bojenjem (IHC) u formalinom fiksiranim parafinskim rezovima od 2 µm.

2.8. Imunohistohemijsko bojenje

Tkiva bubrega su fiksirana sa 4% puferovanog paraformaldehida, ugrađena u parafin i izrezana na dijelove od 2 µm za bojenje pomoću UltraVision Quanto Detection System HRP DAB kompleta (Thermo Scientific, Fremont, Kalifornija, SAD) i hibridizirana s primarnim antitijelom prema uputama proizvođača. .

2.9. PAS bojenje

Presjeci bubrega su obojeni PAS Stain Kit-om (Abcam, Kat. br. ab150680) u skladu sa uputstvima proizvođača.

2.10. ELISA test

Uzgajana podloga NRK-52E ćelija i uzorci seruma eksperimentalnih miševa su sakupljeni i analizirani pomoću MCP-1 ELISA kompleta (Abcam, kat. br. ab208979) i IL-1 ELISA komplet (Abcam, kat. br. ab197742). Uzorci seruma su takođe analizirani korišćenjem kompleta za TNF-ELISA (R&D Systems, kat. br. MTA00B) i ELISA kompleta za lipokalin povezan sa neutrofilnom želatinazom (NGAL) (R&D Systems, kat. br. MLCN20) od strane uputstva proizvođača.

2.11. Statistički testovi

Značajne razlike između ove dvije grupe utvrđene su korištenjem Studentovog t-testa. Razlike su smatrane značajnim za p vrijednosti<0.05

3. Rezultati

3.1. Oligosaharidi inhibiraju povećanje CD44 i citokina u hipoksičnim NRK-52E ćelijama

Ekspresija CD44 u NRK-52E ćelijama tretiranim sa FC, FOS i GOS prvo je praćena da bi se procenio uticaj oligosaharida na bubrežne tubularne ćelije. Ekspresija CD44 izazvana hipoksijom bila je inhibirana sa sva tri oligosaharida u rasponu od 0.05–0.5 mg/mL (Slika 1A). Stoga je doza oligosaharida od 0,1 mg/mL korištena u sljedećim eksperimentima na ćelijama. U pripremljenom sistemu, tretman hipoksije je značajno inducirao ekspresiju markera hipoksije HIF-1 u NRK-52E ćelijama, što ukazuje da su ćelije bile u stanju hipoksije (Slika 1B). Hipoksija je povećala nivoe fosforilisanog JNK, MCP-1, IL-1 i TNF-a, ali ne u ćelijama tretiranim oligosaharidima (Slika 1B, C). Ekspresija JNK se povećala u hipoksičnim ćelijama, ali ne i u ćelijama tretiranim FC ili FOS. GOS nije uticao na ekspresiju JNK u hipoksičnim ćelijama, ali je potisnuo regulaciju fosforilisanog JNK. Stoga, oligosaharidi mogu inhibirati hipoksijom izazvanu JNK signalnu transdukciju i ekspresiju citokina u bubrežnim tubularnim stanicama. Iako su FC i GOS povećali fosforilirani p38 u hipoksičnim stanicama, ekspresija ovog proteina se nije povećala u hipoksičnim stanicama. Ovaj nalaz ukazuje da p38 ne igra ključnu ulogu u odgovorima izazvanim hipoksijom u NRK-52E ćelijama.

3.2. CD44 i JNK igraju kritičnu ulogu u povećanju citokina u hipoksičnim NRK-52E ćelijama

Oligosaharidi su uticali na ekspresiju CD44, fosforiliranog JNK i citokina u bubrežnim tubularnim ćelijama, ali njihova povezanost ostaje da se razjasni. Da bi se istražila uloga CD44 u JNK signalnoj transdukciji i ekspresiji citokina u hipoksičnim ćelijama, NRK-52E ćelije su transficirane različitim dozama CD44 siRNA. CD44 siRNA u 50 i 100 popodne efikasno je blokirala ekspresiju CD44 povećanu hipoksijom i značajno inhibirala povećanje nivoa fosforilisanog JNK, MCP- 1, IL-1 i TNF-a izazvano hipoksijom (slika 2A). Uticaj blokiranja CD44 na ekspresiju JNK bio je povezan sa dozama siRNA. Ekspresija JNK u hipoksičnim ćelijama indukovana je CD44 siRNA pri 50 pM, ali inhibirana pri 100 pM. Obe doze su suzbile regulaciju fosforilisanog JNK. Selektivni inhibitor za JNK, SP600125, značajno je smanjio ekspresiju MCP-1, IL-1 i TNF- u hipoksičnim NRK-52E ćelijama (slika 2B). Ovi rezultati sugeriraju da se inhibitorni učinak transfekcije CD44 siRNA na citokine izazvane hipoksijom pripisuje smanjenju fosforilisanog JNK.

Slika 1. Inhibicijski efekat oligosaharida na transdukciju CD44 signala u hipoksičnim NRK-52E ćelijama. Ćelije su prethodno tretirane FC, FOS ili GOS 30 min, a zatim podvrgnute hipoksičnoj kulturi. Ekspresija proteina je analizirana Western blottingom. (A) Učinci oligosaharida ovisni o dozi na ekspresiju CD44. (B) Utjecaj oligosaharida na signale vezane za CD44-. Koncentracija oligosaharida postavljena je na 0,1 mg/mL. Relativna povećanja proteinskih traka su također predstavljena u obliku trake (C). Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SD (n=4).

Slika 2. Uloga CD44 i JNK u inflamatornim odgovorima izazvanim hipoksijom u NRK-52E ćelijama. Ekspresija proteina je analizirana Western blot-om. (A) Inhibicijski efekat transfekcije CD44 siRNA na fosforilisani JNK i citokine. (B) Inhibicijski efekat SP600125 na citokine. Ćelije su prethodno tretirane sa 20 µM SP600125 tokom 30 min pre tretmana hipoksije. Relativna povećanja proteinskih traka su također predstavljena u obliku trakastog grafikona. Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SD (n=4).

3.3. Hipoksijom izazvano lučenje citokina u bubrežnim tubularnim ćelijama potiče proliferaciju makrofaga

Upala je posrednik oštećenja bubrega u AKI. Stoga je ispitan uticaj oligosaha na leukocite. Slika 3A pokazuje da FC, FOS i GOS nisu uticali na proliferaciju ćelija makrofaga RAW264.7. Proliferaciju ćelija RAW264.7 promovira 24-satni medij za kulturu hipoksičnih NRK-52E ćelija (Slika 3B), ali ne i medij za hipoksične NRK-52E ćelije tretirane sa oligosaharidi. Prvi je imao više nivoe MCP-1 i IL-1 od drugog (Slika 3C, D). Sva tri oligosaharida značajno su smanjila MCP-1 i IL-1 u mediju kulture hipoksičnih NRK-52E ćelija. Stoga, FC, FOS i GOS mogu smanjiti ekspresiju i lučenje citokina u hipoksičnim bubrežnim tubularnim stanicama i, posljedično, umanjiti upalu uzrokovanu oštećenim bubrežnim tubularnim stanicama.