Neuroendokrino-imuna funkcija Cistanche Deserticola i njenih proizvoda za kuhanje rižinog vina u modelu štakora izazvanog glukokortikoidima-Ⅰ

1. Uvod

Cistanche deserticola, koji se naziva "pustinjski ginseng", tradicionalna je kineska medicina koja se vekovima koristila kao jang-tonik zaosnaživanje bubrega i jačanje janga[1]. Osam vrsta i jedna varijacijaCistanche Herba su zabilježeni samo u KiniCistanche deserticolaYC Ma andCistanche tubulosa(Schenk) Wight su zabilježeni u Kineskoj farmakopeji [2]. Farmakološke studije su to pokazaleCistanches Herbaispoljio neuroprotektivno [3], imunomodulatorno [4], kardioprotektivno [5], antizamorno [6], protuupalno [7], hepatoprotektivno [8], antioksidativno [9], antibakterijsko [10], laksativ [11] i antitumorsko efekti [12]. Širok spektar prijavljenih bioloških aktivnosti ovog roda pripisuje se njegovom složenom i raznolikom fitokemijskom sastavu.Cistanche deserticolasadrži feniletanol glikozide, iridoide, polisaharide [13] itd. Sadržaj feniletanoidnih glikozida je najveći u originalnim medicinskim materijalima [14].

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA OKREŽIVANJE BUBREGA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Obrada kineske Materia Medica (CMM) je tradicionalna farmaceutska tehnika za ispunjavanje različitih zahtjeva za liječenje, doziranje i pravljenje preparata prema teoriji tradicionalne kineske medicine. Ti prerađeni proizvodi se nazivaju komadići decokcije, koji se koriste u klinikama. Obrada ima za cilj povećanje efikasnosti za smanjenje toksičnosti sirovih lijekova. Kineska farmakopeja iz 2015. zabilježila je da se debele kriške Cistanchea (CD) i Cistanche kuhana na pari u pirinčanom vinu (WCD) mogu koristiti kao komadići decokcije u klinici. Naša istraživačka grupa pokazala je da je laksativno djelovanje ublaženo, a antiaging i osnažujući efekti bubrega i jang pojačani nakon što je Cistanche kuhan na pari s rižinim vinom [15].

Funkcija osovine hipotalamus-hipofiza-nadbubrežna žlijezda-timusna žlijezda (HPAT) je poremećena kod sindroma nedostatka bubrega i janga [16]. Pacijenti s nedostatkom bubrega-janga također imaju opsežnu imunološku disfunkciju. Disfunkcija HPA ose usko je povezana sa imunodeficijencijom. Teorija neuroendokrino-imune mreže (NEI) pokazuje da imuni i neuroendokrini sistemi dijele mnoge ligande i receptore [17], a hipotalamus se smatra središnjim mjestom za povezivanje neuroendokrinog s imunološkim sistemom.

U ovoj studiji replicirali smo nedostatak bubrega-yang kod pacova modela sa injekcijom egzogenog kortikosteroida i istražili mehanizam nedostatka bubrega-yang-a kao odgovor na različite prerađene proizvode Cistanche deserticola iz perspektive endokrino-imune funkcije.

2. Materijali i metode

2.1. Materijali i reagensi

Cistanche deserticola je sakupljena iz Alashan Neimenggua 2019.5 i identifikovana kao osušene mesnate stabljike Cistanche deserticola YC Ma od strane prof. Yanjun Zhaia (Farmaceutska škola, Univerzitet tradicionalne kineske medicine Liaoning, Kina). Uzorci vaučera sačuvani su u Tehnološkom centru za procesno inženjerstvo Liaoning.

Standardna jedinjenja ajugola su kupljena od Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Kina); cistanozid F,ehinakozid, cistanozid A i izoakteozidkupljeni su od Must Company (Sichuan Kina); akteozid je kupljen od Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Kina). MS acetonitril i metanol su nabavljeni od Merck KGaA (Darmstadt, Njemačka). Mravlja kiselina HPLC kvaliteta je kupljena od Merck KGaA (Darmstadt, Njemačka). Pirinčano vino je kupljeno od Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Kina).

