Platforme za vakcine na bazi nukleinske kiseline protiv bolesti korona virusa 19 (COVID-19)

Abstract

Pandemija bolesti korona virusa 2019. (COVID-19) zarazila je 673.010.496 pacijenata i uzrokovala smrt 6.854.959 slučajeva u svijetu do danas. Uloženi su ogromni napori da se razviju fundamentalno različite platforme za vakcinu protiv COVID{8}}. Vakcine na bazi nukleinske kiseline koje se sastoje od mRNA i DNK vakcina (cjepiva treće generacije) obećavaju u smislu brze i pogodne proizvodnje i efikasnog izazivanja imunoloških odgovora protiv COVID-19. Nekoliko zasnovano na DNK (ZyCoV-D, INO-4800, AG0302-COVID19 i GX-19N) i na mRNA (BNT162b2, mRNA-1273 i ARCoV) odobrene platforme za vakcine su korištene za prevenciju COVID-19. mRNA vakcine su na čelu svih platformi za prevenciju COVID-19. Međutim, ove vakcine imaju manju stabilnost, dok su DNK vakcine potrebne sa većim dozama za stimulaciju imunoloških odgovora. Intracelularna isporuka vakcina na bazi nukleinske kiseline i njihovi neželjeni događaji zahtijevaju daljnja istraživanja. Uzimajući u obzir ponovnu pojavu COVID-19 varijanti koje izazivaju zabrinutost, ponovna procjena vakcine i razvoj polivalentnih vakcina, ili strategija za pankorona virus, od suštinskog je značaja za efikasnu prevenciju infekcije.

Prednosti suplemenata cistanche-kako ojačati imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Ključne riječi

Koronavirusna bolest 19 · Vakcine na bazi nukleinske kiseline · Imunitet · Zaštita

Pozadina

Krajem 2019. novi beta virus korona pojavio se u Wuhanu u Kini i brzo se proširio svijetom. Koronavirusna bolest 2019. (COVID-19) ima veliki potencijal pandemije zbog visoke stope zaraznosti sa visokom smrtnošću na globalnom nivou (Sharma et al. 2020; Su et al. 2020; Wibawa 2021). Stoga su potrebni značajni napori da se razviju efikasne vakcine ili terapije protiv bolesti (Su et al. 2020). Simptomi bolesti COVID-19 variraju, uključujući blage simptome slične fu, upalu pluća, sindrom akutnog respiratornog distresa (ARDS) i smrtonosni ishod. Pacijenti s rakom, dijabetesom, kardiovaskularnim bolestima, starije odrasle osobe, pa čak i genetski predisponirane osobe su u najvećem riziku od COVID-19 ozbiljnosti (Sharma et al. 2020; Su et al. 2020; Wibawa 2021; Vakil et al. 2022). Prema preporukama Svjetske zdravstvene organizacije (WHO), nošenje maski, korištenje antivirusnih lijekova, socijalno distanciranje i pridržavanje procedura vakcinacije ključna su ponašanja za kontrolu pandemije COVID{14}} širom svijeta (Sharma et al. 2020). Naučni napori ka razvoju efikasnih vakcina protiv invazivnih patogena datiraju mnogo godina unazad (Deb et al. 2020; Zhang et al. 2020; Wibawa 2021). Ove platforme za vakcine su takođe dizajnirane protiv patogenih bakterija (Farhani et al. 2019; Jafari i Mahmoodi 2021). U tom smislu, razvoj efikasne, zaštitne i sigurne vakcine smatra se ključnim preventivnim pristupom za sprečavanje širenja teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirusa 2 (SARS-CoV-2) (Moore i Klasse 2020). Stoga su se različite farmaceutske kompanije i istraživački timovi širom svijeta takmičili u predstavljanju sigurne i efikasne vakcine protiv COVID-19 za upotrebu međunarodne zajednice. Ovi napori razvili su druge platforme za vakcine za ulazak u pretklinička i klinička ispitivanja i neke od njih su odobrene (Chen et al. 2021), uključujući tradicionalne vakcine kao što su žive ili inaktivirane, podjedinice i vakcine na bazi nukleinske kiseline kao vakcine sledeće generacije (Moore i Klasse 2020). Na osnovu naučnih dokaza, žive atenuirane vakcine stimulišu urođeni, ćelijski i humoralni imuni odgovor indukujući Toll-like receptore (TLR) sa dugotrajnim imunitetom i mogu razviti preosjetljivost. Glavni nedostatak ovih vakcina je njihova skupa procjena sigurnosti i efikasnosti. Inaktivirane virusne vakcine slabo provociraju ćelijske imune odgovore što umanjuje njihovu efikasnost. U aprilu 2020., Sinovac i Institut za biološke proizvode iz Wuhana (Sinopharm) proizveli su inaktiviranu vakcinu protiv COVID-19 (Moore i Klasse 2020; Su et al. 2020). Podjedinične vakcine su sigurne, s nekim nedostacima uključujući nisku imunogenost, potrebu za pojačanim ili pomoćnim cjepivom i visoku cijenu (Koirala et al. 2020; Su et al. 2020). Vakcine na bazi nukleinske kiseline razvijene su na osnovu informacija o sekvenci. Oni uključuju DNK ili mRNA sekvence antigena koji snažno stimuliraju ćelijske i humoralne imune odgovore u različitim dozama. Zbog njihovih prednosti, kao što su brza proizvodnja i najranije vakcine protiv COVID{40}} u kliničkim ispitivanjima, primjetna prednost vakcina zasnovanih na DNK je njihova stabilnost u različitim uvjetima skladištenja (Silveira et al. 2020; van Riel i de Pamet 2020). Vakcine zasnovane na RNK privukle su više pažnje farmaceutskih kompanija kao što su Pfizer/Biotech i Moderna. Za razliku od DNK vakcina, one stimulišu efikasan humoralni imuni odgovor kao TLR ligandi bez adjuvansa, a njihova sekvenca je modifikovana da spreči degradaciju mRNA (Moore i Klasse 2020; van Riel i de Wit 2020; Soiza et al. 2021). Ovaj pregled je imao za cilj procijeniti nedavni razvoj vakcina na bazi nukleinskih kiselina, uključujući mRNA i DNK vakcine protiv COVID-19.

