Nikotin pogoršava oštećenje bubrega uzrokovano takrolimusom programiranom smrću stanica
Mar 23, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yu Ji Jiang, Sheng Cui, Kang Luo, Jun Ding
UVOD
Uprkos otkriću novih imunosupresiva, takrolimus (TAC) ostaje kamen temeljac imunosupresivnih režima u transplantaciji solidnih organa. Međutim, dugotrajna upotreba TAC-a povećava rizik od neželjenih efekata (npr. nefrotoksičnost, neurotoksičnost, infekcije, maligni tumori, dijabetes i gastrointestinalne tegobe) [1]. Među njima, akutnibubregpovredaili hronična TAC nefrotoksičnost je prijavljena kod 46 procenata pacijenata sa transplantacijom pluća [2] i 22,4 procenata pacijenata sa transplantacijom bubrega [3]. Dok je akutnabubregpovredasmatra se reverzibilnom nakon smanjenja doze TAC-a ili potpunog povlačenja, kronična nefrotoksičnost, koja dovodi do gubitka alografta, je ireverzibilna. Kroničnu TAC nefrotoksičnost karakteriziraju glomerulopatija, hialinoza aferentnih arteriola i prugasta tubulointersticijska fibroza (TIF) [4]. Iako tačan mehanizam ove kliničke dileme ostaje nepoznat, nedavno smo pokazali da upala uzrokovana oksidativnim stresom, transformirajući faktor rasta 1 (TGF- 1) i programirana ćelijska smrt mogu biti važni igrači [5]. Pušenje cigareta je kritičan izazov za javno zdravlje i društveni finansijski teret koji smanjuje kvalitetu života. Epidemiološki izvještaji pokazuju da trenutno u svijetu postoji više od milijardu pušača cigareta i šest miliona smrtnih slučajeva godišnje zbog upotrebe duhana. Ove stope rastu, posebno u zemljama u razvoju ili nerazvijenim [6]. Dobro je poznato da je pušenje faktor rizika za razne vrste raka, kardiovaskularne događaje (infarkt miokarda i moždani udar) i opstruktivne bolesti pluća. U bubrezima, pušenje povećava težinu bubrežne disfunkcije kod pacijenata sa dijabetesom, hipertenzijom, policističnimbubregbolesti nakon transplantacije bubrega [7]. Štaviše, pušenje može uzrokovati de novo oštećenje bubrega čak i kod zdrave populacije bez postojeće kronične bolesti bubrega (CKD) [8]. Ova studija je imala za cilj da proceni: (1) da linikotin(NIC), primarna toksična komponenta pušenja cigareta, pogoršava oštećenje bubrega uzrokovano TAC-om; i, ako je tako, (2) koji mehanizam je odgovoran za NIC(nikotin)-ubrzana nefrotoksičnost.
cistanches herba može ublažiti funkciju bubrega
REZULTATI
Efekat NIC-a(nikotin)na osnovnim parametrima
Tabela 1 prikazuje efekte NIC-a(nikotin)o osnovnim parametrima u eksperimentalnim grupama. Oba NIC(nikotin)i TACincrease UV (poliurija), koji je dodatno povećan NIC(nikotin)i TAC tretman. Niti NIC(nikotin)ni TAC nije spriječio gubitak BW. Izlučivanje proteina u urinu, Scr, BUN i Cys-C bili su značajno veći u oba NIC(nikotin)i TAC grupe u poređenju sa VH grupom; ovi nivoi su se dodatno povećali kombinacijom ova dva lijeka, što implicira da je NIC(nikotin)ubrzava TAC-induciranu disfunkciju bubrega. Nije bilo značajnih razlika u SBP-u između grupa. Četveronedeljni tretman TAC-om povećao je koncentraciju TAC-a u krvi na 11.0±og ng/mL, dok je NIC(nikotin) did not influence blood TAC concentration(12.8±15 ng/mL,p>o.o5 naspram TAC). Osim toga, liječenje normalnih pacova NIC-om(nikotin)rezultiralo je povećanjem koncentracije kotinina u serumu i urinu za 56,5±17 ng/mL i 8;6±192,6 ug/dan, respektivno. Ove koncentracije kotinina u serumu i urinu oponašaju one uočene kod ljudi koji su aktivni pušači [13].