Kortikosteron (CAS: 50-22-6, čistoća > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), pilule chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), ACTH pacova, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF- , IL-2 i IL-10 ELISA kompleti za detekciju su kupljeni od Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Komplet ELISA za test kortizola za štakora je obezbijedio BOSK Co., pacovsko CD4 antitijelo, CD8a antitijelo (br. 561833 i 559976), RBC lizat (Solarbio, R1010), PBS puferski rastvor (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM i -aktin uzvodni i nizvodni prajmeri je obezbedio Guangzhou Invitrogen Co. Komplet za obrnutu transkripciju (br. RR037A) i komplet za sintezu cDNA (br. 10000068167) obezbedila je Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Kloroform, izopropanol, 75% uretanol Svi rastvori su bili analitički čisti i proizvedeni od strane Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Ultračistu vodu proizvodi Milli-Q sistem (18,2 MΩ, Millipore, MA, SAD).

2.2. Eksperimentalni instrumenti

Enzimski marker (Thermo, model 3530911931), automatska mašina za pranje ploča (model HBS- 4009), digitalni displej push-pull forcemeter (model VICTOR- 50N), brza centrifuga za zamrzavanje (model Sigma 3k15 ), ultramikro spektrofotometar (model B-50Q), genski pojačivač (model L96G), kvantitativni PCR fluorescencije u realnom vremenu (model StepOne), protočni citometar (model AC66051710132), parafinski mikrotom (model Laika), mikroskop (Olymp) , model BS-53), i instrument sa čistom vodom (model F7JA36507).

2.3. Priprema uzoraka za UPLC-Q-TOF-MS i farmakološke eksperimente

WCD je obrađen iz iste serijeCistanche deserticolau našoj laboratoriji. Za pripremu WCD, suvi komadići CD-a (debljine 5 mm) (100 g) su natopljeni pirinčanim vinom (30 mL), pareni na visokom pritisku (1,25 kPa) 4 h, a zatim sušeni na 55 stepeni.

Krupni praškovi CD-a i WCD-a natopljeni su 10 puta 95% etanolom tokom 0,5 h, ekstrahovani refluksom 3 puta svaki put po 1 h i filtrirani, a filtrati su kombinovani 3 puta. Etanol je rekuperiran pod sniženim pritiskom, a ekstrakt je dobiven za primjenu. Ekstrakt (1 mL) je dodan u 50% metanola, čime je ukupna zapremina dovedena do 20 mL, i čuvan na 4 stepena za analizu sadržaja.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. UPLC-QqQ-MS Uslovi za analizu CD i WCD ekstrakata

2.4.1. LCThMS Analitički uslovi

Za prikupljanje i obradu podataka korišten je sistem UPLC-MSThMS sa softverom MassLynx 4.1 Analyst. Analitička kolona je bila Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) na temperaturi od 40 stepena C. Mobilna faza bio je 0.1% vodeni rastvor mravlje kiseline (A) i acetonitrila koji sadrži 0,1% mravlje kiseline (B). Gradijent elucije bio je 0.00–1.00 min sa 3% B, 1,01–2.00 min sa 3%–11,5% B, 2,01–3.{{29 }} min sa 12% B, 3.01–4.00 min sa 15% B, 4.01–5.00 min sa 20% B, 5.01–6.00 min sa 22 % B, 6,01–8.00 min sa 25% B i 8,01–9.00 min sa 10% B. Brzina protoka je bila 0,3 mLTh min, a volumen ubrizgavanja 1,0 μL.

Waters trostruki četvorostruki maseni spektrometar (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, SAD) opremljen izvorom elektrosprej jonizacije (ESI) korišćen je u režimu negativnih jona. Gas za desolvataciju bio je azot sa protokom od 500 LThh na temperaturi od 250 stepeni. Sva otkrivena jedinjenja merena su u režimu praćenja višestrukih reakcija (MRM); U tabeli 1 prikazani su energetski parametri, a u tabeli 2 prikazane su kalibracione krive za analizirane komponente.

2.4.2. Priprema referentnih supstanci

Tubulozid A (3.02 mg), ehinakozid (3.00 mg), 2′-acetilakteozid (2,34 mg), akteozid (2,45 mg), izoakteozid (0,61 mg), cistanozid F ( 2,14 mg), salidrozid (3,39 mg), geniposidna kiselina (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) i katalpol (2,39 mg) rastvoreni su u metanolu da bi se pripremio osnovni rastvor. Osnovni rastvor je razrijeđen metanolom da bi se dobile odgovarajuće koncentracije za radne standardne otopine. Svi pripremljeni rastvori su čuvani na 4 stepena pre upotrebe.