Glavni tekst

Koronavirus molekularni mehanizam infekcije i imunološki odgovor

cistanche biljka koja povećava imuni sistem

Genom COVID-19 je pozitivna jednolančana RNK koja kodira četiri glavna strukturna proteina koji se sastoje od ovojnice (E), šiljka (S), membrane (M) i nukleokapsida (N) (Stadler i Rappuoli 2005.), kao što je prikazano na slici 1a. Ljudski SARS-CoV obuhvata spike (S) glikoprotein kao dio omotača. Ugrađivanje virusa u ćelije domaćina vrši se šiljastim proteinom koji se sastoji od S1 i S2 podjedinica. Oni igraju esencijalnu ulogu u vezivanju za receptore ćelije domaćina poznate kao enzim koji pretvara angiotenzin II (ACE2) za iniciranje infekcije (slika 1b). Centralni region domena S1 koji se vezuje za ACE2 sa visokim afinitetom je domen koji se vezuje za receptor (RBD). U tom smislu, interakcija između RBD i ACE2 je potrebna za iniciranje infekcije ljudskih ćelija (He et al. 2020). Osim toga, skraćenje S proteina je bitno za ulazak virusa u ćelije domaćina; nakon vezivanja RBD regiona za ACE2, proteaza domaćina poznata kao TM proteaza serin 2 (TMPRSS2) cijepa S protein na S1 i S2 domene što dovodi do fuzije S2 domena u ćeliju domaćina (Huang et al. 2020). Iako su jaki imuni odgovori efikasni protiv COVID-19, preosjetljivosti i citokinske oluje (uglavnom interleukin-6-, IL-1b, GM-CSF-, interferon- /IFN-, faktor nekroze / TNF -, IL-10-, IL-2- i IL- 7-odgovori) moraju biti zabranjeni (Chowdhury et al. 2020). Nakon vezivanja virusa (interakcija šiljak-ACE2) i ulaska u respiratorne ćelije, fagocitni alveolarni makrofagi i dendritične ćelije (DC) predstavljaju virusne antigene T ćelijama i aktiviraju T CD4+(pomoćne T ćelije) i T CD{{37 }}(citotoksična T ćelija). Nakon toga, proinflamatorni citokini poput IL6, IL12, TNF i IFN, itd. se oslobađaju da bi se susreli s virusom. Međutim, visoki nivoi proizvodnje citokina koji dovode do citokinske oluje uzrokuju oštećenje pluća (Hosseini et al. 2020). Prema naučnim dokazima, pomoćne T ćelije su neophodne za eliminaciju virusne infekcije, indukciju B ćelija da proizvode antitela i stimulaciju citotoksičnih T ćelija (Sharma et al. 2020). Antigenske mete COVID‑19 U razvoju sigurne i zaštitne vakcine protiv patogenog organizma, od suštinskog je značaja identifikovanje najboljih imunogenih meta (Lu et al. 2020b). Usvajanje potencijalnih antigenskih ciljeva je ključno za provociranje epitopa T ćelija i B ćelija da pravilno induciraju ćelijski i humoralni imunitet (Rueckert i Guzmán 2012). Virusni S protein stupa u interakciju sa ćelijama domaćina preko RBD domena kao esencijalni ligand. RBD domena može inducirati proizvodnju neutralizirajućih antitijela i imunološki odgovor T-ćelija na COVID-19. Takođe, potvrđena je imunogenost proteina S (Pushparajah et al. 2021). N protein ima malu i visoko očuvanu sekvencu u poređenju sa drugim virusnim proteinima. Protein N je visoko eksprimiran tokom virusne infekcije, sa značajnim povezanim humoralnim imunološkim odgovorom na COVID-19 među pacijentima. Dodatno, sa ćelijskim odgovorima na N protein, može se smatrati odgovarajućim kandidatom za antigen u dizajnu vakcine (Dutta et al. 2020). Pored toga, M protein i E protein stimulišu T CD4+epitope (Wang et al. 2005; Abdelmageed et al. 2020; Dong et al. 2020). Izazivanje snažnog imunološkog odgovora na S protein je odlučujuće i neophodno (Buchholz et al. 2004). S protein uključuje najimunogenije epitope T ćelija i B ćelija poznatih kao poželjne mete u razvoju vakcine protiv COVID-19. Primijenjen je u svim razvijenim mRNA platformama vakcinama kao što su Pfizer/BioNtech i Moderna vakcine.

Slika 1 a Struktura viriona SARS-CoV-2; glavni površinski proteini virusa COVID-19 uključuju Spike (S) glikoprotein, Membran (M) i Envelope (E) proteine. S protein je glavna vakcina i terapeutska meta koja stupa u interakciju sa receptorom enzima koji konvertuje angiotenzin II (ACE2) za iniciranje infekcije. b Domeni spike proteina; S protein uključuje S1 (NTD ili neprevedeni domen i RBD ili domen koji vezuje receptor) i S2 podjedinice

Povijest lijekova na bazi nukleinskih kiselina

Oligonukleotidi su uvedeni u klinička ispitivanja prije više od 30 godina. Povijest korištenja terapijskih pristupa zasnovanih na nukleinskim kiselinama datira iz 1977. godine kada su Paterson et al. koristili nukleinske kiseline za podešavanje ekspresije gena (Paterson et al. 1977). Trenutno su dobili više pažnje. Lijekovi na bazi nukleinske kiseline podijeljeni su u različite kategorije, uključujući antisens forme, ribozime, mRNA i vakcine zasnovane na DNK (Sharma et al. 2014). Sintetički oligodeoksinukleotid inhibirao je replikaciju virusa Rous sarkoma (RSV), koji je bio komplementaran RSV mRNA i bio je poznat kao antisens (Zamecnik i Stephenson 1978). Prvi antisens je uveden u kliniku protiv citomegalovirusa (CMV) (Mulamba et al. 1998). Mala interferirajuća RNK (siRNA) ima potencijal da inhibira ekspresiju gena i, po prvi put, objavljena je 1998. Druga grupa malih nekodirajućih RNK ​​uključuje mikroRNA (miRNA) koje imaju nezamjenjivu ulogu u regulaciji ekspresije gena, sa funkcije slične onima kod siRNA i terapijski potencijal (Usman i Blatt 2000; Sharma et al. 2014). Kao što je spomenuto, klasa ribozima molekula RNK djeluje kao enzimi koji ciljaju transkripciju. Ribozimi su ušli u klinička ispitivanja protiv raka i nekih virusnih infekcija kao što je virus humane imunodeficijencije (HIV) (Usman i Blatt 2000; Abera et al. 2012). Osim vakcina zasnovanih na mRNA i DNK, one su klasificirane u lijekove na bazi nukleinske kiseline uvedene 1990. godine i kojima je pridato više pažnje u razvoju vakcina za borbu protiv COVID-19 (Le et al. 2020; Zhang et al. 2020). Glavne prednosti ovih grupa vakcina uključuju njihovu brzu proizvodnju i visoku specifičnost protiv odgovarajućih ciljnih antigena (Le et al. 2020).

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

vakcine zasnovane na mRNA

Početna isporuka mRNA molekula u ćelije domaćina uključivala je transfekciju mRNA u ćelije fibroblasta pomoću kationskog lipida (Park et al. 2021). mRNA vakcine uključuju patogene antigene mRNA koji proizvode antigene proteine ​​od strane ljudskih ćelija. Nekoliko prednosti mRNA vakcina uključuje jednostavan proizvodni proces, efikasan i zaštitni imunitet, zgodnu manipulaciju i industrijalizaciju, te fleksibilnost u odgovoru na varijante COVID-19 (Kaufman et al. 2016; Fang et al. 2022). Neki pristupi, kao što je dodavanje 5'-cap i Kozak sekvenci, primjenjuju se korištenjem 3'-poly-A sekvenci i modifikacije mRNA nukleozida (Borah et al. 2021). mRNA vakcine se prevode u citosol domaćina. Stoga ne postoji rizik od umetanja genoma domaćina, što je poznato kao njihova glavna prednost. U tom smislu, vakcine zasnovane na mRNA nedavno su dobile više pažnje kao siguran preventivni pristup protiv raka i zaraznih bolesti (Kaur i Gupta 2020). Primarni mehanizam djelovanja mRNA vakcina prikazan je na slici 2.