Tabela 1. Učinak NIC-a(nikotin)na funkcionalne parametre
Efekat NIC-a(nikotin)o histopatologiji kod kronične TAC nefrotoksičnosti
Kroničnu TAC nefrotoksičnost karakteriziraju jedinstvene histološke karakteristike uključujući prugasti TIF i glomerulopatiju. Histološkim bojenjem i elektronskom mikroskopijom, otkrili smo da se glomerularna ozljeda uzrokovana TAC-om manifestira zadebljanjem glomerularne baze i brisanjem procesa stopala podocita (sl. IA, IC i D), što može biti povezano s povećanjem izlučivanja proteina u urinu. Na kvantitativnim analizama, oba NIC(nikotin)i TAC su povećali frakcijsku mezangijalnu površinu, uz dalje povećanje uočeno u NIC-u(nikotin)i TAC grupa. Glavne promjene u kroničnoj TAC nefrotoksičnosti bile su ograničene na tubulointersticijska područja, kao što je ocrtano tubulointersticijskim fibroznim taloženjem, tubularnom atrofijom i prugastom fibrozom (sl. 1B, 1E i F). Brojke jasno pokazuju da je TIF rezultat u NIC-u(nikotin)plus TACgrupa je bila viša nego u oba NIC-a(nikotin)grupa ili TAC grupa.
Slika 1. Reprezentativne fotomikrografije periodične kiseline-Schiff (PAS)(A), Masson trihrom (B), transmisiona elektronska mikroskopija (CF) i kvantitativna analiza glomerularne ozljede i tubulointersticijske fibroze (TIF); (C) zadebljanje bazalne membrane glomerula (strelice); (D) brisanje stopala podocita procesi (strelice); (E) oticanje tubulointersticijuma i ekstenzivno taloženje kolagena (raspršene); (F) atrofirani tubuli (strelice). VH, nosač; NIC(nikotin), nikotin; TAC, takrolimus. str
Efekat NIC-a(nikotin)na profibrotičku ekspresiju citokina kod kronične TAC nefrotoksičnosti
Ova studija je nastojala da uporedi ekspresiju profibrotičnog citokina TGF- 1 i CTGF, i komponente ekstracelularnog matriksa (ECM) ig-h; između eksperimentalnih grupa. U skladu sa nalazima TIF-a, NIC(nikotin)povećana prekomjerna ekspresija profibroznog TGF- 1 i CTGF i ECM ig-h3 izazvana TAC (slika 2)
Slika 2. Reprezentativne mikrofotografije imunobloting analizeza (A) transformirajući faktor rasta 1 (TGF-B1), (B TGF- -induciran gen-h( ig-h3) i (C) faktor rasta vezivnog tkiva (CTGF). Vrijednosti za ekspresiju proteina su predstavljene koristeći grupu nosača (VH) kao referencu od 100 posto i normaliziranu na -aktin(nikotin), nikotin;TAC, takrolimus. 3p
Efekat NIC-a(nikotin)na upalu kod kronične TAC nefrotoksičnosti
Da bismo definirali učinak NIC-a na upalu kod ozljede bubrega izazvane TAC-om, proučavali smo ekspresiju proinflamatornih medijatora i gena povezanih s piroptozom imunoblotingom i imunohistohemijom. Slika 3 pokazuje da TAC tretman povećava ekspresiju citokina povezanih s piroptozom (ⅡL-1, IL-18 i NLRP3) i MCP-1, što je rezultiralo ED-1-pozitivnim ćelijska infiltracija, a daljnji porast je pronađen kombinovanim tretmanom NIC-a(nikotin)i TAC.
Slika 3. Reprezentativne fotomikrografije imunohistohemije za ektodermalnu displaziju-1 (ED-1)(A) i imunoblot analiza za proinflamatorne citokine (B). VH, vozilo; NIC(nikotin), nikotin; TAC, takrolimus; MCP-1, monocitni hemotaktički protein-1;IL, interleukin; NLRP3, protein koji sadrži pirinski domen receptora sličan NOD3. str
Efekat NIC-a(nikotin)o oksidativnom stresu kod kronične TAC nefrotoksičnosti
Kao što je prikazano na slici 4, hronična(nikotin)TAC tretman je usko povezan s neravnotežom između oksidativnih i antioksidativnih enzima [12,14. Imunobloting analiza je pokazala da je NIC pojačano regulirao TAC-indukovanu ekspresiju NOX-2 i NOX-4, ali je potisnuo ekspresiju SOD1 i SOD2. Pored toga, nivoi 8-OHdG u serumu i urinu, markera oksidativnog stresa, bili su viši u NIC i TAC grupama u poređenju sa VH grupom i najviši u NIC plus TAC grupi. Ovi nalazi impliciraju sinergistički učinak NIC-a i TAC-a na oksidativni stres u ovom modelu.