2.5. Priprema i grupisanje životinjskih modela

SD mužjaci pacova (180–220 g) kupljeni su od Liaoning Changsheng Biotechnological Co., broj dozvole za životinje: SCXK (Liao) 2015–0001. Svi pacovi su održavani sa slobodnim pristupom hrani i vodi na 25 stepeni i relativnoj vlažnosti od 30-50%. Životinje su bile smještene 7 dana prije eksperimenata.

Stotinu štakora je nasumično podijeljeno u 10 grupe: slepa kontrolna (BC) grupa, model kontrolna (MC) grupa, pozitivna kontrola (PC) grupa, kontrolna grupa pirinčanog vina (WC), CD sa visokom dozom (CD -HD) grupa, CD sa srednjom dozom (CD-MD), grupa sa niskom dozom CD (CD-LD), grupa sa visokom dozom WCD (WCD-HD), grupa sa srednjom dozom WCD (WCD-MD) i WCD grupa niske doze (WCD-LD). Doze CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD i CD-LDThWCD-LD bile su 5,48 gTh(kg∙d), 2,74gTh (kg∙d), odnosno 1,37gTh(kg∙d). Doza za PC grupu bila je 1,646 gTh(kg ∙ d), a za WC grupu 1 mLTh100 g tokom 40 dana. Šestog dana nakon primjene, pacovima je subkutano ubrizgana vodena suspenzija kortikosterona (kortikosteron + 0.1% dimetil sulfoksid + 0.1% Tween-80 + 0.9% natrijum hlorid) osim za BC grupu [18]. Koncentracija kortikosterona bila je 5 gThL, a doza 0,1 mLTh100 g. Pacovima u BC grupi je davan normalni fiziološki rastvor + 0.1% dimetil sulfoksid + 0.1% Tween- 80 + 0.9% natrijum hlorid injekcijom u istoj dozi.

2.6. Određivanje funkcija osi HPA

2.6.1. Test težine, temperature i snage držanja

Test težine je rađen svaka 3 dana, a temperatura je mjerena svakih 6 dana. tokom eksperimenta. 39. dana mjerena je maksimalna snaga zadnjeg ekstremiteta grip metrom. Pacovi su bili postavljeni na glatke platforme, tako da su im zadnji udovi uhvatili motku. Štakori će instinktivno zgrabiti bilo koji predmet kako bi spriječili kretanje unazad kada se rep povuče sve dok sila vuče ne premaši stisak. Kada je štakor izgubio stisak, pretpojačalo je moglo automatski snimiti maksimalnu silu hvatanja.

2.6.2. Određivanje nivoa T, CRH, ACTH, CORT i kortizola u serumu

Jedan sat nakon posljednje primjene, pacovi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom otopine uretana (20 gTh100 mL). Zatim su uzorci krvi sakupljeni, centrifugirani na 3500 r 15 min da bi se dobio serum i pohranjeni na -20 stepeni. Koncentracije T, CRH, ACTH, CORT i kortizola mjerene su pomoću ELISA kompleta za pacove prema uputama proizvođača.

2.6.3. Microscope Observations

Morfološka struktura tkiva nadbubrežne žlijezde uočena je HE bojenjem. Tkivo nadbubrežne žlijezde je fiksirano u 10% paraformaldehidu, dehidrirano u etanolu, učinjeno transparentnim otopinom ksilena, ugrađeno konvencionalnim metodama, isječeno na 4 μm debele kriške, devoskairano otopinom ksilena, hidratizirano gradijentom etanola, a zatim obojeno hematoksilinom i e. rastvor za bojenje. Nakon što je prozirna ksilenom, ploča je zapečaćena neutralnom gumom i posmatrana pod mikroskopom.