Vakcine zasnovane na DNK

DNK vakcine sadrže nekoliko gena koji kodiraju virusne antigene peptide koji se eksprimiraju plazmidnim vektorima i prenose u ćelije putem elektroporacije (EP). U poređenju sa drugim platformama za vakcine, DNK vakcine predlažu fleksibilnu i brzu platformu za razvoj vakcina, što ih čini fascinantnom tehnologijom za borbu protiv epidemija u razvoju kao što je COVID-19. Štaviše, proizvodnja antigena DNK vakcine dešava se u ciljnim ćelijama, što pomaže u rekapitulaciji prirodne konformacije virusnog antigena i posttranslacionoj modifikaciji. Glavni nedostatak DNK vakcina je njihova ograničena imunogenost. Stoga je važno razmotriti strategije kao što su adjuvans ili upotreba režima primarnog pojačanja koji bi mogao povećati potencijal DNK vakcine. Također, integracija nukleinske kiseline u DNK domaćina je još jedan problem biološke sigurnosti koji rezultira onkogenezom i mutagenezom (Rauch et al. 2018). Iako je prema prethodnim studijama rizik od umetanja DNK vakcine zanemarljiv, SZO i FDA preporučuju implementaciju sigurnosti DNK vakcine radi integracije (Wang et al. 2004; Schalk et al. 2006). DNK vakcine prenose gene koronavirusa u ljudske ćelije. Princip vakcinacije zavisi od isporuke DNK u ćelijsko jezgro tako da počinje transkripcija antigena, a zatim sledi translacija. DNK vakcine obično koriste plazmide kao vektore. Na osnovu načina primjene vakcine, tretiraju se i miociti i keratinociti. Međutim, ćelije koje predstavljaju antigen u blizini mesta ubrizgavanja takođe mogu biti direktno transfektovane korišćenjem DNK vakcina. U takvim slučajevima, proces unakrsnog prajmiranja predstavlja antigene koristeći oba glavna molekula kompleksa histokompatibilnosti (MHC-I/II) (Hobernik i Bros 2018). Generirani antigeni se oslobađaju pomoću apoptotičkih tijela ili egzosoma, što rezultira njihovim prepoznavanjem od strane ćelija koje predstavljaju antigen, što zauzvrat izaziva ćelijske i humoralne imune odgovore. Različite strategije isporuke se koriste za stvaranje snažnog imunološkog odgovora (Donnelly et al. 2005; Li i Petrovsky 2016; Strizova et al. 2021). Što se tiče imunološke regulacije tokom infekcije COVID{14}}, otkriveno je da pacijenti s rizikom od perikardijalnog izljeva sa pogrešnom prognozom ukazuju na povišene CD{16}}CD8+ T ćelije plus smanjeni CD{{ 18}}HLA-DR i T regulatorne (Treg) ćelije (Duerr et al. 2020). Ovi rezultati pokazuju da teška infekcija nastaje zbog neuravnoteženog imunološkog odgovora koji pogoršava stanja bolesti (Tay et al. 2020). Napredak vakcine protiv COVID-19 imao je za cilj razvoj efikasnog i odgovarajućeg imunološkog odgovora (uključujući obje ruke) bez napredovanja do takve neravnoteže (Hobernik i Bros 2018). Dok su klinička ispitivanja DNK vakcina na ljudima izazvala totalne odgovore, ti odgovori su često neadekvatni da potaknu prihvatljive kliničke prednosti. Dodatno, osnovne komponente plazmidne DNK, na primjer, nemetilirane CpG sekvence, mogu uzrokovati aktivaciju urođenih imunih odgovora, povećavajući adaptivne imune odgovore protiv eksprimiranih antigena. Dakle, DNK vakcine su više primjenjive u veterinarskoj medicini (Coban et al. 2013; Silveira et al. 2017; Hobernik i Bros 2018). Zbog ovog nedostatka, neke istraživačke linije se koncentrišu na optimizaciju i isporuku DNK vakcina, uključujući optimizaciju kodona, dizajn promotora, molekularne adjuvante, EP primjenu, vakcinaciju s primarnim pojačanjem ili metode "omike" za napredni dizajn vakcine (Li et al. 2012; Silveira i dr. 2020). Slika 3 ilustruje glavne faze mehanizama DNK vakcine u efektivnim imunološkim odgovorima.

Slika 2 Formulacija mRNA vakcine, administracija i mehanizmi imunološke provokacije: formulacija mRNA sa lipidnom nanočesticom (LNP) održava i poboljšava stabilnost sekvence. b Slani rastvor mRNA-LNP vakcine se daje intramuskularno. c mRNA koja sadrži LNP se transficira u ćelije koje predstavljaju antigen (APC) putem endocitoze. mRNA se oslobađa u citoplazmi i prevodi u virusne proteine, zatim ih proteasom lizira i vezuje za glavni kompleks histokompatibilnosti I (MHC-I) na površini endoplazmatskog retikuluma i predstavlja T citotoksičnim (Tc) stanicama.