Slika 4. Reprezentativne fotomikrografije imunoblot analize serije proteina povezanih sa oksidativnim stresom (A) i seruma (B) i urina (C)Koncentracije 8-hidroksi-2'-deoksiguanozina (8-OHdG). VH, vozilo; NIC(nikotin), nikotin; TAC, takrolim-us; SOD, superoksid dismutaza; NOX,NADPH oksidaza.Bp
Efekat NIC-a(nikotin)o programiranoj ćelijskoj smrti kod kronične TAC nefrotoksičnosti
Programirana ćelijska smrt tipa I (apoptoza) ili tipa II (autofagija) je uključena u patogenezu hronične TAC-indukovane povrede bubrega [1s]. Koristeći TUNEL test, uočili smo da je većina TUNEL-pozitivnih ćelija ili apoptotičkih tela lokalizovana na tubularne epitelne ćelije i intersticijalne vaskularne endotelne ćelije, gde je napredovala tubularna atrofija i tipični TIF (Slika 5A). Kvantitativna analiza je pokazala da oba NIC(nikotin) i TAC značajno povećava TUNEL-pozitivne ćelije u poređenju sa VH grupama; ovo je bilo izraženije u NIC plus TAC grupi. Na molekularnom nivou, dodavanje NIC-a(nikotin)kod pacova tretiranih TAC-om rezultiralo je značajnom disregulacijom ekspresije Bcl-2/Bax i cijepane kaspaze-3 prema ćelijskoj smrti (slika 5B). Osim toga, elektronska mikroskopija je pokazala da tretman TAC-om izaziva obilno formiranje autofagičnih odjeljaka, kao što su početne autofagične vakuole (AVi), degradativne autofagične vakuole (Avd) i mitofagija (oblik selektivne autofagije) u NIC-u, TAC-u i NIC-u. plus TAC grupe (slika 6). Kvantitativni imunobloting je otkrio da je prekomjerna ekspresija p62, LC3B, PINK1 i Parkin proteina uočena u bubrezima pacova tretiranih TAC-om dodatno povećana sa NIC (Slike 6G i 6H).
Slika 5. Reprezentativne fotomikrografije TdT-posredovanog dUTP-biotin nick end labeling testa (TUNEL)(A) i imunoblot analiza za gene koji kontroliraju apoptozu (B).Nikotintretman povećava TUNEL-pozitivne ćelije (strelice) u bubrezima pacova tretiranih s takro-limusom. VH, nosač; NIC(nikotin),nikotin; TAC, takrolimus; Bcl, B-ćelijski limfom; Bax, Bcl{1}}povezan X. p
Efekat NIC-a(nikotin)na mitohondrijalnu disfunkciju kod kronične TAC nefrotoksičnosti
Transmisionom elektronskom mikroskopom jasno smo uočili da oba NIC(nikotin)i TAC su uništili mitohondrijalnu arhitekturu, kao što je ilustrovano smanjenom veličinom i brojem mitohondrija, neorganizovanim kristama, vakuolizacijom, fuzijom, formiranjem mitofagije i mitohondrijama podeljenim na dve ili tri fisije organele-ćerke) (Sl.6). Rezultati kvantitativne analize su pokazali da je NIC(nikotin) tretman je dodatno smanjio broj i veličinu mitohondrija u poređenju sa samo NIC ili TAC tretmanom. Imunobloting analiza je otkrila da je disregulacija proteina povezanih s mitohondrijama (OPA1 i Drpi) izazvana bilo kojim od Nicor TAC-a pogoršana istovremenom primjenom NIC-a i TAC-a (slika 6).