2.6.4. Imunohistohemijsko bojenje ekspresije proteina Bax, Bcl-2, kaspaze-3, Fas i FasL u nadbubrežnoj žlijezdi

Odsječke nadbubrežne žlijezde pacova fiksirane u formalinu, u parafin su deparafinizirane i rehidrirane nakon rezanja na debljini od 4 μm. Radi blokiranja aktivnosti endogene peroksidaze, sekcije su prethodno inkubirane u bloku vodonik peroksida 10 min. Sekcije su umočene u 0.01 M citrat (pH 6,0) i zagrijane do ključanja. Postupak je ponovljen nakon 5-10 min. Nakon hlađenja, sekcije su isprane sa PBS (pH 7,2-7,6) 1-2 puta, ostavljene na sobnoj temperaturi oko 5 minuta i isprane sa PBS (pH 7,2-7,6) 2-3 puta. Dodan je 5% rastvor BSA za blokiranje na sobnoj temperaturi, a višak tečnosti na sekciji je otresen 20 minuta kasnije. Dodata su razrijeđena primarna antitijela specifična za FasTh FasL, Bcl{25}}ThBax i kaspazu-3 (1:100 razrijeđena sa PBS) i inkubirana na 37 stepeni 1 h ili 4 stepena preko noći. Sekcije su isprane 2-3 puta sa PBS (pH 7,2-7,6). Zatim je dodat biotinilovani kozji antimišji IgG, a sekcije su sušene na 20-37 stepeni 20 minuta i isprane sa PBS (pH 7,2-7,6) 4 puta po 5 minuta. Nakon temeljitog ispiranja u PBS-u, sekcije su inkubirane mješavinom reagensa A i B 30 minuta, inkubirane sa PBS-om 45 minuta i konačno razvijene sa DAB supstratom (DAKO) 30 minuta prije nego što su lagano obojene hematoksilinom, dehidrirane, i montiran.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA JAČANJE SEKSUALNOG OSJETA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Određivanje imunoloških funkcija

2.7.1. Izračunavanje indeksa imunoloških organa

Jedan sat nakon posljednje primjene, pacovi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom otopine uretana (20 gTh100 mL), a zatim su slezena i timusna žlijezda uklonjene i odmah izvagane u sterilnoj haubi. Težinski koeficijenti slezene ili timusa (%) � težina slezine ili timusa (mg) Tjelesna težina (g).

2.7.2. Detekcija podskupina T limfocita u perifernoj krvi

Splenociti i hemociti su inkubirani sa monoklonskim antitelima anti-CD4 (PE) i anti-CD8 (FITC) 30 minuta u mraku. Dodato je 2 mL lizata eritrocita, a rastvor je mešan vorteksom. Rastvor je ostavljen u mraku 10 minuta i centrifugiran 5 minuta. Supernatant je odbačen, a zatim je rastvor ispran 3 puta sa ledeno hladnim PBS i resuspendovan u rastvoru za permeabilizaciju PBS. Najmanje 10,000 ćelija je analizirano protočnom citometrijom unutar 1 h od svakog bojanja Mab.

2.7.3. Određivanje nivoa IL-10, IL-6, IL-2, TNF- i IFN-c u serumu

Jedan sat nakon posljednje primjene, pacovi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom otopine uretana (20 gTh100 mL), a krv je uzeta iz abdominalne aorte. Krv je centrifugirana na 3500 r 15 min da bi se dobio serum i čuvana na -20 stepeni. Koncentracije IL-10, IL-6, IL-2, TNF- i IFN-c detektovane su pomoću ELISA kompleta za pacove prema uputstvima proizvođača.

2.8. Ekspresija CaM u hipotalamusu i tkivima hipofize

Ukupna RNK je ekstrahirana iz tkiva hipotalamusa i hipofize pomoću TRIzola. Reverzna transkripcija je izvršena na 10 μL ukupne RNK prema uputama proizvođača. Jednake količine cDNK analizirane su putem qPCR-a u prisustvu boje koja veže dsDNK (Promega, SAD) i CFX 96 PCR sistema u realnom vremenu (Bio-Rad, SAD) kako bi se pogledali različiti geni pod uslovima inicijalne aktivacije na 95 stepeni u trajanju od 10 minuta, 40 ciklusa denaturacije na 95 stepeni u trajanju od 15 s, i produžavanje žarenja na 60 stepeni u trajanju od 1 min.

Prajmeri za CaM i -aktin su dati u tabeli 1, a -aktin je korišten kao interna kontrola. Svaki uzorak je normalizovan korišćenjem razlike u kritičnim pragovima (Ct) između ciljnog gena i -aktina. Za opis rezultata korištena je sljedeća jednadžba: ΔΔCt � (Ct ciljni gen − Ct-aktin gen) eksperimentalna grupa − (Ct ciljni gen − Ct-aktin gen) kontrolna grupa. Zatim su upoređeni nivoi mRNA svakog uzorka, koristeći ekspresiju 2- ΔΔCt ciljnog gena. Rezultati svake grupe su usredsređeni (tabela 3).