Potencijal vakcina zasnovanih na mRNA i DNK

Struktura vakcine na nivou mRNA sadrži elemente za sanaciju stabilnosti i ekspresije proteina uključujući 3′ UTR, kodirajuću sekvencu, 5′UTR, 5′ kapu i poli (A) rep (Liu 2019). 5′ i 3′ UTR elementi koji okružuju kodirajuću sekvencu izvedenu iz virusnih ili eukariotskih gena poboljšavaju strukturnu stabilnost i poboljšavaju translaciju mRNK koji su suštinski faktori za vakcine (Ross i Sullivan 1985; Holtkamp et al. 2006). Za efikasnu translaciju proteina iz mRNA potrebna je 5′ struktura kapice (Martin et al. 1975; Ross i Sullivan 1985). mRNA poli (A) rep takođe ima regulatornu ulogu u stabilnosti i translaciji mRNA (Holtkamp et al. 2006). Također, upotreba kodona ima vitalnu ulogu u translaciji proteina. S tim u vezi, da bi se povećala translacija proteina iz mRNA, rijetki kodoni se zamjenjuju korištenim sinonimnim kodonima koji imaju obilje srodne tRNA u citosolu (Stepinski et al. 2001). Drugi pristup za optimizaciju sekvence je obogaćivanje G:C sadržaja. Nekoliko metoda je razvilo efikasne i sigurne kandidate za DNK vakcine posljednjih godina. U platformi za vakcine baziranu na DNK, plazmidni vektori izvedeni iz bakterija se primjenjuju da eksprimiraju željene antigene unutar stanica domaćina. Bakterijski plazmidi moraju biti uneti u eukariotske ćelije i translocirani u jezgro. DNK se zatim transkribuje i prevodi iz stranih gena u jezgru ćelije domaćina, odnosno u citoplazmi. Stoga je dizajniranje odgovarajućeg plazmida sa visokom efikasnošću transfekcije i ekspresijom proteina od suštinskog značaja za postizanje moćne DNK vakcine (Malone et al. 1989). Sekvenca eukariotske regije (u plazmidima DNK vakcine), uzvodno od umetnutog gena, sastoji se od promotora i poli A signala (polyA) (AAU AAA) koji se nalazi na 3′ krajevima antigenske sekvence (Shan et al. 2011). Promotori su kritični elementi potrebni u plazmidima DNK vakcine da izazovu visoke nivoe ekspresije željenih antigena u ćelijama domaćina (Becker et al. 2008) i rezultiraju transkripcijom mRNA iz umetnutog gena. Promotor koji se najčešće koristi u DNK vakcinama uključuje promotor humanog citomegalovirusa (CMV). Signal poliA sekvence efikasno uzrokuje stabilnost i transfer mRNA i ekspresiju eukariotskog gena. Drugi kritični element je Kozakova sekvenca (ACCATGG) koja ima vitalnu ulogu u translaciji eukariotskog ribosoma. Takođe, dodavanje jedne ili dve sekvence stop-kodona je neophodno da bi se izbegla netačna translacija umetnutog gena u ćeliju domaćina (Becker et al. 2008; Williams 2013). Poređenje platformi za DNK i mRNA vakcine Iako su DNK i mRNA vakcine u razvoju od 1990-ih i nedavnog razvoja i licenciranja različitih veterinarskih DNK vakcina, značajan entuzijazam se okrenuo ka mRNA. I jednima i drugima su potrebni napori da se poboljša njihova antigenost, stabilnost i efikasnost manipulisanjem plazmidnom DNK i mRNA ravnom ili dodavanjem imunomodulatora ili adjuvansa i formulacija i sistema za isporuku (Liu 2019). Trajanje stabilnosti mRNK je kraće nego kod plazmidne DNK. Otkriveno je da DNK vakcine brzo stvaraju kodirani protein, u većim količinama od mRNA vakcina zbog veće unutrašnje stabilnosti plazmidne DNK. Utvrđeno je da plazmidna DNK perzistira u mišićima do 6 mjeseci u neintegriranom načinu (Ledwith et al. 2000). Iako bi DNK i mRNA vakcine trebalo da budu ekspresioni sistem za omiljeni protein, nijedna nije imunološki inertna. Takođe, DNK plazmidi kao i mRNA stimulišu urođeni imunitet (Campbell 2017). Tehnologija vakcine zasnovana na DNK i mRNA možda nije u potpunosti opšta. mRNA je složenija od plazmidne DNK zbog modificiranih nukleozida i formulacija potrebnih za isporuku, stabilnost i potrebu da se kontrolira intrinzična imunostimulirajuća aktivnost mRNA. Ipak, koristi se proizvodnji koja izbjegava potražnju za svakim ćelijskim ili životinjskim proizvodom. Obećanje je da će klinička dostignuća biti izvodljiva nakon što izazovi s plazmidnom DNK i mRNA vakcinom budu riješeni, posebno primjenom naprednih tehnologija za prevenciju i liječenje bolesti (Liu 2019).

Slika 3 Proces ekspresije COVID-19 DNK vakcine u ćelije koje predstavljaju antigen (dendritske ćelije ili DC). Plazmidna DNK ulazi u DC jezgro i eksprimira antigene in vivo (1) Zatim se antigeni predstavljaju T ćelijama (T ćelijski receptori ili TCR) preko i MHC-I i MHC-II molekula. Prezentacija antigena se dešava preko DC CD80/86 molekula i CD8+T ćelija CD28 molekula pored MHC-I-TCR i takođe preko DC CD40 i CD4+T ćelija CD40L pored MHC-II-TCR interakcije (2a, 3 i 4) Aktivacija i proliferacija CD8+T ćelija i oslobađanje citokina dovodi do efikasnih imunoloških odgovora kao što je aktivacija makrofaga (2b) Dodatno, aktivacija CD-a 4+T ćelije nakon vezivanja i efekata citokina iz DC su povezane sa aktivacijom, proliferacijom i izlučivanjem antitijela B ćelija (5)

Napredak u isporuci DNK i mRNA vakcine

Preuzimanje strane DNK i RNK od strane eukariotskih ćelija nije efikasno u poređenju sa virusnim vektorima. Mnogi pristupi fizičkoj isporuci su uspostavljeni kako bi se povećao kapacitet ćelijske apsorpcije (Mellott et al. 2013). Fizičke metode transfekcije gena uključuju sisteme isporuke koji prenose genetski materijal putem mehaničkih postupaka, uključujući EP i projektore (Gulce-Iz i Saglam-Metiner 2019). Biojektorski uređaji koriste CO2 pritisak za transport terapeutika kroz IM (intramuskularno), ID (intradermalno) i SC (subkutano) davanje bez potrebe za iglom (Jorritsma et al. 2016), dajući značajne prednosti u odnosu na konvencionalnu injekciju iglom, uključujući ublažavanje štetni efekti, unakrsna kontaminacija iglom i oštećenja ubodom igle (Zhang et al. 2015). Relevantno, dvije DNK vakcine su procijenjene protiv Zika virusa u fazi I ispitivanja, pokazujući povećane ćelijske odgovore nakon primjene bez igle u usporedbi s upotrebom igle (Gaudinski et al. 2018). Štaviše, platforma za isporuku mRNA vakcine protiv bjesnila pomoću projektora otkrila je pojačane odgovore antitijela (Alberer et al. 2017). Povećana efikasnost vakcine putem mlazne injekcije može se pripisati široj distribuciji vakcina, što dovodi do većeg preuzimanja pomoću APC (Williams et al. 2000; Alberer et al. 2017). Trenutno se ID ili IM injekcije praćene EP obično koriste za isporuku DNK vakcine u kliničkim studijama (Sardesai i Weiner 2011). EP uključuje stvaranje pora unutar ćelija kože kako bi se povećalo ćelijsko preuzimanje genetskog materijala pomoću električnih impulsa (Pushparajah et al. 2021). Metoda IM EP primarno je primijenjena 1998. (Aihara 1998.) kako bi se poboljšala propusnost mišićnih ćelija za isporuku DNK vakcina (Rizzuto et al. 1999; Dupuis et al. 2000; Sokołowska i Błachnio-Zabielska 2019). Brojni izvještaji su otkrili bolju ekspresiju antigena i povećane antigen-specifične imune odgovore in vivo koristeći EP (Yan et al. 2008; Yan et al. 2009). Prijavljeno je da je vakcina protiv HIV DNK, ADVAX, povećala imunogenost nakon transfera kroz EP (Vasan et al. 2011), u poređenju sa IM administracijom (Vasan et al. 2010). Ipak, EP pristup pati od rizika od smrti ćelije zbog korištenja visokih napona (Gulce-Iz i Saglam-Metiner 2019). Novi pristupi isporuke, kao što je EP, još su pod istragom za isporuku RNK vakcine.