Slika 6. Reprezentativne transmisione elektronske mikrofotografije autofagije i mitohondrijske morfologije(AF), analiza imunoblotiranja (G, H) i kvantifikacija broja i veličine mitohondrija u svakoj tretiranoj grupi. (A) Formiranje autofagije u bubrezima takrolimusa (TAC) i/ilinikotin(NIC) tretirani štakori (strelica); (B) autofagični odjeljak koji sadrži mitohondrije, bubrege 'TAC-a i/ili NIC-a(nikotin)tretirani pacovi (mitofagija, strelica); (C) normalne mitohondrije; (D) smanjen broj mitohondrija u bubrezima TAC i/ili NIC(nikotin)tretirani pacovi; (E) mitohondrijska fuzija uočena u bubrezima pacova tretiranih TAC i/ili NIC (krug); (F) mitohondrij podijeljen na dvije ili više ćerki organela u bubrezima štakora tretiranih TAC i/ili NIC (fisija, krug) . VH, vehikulum;LC3B, laki lanac 3B;PINK1, fosfat i tenzioni homolog obrisani na kinazi 1 izazvanoj desetom hromozoma;OPA, protein optičke atrofije; Drp, protein vezan za dinamin.p
fisetinobubreg
Efekat NIC-a(nikotin)na stres endoplazmatskog retikuluma kod kronične TAC nefrotoksičnosti
Kao što je prikazano na slici 7, Nicor TAC je izazvao degranulaciju ribozoma, nepovezane i proširene cisterne i vakuolizaciju peroksizoma u grubom endoplazmatskom retikulumu (ER), dok je glatka struktura ER ostala skoro normalna (slika 7B). Imunobloting analiza je otkrila da bilo NIC(nikotin)ili TAC je povećao ekspresiju gena povezanih sa ER stresom uključujući CHOP, Bip, IRE-1 i ATF-6, ali je njihova ekspresija dodatno povećana kombinacijom ova dva (slika 7C).
Slika 7. Reprezentativne fotomikrografije transmisione elektronske mikroskopije (A, B) i imunobloting analize gena povezanih sa stresom endoplazmatskog retikuluma (ER) (C).(A) Normalna gruba ER (strelice); (B) degranulacija ribozoma, nepovezane i proširene cisterne i proširenje vezikula grubog ER unikotin(NIC) i/ili takrolimus(TAC) tretiran bubreg pacova. VH, nosač;CHOP, C/EBP homologni protein;Bip, vezujući imunoglobulinski protein; IRE-1c, protein koji zahtijeva inozitol-1c; ATF, aktivirajući faktor transkripcije. str< o.01="" vs.vh,="">
DISKUSIJA
Pušenje cigareta je važan faktor rizika koji se može modifikovati za progresiju CKD i kod zdravih populacija i kod pacijenata sa osnovnim bolestima (npr. dijabetes, hipertenzija). Klinička ispitivanja pokazuju da pušenje cigareta povećava izlučivanje albumina u urinu i negativno utječe na funkciju bubrega [16]; osim toga, prestanak pušenja može poboljšati proteinuriju kod pacijenata sa CKD-om i dijabetesom tipa 2 i usporiti progresiju do završnog stadijuma bubrežne bolesti[1-,18]. Štaviše, pušenje bilo primaoca ili donora doprinosi epizodama odbacivanja i hroničnoj nefropatiji alografta, što dovodi do gubitka alografta u transplantaciji bubrega [19,2o]. Ovi štetni efekti pušenja (NIC(nikotin)) se ogledaju u studijama na modelima s/6 nefrektomije [2al] i dijabetičke nefropatije [o]. U ovoj studiji otkrili smo da je NIC(nikotin)pogoršano TAC-indukovano frakciono mezangijalno područje i TIF. Ove patološke promjene dovele su do izraženijeg oštećenja bubrežne funkcije i pojačanog izlučivanja proteina u urinu. Na osnovu ovih rezultata i drugih izvještaja, predlažemo da pušenje cigareta može ubrzati gubitak bubrežnog alografta kod primatelja transplantata koji primaju imunosupresive zasnovane na TAC-u.