2.9. Statistička analiza

Svi podaci su analizirani korištenjem SPSS softvera (verzija 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Razlike između grupa analizirane su jednosmjernom analizom varijanse ponovljenih mjera (ANOVA). Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD) korištenjem softvera GraphPad Prism (verzija 6.0, San Diego, CA, USA). Razlike sa P vrijednošću manjom od 0.05 smatraju se statistički značajnim.

3. Eksperimentalni rezultati

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalysis

Da bi se postiglo najbolje odvajanje, oblik vrha i kratko vrijeme analize, hromatografski uslovi uključujući kolonu, mobilnu fazu i program gradijenta proučavani su u našem preliminarnom eksperimentu. Tipični hromatogrami sa MRM modom prikazani su na slici 1.

Iz tabele 4 se vidi da je sadržaj feniletanoidnih glikozida u WCD povećan u odnosu na CD, posebno za ehinakozid i akteozid, dok je sadržaj iridoida smanjen u WCD.

3.2. Regulativa za funkciju osi HPA

3.2.1. Test težine, temperature i snage držanja

Pacovi MC grupe i eksperimentalne grupe su postepeno pokazivali simptome nedostatka bubrega-yang nakon davanja kortikosterona. Simptomi, kao što su gubitak težine, hipotermija, gubitak sjaja kose, klonulost, zaostajanje u odgovoru i značajno smanjenje potrošnje vode i aktivnosti, značajno su se poboljšali u CD i WCD grupama. Slika 2(a) prikazuje promjene težine. Težina svake od grupa lijekova se povećala, posebno u grupama sa CDHD i WCD-HD. Prirast u MC grupi bio je najmanji. Na slici 2(b) prikazane su promjene temperature koje su bile najniže u MC grupi, a temperatura povećana u grupama WCD-HD, WCD-MD i WCD-LD.

Slika 2(c) pokazuje da se snaga držanja povećala za BC grupu i svaku od eksperimentalnih grupa, a WCD-MD grupa je bila najveća, što je pokazalo da su se znaci slabosti izazvane nedostatkom bubrega-janga poboljšali nakon primjene.

3.2.2. Nivoi T, CRH, ACTH, CORT i kortizola

Slika 3 pokazuje da je u poređenju sa onima iz BC grupe nivo T, CRH, ACTH i CORT u serumu štakora smanjen (P < 0.01) i smanjen nivo kortizola (P < 0.05) u MC grupi. U poređenju sa onima iz MC grupe, povećan je nivo T u WCD-HD i WCD-MD grupama (P < 0.01), nivo CRH u WCD-LD, WCD-MD i WC grupe poboljšane (P < 0.01), sadržaj ACTH povećan u CD-HD, WCD-MD i WCD-HD grupama (P < 0,01), nivo CORT nadograđen u CD-MD, WCD-MD i WCD-HD grupe (P < 0,01) i pojačan u grupama CDHD i WCD-LD (P < 0,05), a nivo kortizola je povećan u svakoj od grupa lekova.

3.2.3. Rezultati mikroskopskog posmatranja

Tkivo nadbubrežne žlijezde može se podijeliti na kortikalni sloj i sloj medule. Kortikalni slojevi uključuju globularne, snopčaste i retikularne slojeve. Ćelije sadrže više lipida, a sloj medule se sastoji uglavnom od ćelija feohromocitoma i male količine fibroznog tkiva. Kao što je prikazano na slici 4, otkrili smo da je sve bilo normalno u BC grupi, dok je u MC grupi, korteks nadbubrežne žlijezde imao očiglednu hiperplaziju, ćelijsku atrofiju i povećanje gustine. Lukovičasta traka se zadebljala, a prozirna fascikularna zona, uska zona reticularis i manje ćelije su pokazale neujednačenu boju i zagušenje kapilara. U PC grupi bile su vidljive kortikalne i medularne granice. Ćelije globularnih i snopićastih traka bile su ravnomjerno raspoređene, a morfološka struktura je obnovljena. Ista bolja restauracija uočena je u WCD grupama, a efekti u WCD-MD grupi bili su bolji od onih u WCD-HD i WCD-LD grupama. Morfologija nadbubrežne žlijezde u grupama CD nije bila tako dobra kao u grupama WCD.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%