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

Efikasnost EP za samopojačavajuću isporuku vakcine bila je slična onoj za vakcine sa plazmidnom DNK u smislu ekspresije gena i imunoloških odgovora kod miševa (Cu et al. 2013). Međutim, EP nije poboljšao efikasnost isporuke tradicionalnih nereplicirajućih RNK ​​vakcina (Johansson et al. 2012), što je vjerovatno smanjilo njenu efikasnost u dupliciranju RNK vektora. Shodno tome, EP i bio injektori su korisni za parenteralno ubrizgavanje COVID-19 DNK/RNA vakcina. Ovi pristupi doprinose većoj proizvodnji i isporuci kandidata za DNK vakcinu i značajno poboljšavaju rezultate (Pushparajah et al. 2021).

Prednosti i ograničenja vakcina na bazi nukleinske kiseline

Kao nove i obećavajuće metode imunizacije, vakcine zasnovane na nukleinskim kiselinama pružaju uvid u razvoj sigurne i zaštitne vakcinacije (Choi i Chang 2013.) što su pokazali milioni ljudi tokom pandemije COVID{2}}. Vakcine na bazi nukleinske kiseline imaju kratke razvojne cikluse, što omogućava brzu distribuciju tokom pandemije. Za korištenje rekombinantnih DNK vakcina potreban je efikasan transfer DNK vektora u jezgro, transkripcija, a zatim translacija u željeni antigen (Leitner et al. 1999). Zbog zgodne manipulacije i jeftine proizvodnje, gola plazmidna DNK je fascinantan vektor za predstavljanje antigena (Williams 2013). Obično, plazmidna DNK sadrži osnovne genetske elemente, uključujući gen koji kodira antigen, promotor, pojačivače i sekvence terminacije/poliadenilacije transkripcije (Vogel i Sarver 1995). Plazmidna DNK platforma je obećavajuća bio-farmaceutska konstrukcija koja se replicira u visokim nivoima unutar jeftinih prokariotskih ćelija, iako zahtijeva pročišćavanje (Prazeres et al. 1999; Ferreira et al. 2000; Suschak et al. 2017). RNK vakcine se sastoje od mRNA molekula koji sadrže antigen RNK okružen 3′, poli-A repom i 5′ krajevima i nemaju potrebu za transkripcijom. (Zhang et al. 2019). Nekoliko RNK vakcina prolazi kroz samo-amplifikaciju, poznatu kao nova tehnologija u razvoju. Shodno tome, molekula RNK se može replicirati i prevesti u domaćinu nakon isporuke, uprkos mogućnosti gole nestabilnosti RNK, čime se povećava ekspresija imunogenih peptida (Pardi et al. 2018; Zhang et al. 2019; Wadhwa et al. 2020) . mRNA se razgrađuje sveprisutnim enzimima ribonukleaze (Wadhwa et al. 2020; Xu et al. 2020). Dodavanje 3′ poli-A repa i 5′–7- metilguanozinske kapice je kritično za povećanje stabilnosti i translacije mRNA u citosolu (Gallie 1991; Schlake et al. 2012). Strategije za povećanje unosa i ekspresije vakcine su uglavnom procenjene za DNK vakcine nego za RNK vakcine, jer DNK zahteva prelazak dve ćelijske membrane da bi stigla do jezgra. Nasuprot tome, RNK prodire u citoplazmu kroz jednu membranu (Rauch et al. 2018). Struktura DNK ima uporedivo veću stabilnost. Tokom 7 godina, otkriveno je da je plazmidna DNK ostala netaknuta bez razlike sa novo dobijenom DNK na -20 stepeni (Walther et al. 2013; Pushparajah et al. 2021). Nizak pH i temperatura su kritični za održavanje integriteta DNK dugo vremena. Suprotno tome, RNK je izuzetno osetljiva na temperaturu i mora se držati na -70 stepeni u medijumu bez enzima da bi se produžio njen poluživot (Jones et al. 2007).

Izazovi u razvoju vakcina na bazi nukleinskih kiselina

Dobro je poznato da vakcine protiv COVID-19 moraju biti dovoljno efikasne i zaštitne (Graham 2020) i da izazivaju dugotrajan imunitet. Međutim, godišnja vakcinacija može biti moguća na osnovu godišnjih iskustava sa vakcinama protiv gripa (Randolph i Barreiro 2020; van Riel i de Wit 2020). Razvoj COVID-19 vakcine predstavlja izazove čak i sa novim platformama. Uprkos visokoj imunogenosti i zaštiti vakcine protiv virusa korona, pojava mutacija izaziva zabrinutost i ponovno pojavljivanje virusa. Stoga je prognoza vremena i lokacije nastanka bolesti, zajedno sa tačnim usvajanjem sekvence ciljnog proteina, prva faza razvojnog procesa koji zahtijeva odgovarajuću provedbu kliničkih ispitivanja (Lurie et al. 2020). Glavni izazov DNK vakcina je izazivanje relativno nižih imunoloških odgovora kod ljudi i velikih životinja nego kod sistema malih životinja (Grunwald i Ulbert 2015; Suschak et al. 2017). Primjetno je da ostaje da se pozabave dodatnim izazovima u vezi s vakcinama protiv COVID-19, kao što su trajnost zaštite, efikasnost u određenim podgrupama, sprječavanje prijenosa virusa i javno prihvaćenost (Pushparajah et al. 2021). Odgođena ekspresija antigena u samopojačavajućim mRNA vakcinama može ograničiti efikasnost ovih vakcina. Međutim, ova platforma daje veće prinose i na taj način pruža ekvivalentnu zaštitu pri znatno nižim dozama (Vogel et al. 2018; Strizova et al. 2021).