Upala igra ključnu ulogu u evoluciji kronične TAC-nefrotoksičnosti jer prethodi tekućim bubrežnim ožiljcima. Povećani proinflamatorni medijatori kao odgovor na štetne podražaje mogu regrutirati inflamatorne ćelije, koje zauzvrat prekomjerno eksprimiraju proinflamatorne i profibrotičke citokine kao što su hemoatraktanti, molekuli adhezije i TGF- 1. Nedavno smo pokazali da su NLRP3-zavisni i nezavisni inflamazomi uključeni u patogenezu hronične TAC nefrotoksičnosti [s]. Naši rezultati pokazuju da administriranje NIC(nikotin)kod pacova tretiranih TAC pojačava ekspresiju gena povezanih s piroptozom (NLRP3, IL-1 i I-18), proinflamatornih medijatora MCP-1 i profibrotskih citokina TGF- i CTGF, što vodi do prekomjernog priliva ED-1-pozitivnih ćelija i regulacije ig-h; ovi odgovori odražavaju ozbiljnost glomerularnih i tubularnih ozljeda. Naši nalazi su u skladu sa onima Arany et al.[22]i Agarwal et al.[23], koji su pokazali efekte NIC-a na bubrežnu upalu i fibrozu.
Iako NIC(nikotin)-zasnovano na egzacerbaciji hronične TAC nefrotoksičnosti u ovom modelu može biti multifaktorska, verovatno je povezana sa uticajem oksidativnog stresa. Dobro je poznato da je hronično liječenje TAC-om usko povezano s hipoksijom povezanom s aferentnom arteriolopatijom, koja se kasnije povezuje s oksidativnim stresom, koji zauzvrat aktivira profibrotičku prekomjernu ekspresiju TGF- 1, što dovodi do fibroze. Ovaj konstrukt je podržan opažanjem da antioksidativne terapije (npr. koenzim Q10) smanjuju ekspresiju TGF- 1 i TIF očuvanjem mitohondrijalnog integriteta kod hronične TAC nefrotoksičnosti 24]. Nedavno, neodoljivi dokazi iz in vitro studija pokazuju međusobnu povezanost između hronične izloženosti NIC-u i oksidativnog stresa kod različitih povreda bubrega [o,25,26. Ovdje smo otkrili da NIC povećava nivoe 8-OHdG u serumu i urinu i povećava ekspresiju oksidantnog proteina, dok potiskuje ekspresiju antioksidativnog proteina, čime povećava TAC-inducirani oksidativni stres, kao i fibrozu. Zaista, pogoršanje NIC kod bubrega tretiranih TAC-om u ovoj studiji može se pripisati oksidativnom stresu.
cistanche erektilna disfunkcija
Također je moguće da su i apoptoza (programirana ćelijska smrt tipa I) i autofagija (programirana ćelijska smrt tipa II) uključene u NIC(nikotin)-ubrzana hronična TAC nefrotoksičnost. Kao što je prethodno ilustrovano, NIC direktno indukuje apoptozu ćelija podocita i proksimalnih tubula bubrega [27,28]; također indirektno inducira apoptotičku ćelijsku smrt putem oksidativnog stresa[2g] ili aktivacije TGF- 1[22].NIC(nikotin)takođe može izazvati autofagiju u zvezdastim ćelijama pankreasa Bo], srčanim miocitima novorođenčeta miša 31] i vaskularnim glatkim mišićnim ćelijama 32]. Dakle, oksidativni stres i programirana ćelijska smrt su međusobno povezani. Koristeći TUNEL test i elektronsku mikroskopiju, jasno smo uočili da je NIC značajno povećao broj TUNEL-pozitivnih ćelija u tubularnim epitelnim ćelijama, intersticijskim vaskularnim endotelnim ćelijama i autofagnim odeljcima u bubrezima pacova tretiranih TAC. Ove morfološke promjene bile su praćene disregulacijom gena povezanih s apoptozom ili autofagijom u bubrezima pacova, što je dovelo do smrti stanica. Ovi kumulativni dokazi sugeriraju da je NIC(nikotin)sama po sebi ne samo da inducira oksidativni stres i programiranu ćelijsku smrt, već također potiče neželjeni učinak TAC-a na bubrege, što rezultira disfunkcijom bubrega i oštećenjem arhitekture, kao što je ranije objavljeno u modelima dijabetičke nefropatije izazvane streptozotocinom (STZ) [o] i CKD ( s/6 nefrektomija) B3].
Osim toga, unutarstanične organele uzrokovane oksidativnim stresom kao što su mitohondrijska disfunkcija i ER stres igraju ključnu ulogu u integritetu kronične TAC nefrotoksičnosti, pokreću ER stres i disreguliraju mitohondrijalne i ER gene koji kontroliraju stres, a efekti se pogoršavaju kombiniranim tretmanom s ova dva . Stoga, pogoršanje mitohondrijalne kondicije i ER stres mogu objasniti učinak NIC-a(nikotin) na TAC-indukovanu povredu bubrega
Naša studija je otkrila da je NIC(nikotin)u dozi od 15 mg/kg pogoršava TAC-indukovanu povredu bubrega kroz oksidativni stres, upalu i programiranu ćelijsku smrt, u skladu sa prethodnim studijama [27,37,38]. Međutim, drugi su uočili suprotne nalaze. Sadis et al.Bg] su pokazali da NIC u dozi odo.s mg/kg štiti bubreg od ishemijske/reperfuzijske ozljede putem holinergičkog antiinflamatornog puta. Druga studija Agarwala et al.[23] prijavio da je dugotrajna oralna terapija NIC-om(nikotin)(28 sedmica) daje renoprotektivne efekte na pacovskom modelu spontane proteinurije (Minchen-Wistar-Frömter pacovi). Razlozi za ovo odstupanje u ulozi NIC-a na bubrezima su nepoznati, ali mogu ovisiti o dozi NIC-a, trajanju liječenja lijekom ili modelu glodara. Potrebne su daljnje studije da bi se riješili ovi problemi. Ova studija jasno pokazuje da NIC pogoršava TAC-indukovanu ozljedu bubrega u modelu kronične TAC nefrotoksičnosti kod pacova. Pogoršanje oksidativnog stresa i programirana ćelijska smrt mogu biti jedan od mehanizama koji leži u osnovi štetnih efekata NIC-a. Naši nalazi pružaju bolji uvid u uticaj pušenja među primaocima transplantacije.
cistamche u funkciji bubrega
REFERENCE
1. Bentata Y. Takrolimus: 20 godina upotrebe u transplantaciji bubrega kod odraslih: šta treba da znamo o njegovoj nefrotoksičnosti. Artif organi 202044140-152.
2. Sikma MA, Hunault CC, van de Graaf EA, et al. Visoke koncentracije takrolimusa u krvi rano nakon transplantacije pluća i rizik od ozljede bubrega. Eur J Clin Pharmacol 201773:573-58o.
3. Yagisawa T, Omoto K, Shimizu T, Ishida H, Tanabe K. Arterioskleroza u nultom vremenu biopsije je faktor rizika za kroničnu nefrotoksičnost izazvanu takrolimusom. Nefrologija (Carlton)201s;2o Suppl2:s1-57.
4. Nankivell BJ, P'Ng CH, O'Connell PJ, Chapman JR. Nefrotoksičnost inhibitora kalcineurina kroz sočivo longitudinalne histologije: poređenje doba ciklosporina i takrolimusa. Transplantacija 2016;1oo:1723-171.
5. Lim SW, Shin Y, Luo K, et al. Efekat Klotha na klirens autofagije kod povrede bubrega izazvane takrolimusom. FASEB J 2o193:2694-2706.
6. Lim SS, Vos T, Flaxman AD, et al. Komparativna procjena rizika od tereta bolesti i povreda koji se mogu pripisati 67 faktora rizika i klastera faktora rizika u 21 regiji, 199o-201o: sistematska analiza za Globalna studija o teretu bolesti 201o.Lancet 2o12;38o:2224-226o.
7. Formanek P, Salisbury-Afshar E, Afshar M. Pomaganje pacijentima sa ESRD i ranijim fazama CKD da prestanu pušiti. Am J Kidney Dis 2018;72:255-266.
8. Jain G, Jaimes EA.Nikotinsignalizacija i napredovanje hronične bolesti bubrega kod pušača. Biochem Pharmacol 2013;861215-1223.
9. Zhang LY, Jin J, Luo K, et al. Shen-Kang štiti od oštećenja bubrega uzrokovanih takrolimusom. Korean Jintern Med 2019341078-1090.
10. Ibrahim ZS, Alkafafy ME, Ahmed MM, Soliman MM. Renoprotektivni efekat kurkumina protiv kombinovanog oksidativnog stresa dijabetesa inikotinkod pacova. Mol Med Rep 2016;13:3O17-3026.