Nedavni napredak u DNK i mRNA vakcinama COVID-19

U razvoju vakcine protiv COVID{{0}}, brojne studije su se fokusirale na platforme mRNA vakcine (Verbeke et al. 2021) što je dovelo do odobrenja nekoliko vakcina (Vitiello i Ferrara 2{{ 94}}21) poput onih kompanija Moderna i Pfizer/BioNtech. Moderna vakcina uključuje cjelokupno kodiranje mRNK glikoproteina COVID-19, dok Pfizer/BioNtech sadrži RBD mRNA sekvencu (Brüssow 2020). Nivoi efikasnosti vakcina Pfizer/BioNTech i Moderna uključuju 95% odnosno 94,5% (Rauch et al. 2021; Widge et al. 2021). Temperatura skladištenja vakcine Moderna je između -25 stepeni i -15 stepeni, dok je Pfzer vakcina između -80 stepeni i -60 stepeni (Meo et al. 2021; Rauch et al. 2021). U poređenju sa vakcinom Moderna, vakcina Pfizer/BioNTech ima niže troškove i nuspojave (Rauch et al. 2021). Još jednu mRNA vakcinu protiv COVID-19 razvili su kineski istraživači i koristila je termostabilnu (najmanje jednu sedmicu na 25 stepeni) mRNA koja kodira RBD (Brüssow 2020). U drugom istraživanju, CureVac je korišten kao projektirana platforma mRNA S proteina pune dužine za razvoj vakcine protiv COVID-19 sa zamjenama u dva ostatka prolina kako bi se poboljšala stabilnost proteina (Rauch et al. 2021). Ruklanthi de Alwis et al. (2021) razvili su samotranskribirajuću i replicirajuću mRNA vakcinu za COVID-19 koristeći S protein pune dužine i replikon (de Alwis et al. 2021) s potencijalom primjene kao efikasne i sigurne jednodozne vakcine za borbu protiv COVID- 19 (de Alwis et al. 2021). Slično, korišćena je samo-amplifikujuća RNK koja kodira protein COVID-19 S inkapsuliran unutar lipidnih nanočestica (LNP) i pokazao visoke titre antitijela i ćelijskih imunih odgovora (McKay et al. 2020). Neki kandidati za DNK vakcine kao što su vakcine zasnovane na S, N i M proteinima razvijene su za SARS-CoV. Među njima, DNK vakcina zasnovana na S proteinu efikasno je izazvala zaštitni efekat protiv COVID-19 infekcije, verovatno zahvaljujući vitalnoj ulozi S proteina u vezivanju receptora (Zhao et al. 2020). INO-4800 je kandidat za vakcinu protiv COVID-19 DNK koji kodira protein COVID-19 S (Sarwar et al. 2020; Smith et al. 2020). Pretklinički rezultati na miševima i zamorcima pokazali su humoralni i ćelijski imuni odgovor. U fazi I kliničkih studija, dvije doze INO-4800 su ubrizgane putem ID puta, dopunjene EP preko CELLECTRA®2000 Inovio Pharmaceutical (Diehl et al. 2013; Amante et al. 2015). Potpuni imuni odgovor objašnjen je na osnovu antitijela i ćelijskih odgovora kod 34 od 36 učesnika u njihovoj fazi I kliničkog ispitivanja. Deset prijavljenih nuspojava (AE) je uočeno bez ikakvih ozbiljnih nuspojava (SAE) (faza). Pokrenuto je kliničko ispitivanje faze I/II kako bi se ocijenila imunogenost, sigurnost i podnošljivost INO- 4800 (Tebas et al. 2019). INO-4800 ima slične uslove skladištenja (Smith et al. 2020), nadajući se jednostavnijoj distribuciji vakcine. Osim toga, neke druge grupe DNK vakcina protiv COVID{56}} pokrenule su ispitivanja. U junu 2020., kliničko ispitivanje faze I i IIa za GX-19 pokrenulo je zapošljavanje. DNK vakcina, AG0301-COVID-19, proizvedena zajedničkim pokušajima Univerziteta Osaka (Japan), Takaro Bio i AnGes, pokrenula je regrutaciju za klinička ispitivanja faze I i II u julu 2020. za procjenu njegovu imunogenost i sigurnost (Speiser i Bachmann 2020). Provedena su klinička ispitivanja faze I i II za procjenu imunogenosti i sigurnosti tri doze ZyCoV-D (Kumar et al. 2021). Ova oralna vakcina je kodirala šiljasti protein u plazmidnoj DNK, dinamički pojačan u živoj Bifidobacterium longum, dobro poznatoj crijevnoj probiotičkoj bakteriji. Pokrenuto je još jedno kliničko ispitivanje faze I za procjenu CORVax12, DNK vakcine koja kodira protein šiljaka. Ispitivana je efikasnost elektroporiranog CORVax12 samog ili u kombinaciji sa drugim plazmidom koji kodira interleukin 12 (IL-12). Razne COVID-19 mRNA vakcine su u razvoju i dale su obećavajuće rezultate (Leitner et al. 1999; Croyle et al. 2001). Različiti pristup razvoju RQ3013-VLP (kodirajući S, E i M proteine) bio je efikasan in vivo koristeći koktel mRNA. Ova mRNA vakcina je integrisana sa promenjenim nukleozidima, a zatim spakovana u LNP i otkrila sposobnost izazivanja jakih ćelijskih i humoralnih imunih odgovora kod miševa (Le et al. 2020; Lu et al. 2020a). Konstruisana DNK vakcina sa domenom arginil-glicil-asparaginske kiseline (RGD) u dve doze od 60 µg upotrebom elektroporacije poboljšala je efekte kod BALB/cJ miševa (Guo et al. 2021). IM +jet injekcija DNK vakcine u jednoj dozi (0,2 mg) mogla bi imunizirati sirijske hrčke (Brocato et al. 2021). Druga DNK vakcina koja koristi S protein podvrgnuta u tri doze zaštitila je Rhesus makakije (Yadav et al. 2021). Fuzija RBD-a na preS1 amino-terminal virusa hepatitisa B i IM injekcija za tri doze (0, 2 i 4 sedmice) kod C57BL/6 miševa izazvala je humoralne i ćelijske imune odgovore (Jeong et al. 2021). Dodatno, IM injekcija plazmidne DNK S proteina i S1 podjedinice (rekombinantnog proteina) u tri doze u sedmicama 0, 2 i 8 kod Rhesus makaka stimulirala je neutralizirajuća antitijela (Prompetchara et al. 2021). IM+EP injekcija S proteina u tri doze (sedmice 0, 2 i 4) kod ICR miševa stimulisala je humoralne i ćelijske odgovore (Li et al. 2021). Druge DNK vakcine u kliničkim ispitivanjima uključivale su S protein u fazama I/II u junu 2022. (NCT04445389, IM put kod odraslih u dobi od 18-50 godina), jula 2021. (NCT04463472, IM put kod odraslih u dobi od 20-60 godina), Septembar 2021. (NCT04527081, IM ruta kod odraslih od 20 do 65 godina) i faza I (NCT04336410, ID ruta za 18 godina i više), februar 2022. (NCT04334980, oralni kod odraslih od 18 i više godina) i juni 2021. NCT04591184, IM put kod odraslih 18–84 godine). Osim toga, mRNA vakcine u kliničkim ispitivanjima uključivale su one u fazi II u novembru 2021. (NCT04515147, IM, 18-60 godina), fazi II-III u decembru 2022. (NCT04368728, IM kod odraslih 18-85 godina) i faze I juna 2021. (NCT04566276, IM kod odraslih 18-75 godina). COVID-eVax je bila vakcina bazirana na RBD koja je izazvala dovoljan imuni odgovor kod miševa, tvorova i pacova nakon 38 dana (Conforti et al. 2022). Dvije (X{141}} i GX{142}}N) DNK vakcine koje kodiraju šik i nukleokapsid proteine ​​procijenjene su u ispitivanjima faze I među odraslim osobama u dobi od 19-49 godina, a vezujuća antitijela su bila detektirana pri drugoj dozi vakcinacije. Potvrđene su sigurnost i podnošljivost ovih vakcina, gdje je GX-19N inducirao više razine T ćelija i odgovora antitijela (Ahn et al. 2022). Xcl{147}}SARS-CoV-2 spike fuziona DNK vakcina izazvala je veću stopu odgovora posredovanih antitijelima i T ćelijama u poređenju sa spike genom koji sadrži plazmid pojedinačno in vitro i in vivo (Qi et al. 2022). Nedavna bakulovirusna COVID{153}} Delta DNK vakcina mogla bi zaštititi 100% miševa od COVID-19 (Jang et al. 2023). Linearna DNK (linDNA) koja kodira SARS-CoV-2 RBD (Lin-COVIDeVax) bila je u stanju da izazove odgovore antitijela i T ćelija i pruži sigurnost i nije imala štetnih efekata (Conforti et al. 2023). Tabela 1 predstavlja klinička ispitivanja i odobrene vakcine na bazi nukleinske kiseline protiv COVID-19. Prema ažuriranim podacima, 229.820.324 osobe primilo je vakcinu protiv COVID-19 širom svijeta, među kojima su oni iz afričkih zemalja imali nižu stopu vakcinacije (https://www.usnews.com/news/coronavirus-and -vaccine-news, https://www.bloomberg.com/graph ics/covid-vaccine-tracker-global-distribution/). Shodno tome, stopa vakcinacije je povezana sa ekonomskim uslovima u različitim regionima/područjima.

Potencijalni sigurnosni problemi za vakcine protiv COVID‑19

Praćenje sigurnosti svake razvijene preventivne ili profilaktičke vakcine jedan je od bitnih aspekata. Upotreba toksičnih hemikalija ili ćelijske kulture nije potrebna u procesima proizvodnje mRNA vakcine, tako poznata kao sigurna platforma. Kratko vrijeme proizvodnje također smanjuje rizik od kontaminacije mikroorganizmima (Wang et al. 2020). Najčešće prijavljeni efekti uključuju glavobolju, umor i druge sistemske teške događaje, kao što su groznica, drhtavica, mijalgija, povraćanje, bol u abdomenu i rijetki izvještaji o dijareji. Međutim, nije uočena smrt kod primalaca mRNA vakcine (Chapin-Bardales et al. 2021; Skowronski i De Serres 2021). Neke sistemske nuspojave, kao što je anafilaksija, obično se prijavljuju kod osoba sa istorijom alergije i procjenjuju se na 2,5–11,1 slučaja na milion doza (Shimabukuro et al. 2021). Snažan imuni odgovor kod ljudi mlađih od drugih može dovesti do visokih sistemskih događaja i više nuspojava je prijavljeno nakon injekcije druge doze vakcine u odnosu na prvu dozu (Male 2021; Skowronski i De Serres 2021). Osim toga, bol na mjestu injekcije, crvenilo i oteklina su prijavljeni kao najlokalniji neželjeni efekti (Anand i Stahel 2021). Na osnovu dovoljnih dokaza odobrenih mRNA vakcina uključujući Pfizer/BioNTech i Modernu, nije dokazan rizik od pobačaja u trudnoći (stopa=0%) (Muškarac 2021.). Primetno je da su DNK vakcine dovoljno bezbedne, ali nisu uvek imunogene; stoga su za dovoljan imunološki odgovor potrebne dodatne doze. Humoralni imunološki odgovor nije bio dosljedan u ispitivanjima na ljudima, dok se čini da je ćelijski imunitet češći. Shodno tome, sigurnost DNK vakcina među starijom i mlađom populacijom je povoljnija (Ledgerwood et al. 2011; Houser et al. 2018; Carter et al. 2019). Sigurnosni problemi upućuju na moguću integraciju transficirane DNK u zametnu liniju i somatske ćelije domaćina. U ovim slučajevima, moguće je da dođe do disregulacije ekspresije gena zajedno sa višestrukim značajnim mutacijama. Ipak, samo ekstrahromozomski i deficitarni hromozomski integracijski plazmidi se obično koriste u razvoju DNK vakcine. Osim toga, većina plazmida ostaje na mjestu primjene (Schalk et al. 2006). Nedavni sistematski pregled i meta-analiza su pokazali da su mRNA vakcine povezane sa većim štetnim događajima u poređenju sa drugim platformama (Kouhpayeh i Ansari 2022). Nedavno je uočen rijedak slučaj miozitisa uzrokovanog BNT162b2 mRNA vakcinom kod jedne 34-godišnje žene (Magen et al. 2022). Metilacija DNK i odgovarajuće epigenetske promjene također remete efikasnost DNK i mRNA vakcina (Pang et al. 2022). Primjetno, nekoliko odobrenih vakcina nukleinske kiseline (ZyCoV-D, DNK plazmidna vakcina korištena intradermalno, Indija), BNT162b2 (mRNA, 2 doze, Njemačka), mRNA- 1273 (Moderna, SAD, 2 doze), ARCOV (WALVAX, Kina) i klinička ispitivanja uključujući 302-COVID19 (DNK plazmidna vakcina, faza II/III intramuskularno, Japan), INO-4800 (DNK plazmid, faza II/III, intradermalno, Kina), GX{{36 }}N (DNK vakcina, Genexine, faza II/III), Covigenix VAX-001 (DNK vakcina, Entos Pharmaceuticals, faza I/II, intramuskularno), COVID-eVax (DNK vakcina, faza I/II, intramuskularno , Rim) i bacTRL-Spike (DNK vakcina, faza I, oralno, Symvivo) su razvijeni (Sheridan 2021; Liu i Ye 2022a). Ove vakcine su stimulirale i humoralni i ćelijski imunitet osim za GX-19N i AG0302- COVID-19. Neki štetni efekti vakcina na bazi nukleinske kiseline COVID-19 uključuju bol, limfadenopatiju, eritem, crvenilo, oticanje, mučninu, umor, artralgiju, mijalgiju, groznicu, kardiorespiratorni zastoj, moždani udar, reakciju preosjetljivosti, alkoholnu bolest jetre, Bellovu bolest , paroksizmalna ventrikularna aritmija i smrt (Norquist et al. 2012; McNeil i DeStefano 2018; Baden et al. 2021; Momin et al. 2021; Liu i Ye 2022b, 2022a).

Feniletanol glikozid je glavna aktivna komponenta Cistanche deserticola

Zaključak

Brza pandemija COVID-19 stvorila je nezadovoljenu potrebu za razvojem efikasnih vakcina za prevenciju bolesti. Iako je imunogenost DNK vakcina na životinjama prihvatljiva, klinička validacija je opravdana kod ljudi. RNK vakcine mogu pružiti odgovarajuće imunološke karakteristike i značajne prednosti u odnosu na DNK vakcine. Problemi s nestabilnom prirodom RNK su riješeni korištenjem odgovarajućih pristupa skladištenju i formulacija kako bi se zaustavila njena degradacija. Sigurnost vakcine je također važna i ne može se ugroziti radi veće efikasnosti. Postoje odobrene vakcine na bazi nukleinske kiseline za kontrolu širenja COVID-19. Praćenje učesnika se mora nastaviti. Postoji potreba za učenjem o nuspojavama vakcine COVID-19 na bazi nukleinske kiseline. Štoviše, ponovna procjena cjepiva i razvoj polivalentnih cjepiva, ili strategije za pan-koronavirus, obećavaju s obzirom na ponovno pojavljivanje novih varijanti zabrinutosti.

Tabela 1 Klinička ispitivanja i odobrene vakcine protiv COVID-19 i njihove karakteristike

Reference

Abdelmageed MI i saradnici (2020) Dizajn peptidne vakcine zasnovane na više epitopa protiv E proteina humanog COVID-19: pristup imuno informatike. Int J Biomed Clin Anal. https://doi.org/ 10.1155/2020/2683286

Abera G, Berhanu G, Tekewe A (2012) Ribozimi: enzimi nukleinske kiseline s potencijalnom farmaceutskom primjenom: pregled. Pharmacophore 3:164–178

Ahn JY et al (2022) Sigurnost i imunogenost dvije rekombinantne DNK COVID-19 vakcine koje sadrže kodirajuće regije proteina šiljka ili šiljaka i nukleokapsida: privremena analiza dva otvorena, nerandomizirana, faza 1 ispitivanja kod zdravih odraslih osoba. Lancet Microbe 3:e173–e183. https://doi.org/10.1016/ S2666-5247(21)00358-X

Aihara H (1998) Miyazaki J. prijenos gena u mišiće elektroporacijom in vivo. Nat Biotechnol 16:867–870. https://doi.org/10. 1038/nbt0998-867

Alberer M et al (2017) Sigurnost i imunogenost mRNA vakcine protiv bjesnoće kod zdravih odraslih osoba: otvoreno, nerandomizirano, prospektivno, prvo kliničko ispitivanje prve faze na ljudima. The Lancet 390:1511–1520.https://doi.org/10.1016/s0140-6736(17)31665-3

Amante DH et al (2015) Obrasci transfekcije kože i kinetika ekspresije isporuke plazmida poboljšane elektroporacijom pomoću CELLECTRA-3P, prijenosnog uređaja za dermalnu elektroporaciju sljedeće generacije. Metode humane genske terapije 26:134–146. https:// doi.org/10.1089/hgtb.2015.020

Anand P, Stahel VP (2021.) Pregled sigurnosti vakcina mRNA Covid-19: pregled. Pacijent Saf Surg 15:20. https://doi.org/10.1186/ s13037-021-00291-9

Baden LR i saradnici (2021) Efikasnost i sigurnost mRNA-1273 SARS CoV-2 vakcine. N Engl J Med 384:403–416. https://doi.org/10. 1056/NEJMoa2035389

Becker PD, Noerder M, Guzmán CA (2008) Genetska imunizacija: bakterije kao sredstva za isporuku DNK vakcine. Humska vakcina 4:189–202.https://doi.org/10.4161/hv.4.3.6314

Borah P et al (2021) Perspektive o kandidatima za RNA vakcine za COVID-19. Front Mol Biosci. https://doi.org/10.3389/fmolb. 2021.635245

Brocato RL et al (2021) Zaštitna efikasnost SARS-CoV-2 DNK vakcine kod sirijskih hrčaka divljeg tipa i imunosupresivnih. Npj Vaccines 6:1–7.https://doi.org/10.1038/s41541-020-00279-z

Brüssow H (2020) Napori ka vakcini protiv COVID-19. Environ Microbiol 22:4071–4084. https://doi.org/10.1111/1462-2920. 15225

Buchholz UJ et al (2004) Doprinos strukturnih proteina koronavirusa teškog akutnog respiratornog sindroma zaštitnom imunitetu. Proc Natl Acad Sci 101:9804–9809. https://doi.org/ 10.1073/pnas.0403492101

Campbell JD (2017) Razvoj CpG adjuvansa 1018: studija slučaja. Vaccine Adjuv. https://doi.org/10.1007/ 978-1-4939-6445-1-2

Carter C i saradnici (2019) Sigurnost i imunogenost ispitivane sezonske vakcine protiv hemaglutinina infuence DNK praćene trovalentnom inaktiviranom vakcinom koja se primjenjuje intradermalno ili intramuskularno kod zdravih odraslih osoba: otvoreno randomizirano kliničko ispitivanje faze 1. PLoS One 14:e0222178. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0222178

Chapin-Bardales J, Gee J, Myers T (2021) Reaktogenost nakon prijema vakcina COVID-19 zasnovanih na mRNA. JAMA. https://doi. org/10.1001/jama.2021.5374

Chen Y, Cheng L, Lian R, Song Z, Tian J (2021) Istraživanje COVID-19 vakcine fokusira se na sigurnost, efikasnost, imunoinformatiku i proizvodnju i isporuku vakcina: bibliometrijska analiza zasnovana na VOSvieweru. Biosci Trends. https://doi.org/10.5582/bst.2021. 01061

Choi Y, Chang J (2013) Virusni vektori za primjenu vakcina. Clin Exp Vaccine Res 2:97.https://doi.org/10.7774/cevr.2013.2.2.97

Chowdhury MA, Hossain N, Kashem MA, Shahid MA, Alam A (2020.) Imuni odgovor na COVID-19: Pregled. J Infect Public Health. https://doi.org/10.1016/j.jiph.2020.07.001

Coban C, Kobiyama K, Jounai N, Tozuka M, Ishii KJ (2013) DNK vakcine: jednostavna materija koja otkriva DNK? Hum Vaccin Immunother 9:2216–2221.https://doi.org/10.4161/hv.25893

Conforti A et al (2022) COVID-eVax, kandidat za elektroporisanu DNK vakcinu koja kodira SARS-CoV-2 RBD, izaziva zaštitne odgovore kod životinjskih modela. Mol Ther 30:311–326. https://doi. org/10.1016/j.ymthe.2021.09.011

Conforti A, Sanchez E, Salvatori E, Lione L, Compagnone M, Pinto E et al (2023) Kandidat za linearnu DNK vakcinu koji kodira domen koji vezuje SARS CoV{1}} receptor izaziva snažan imunološki odgovor i neutralizirajuća antitijela kod domaćih mačaka. Mol Ther-Metho Clinic Dev 28:238–248. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2022. 12.015

Croyle M, Cheng X, Wilson J (2001) Razvoj formulacija koje poboljšavaju fizičku stabilnost virusnih vektora za gensku terapiju. Gene Ther 8:1281–1290.https://doi.org/10.1038/sj.gt.3301527

Cu Y i saradnici (2013) Poboljšana isporuka i potentnost vakcina mRNA koje se samo-amplifikuju elektroporacijom in situ. Vaccines 1:367–383. https://doi.org/10.3390/vaccines1030367