Nc886, nekodirajuća RNA, novi je biomarker i epigenetski posrednik ćelijskog starenja u fibroblastima

sažetak:

Funkcionalne studije organizama i ljudskih modela otkrile su da epigenetske promjene mogu značajno utjecati na proces starenja. Nekodirajuća RNA (ncRNA), jedan od epigenetskih regulatora, igra važnu ulogu u modificiranju ekspresije mRNA i njihovih proteina. Može posredovati u fenotipu ćelija. Prijavljeno je da nc886 (=vtRNA2-1 ili pre-miR-886), duga ncRNA, može suzbiti formiranje tumora i foto-oštećenja keratinocita uzrokovana UVB. Ova studija imala je za cilj da utvrdi ulogu nc886 u replikativnom starenju fibroblasta i utvrdi da li supstance sposobne da kontrolišu ekspresiju nc886 mogu regulisati ćelijsko starenje.

U fibroblastima replikativnog starenja, ekspresija nc886 je smanjena, dok je metilirani nc886 povećan. Došlo je do promjena u biomarkerima starenja uključujući aktivnost SA- -gal i ekspresiju p16INK4A i p21Waf1/Cip1 u ćelijama starenja. Ovi nalazi ukazuju da je smanjenje nc886 povezano sa starenjem povezano sa ćelijskim starenjem fibroblasta i da povećanje ekspresije nc886 ima potencijal da potisne ćelijsko starenje. AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) je povećao ekspresiju nc886 i poboljšao ćelijsko starenje fibroblasta inhibiranjem biomarkera vezanih za starenje. Ovi rezultati pokazuju da nc886 ima potencijal kao nova meta za anti-aging i da ATC može biti moćan epigenetski sastojak protiv starenja.

Ćelijsko starenje je širok pojam koji pokriva fenomene kao što su smanjena ćelijska funkcija, smanjeni proliferativni kapacitet i oštećenje DNK uzrokovano mnogim faktorima. Ćelijsko starenje nije jedan, predvidljiv proces, već kombinovani efekat niza različitih fizioloških, genetskih i faktora sredine. U istraživanju je utvrđeno da se Cistanche može oduprijeti starenju jer se princip protiv starenja Cistanchea uglavnom odnosi na različite aktivne sastojke koje sadrži. Cistanche je bogat raznim biološki aktivnim supstancama, kao što su polisaharidi, flavonoidi, acetofenoni itd. Među njima, polisaharid je jedan od glavnih aktivnih sastojaka Cistanchea, koji ima različite zdravstvene funkcije kao što su jačanje imuniteta, antioksidacija, regulacija metabolizma itd., te može ublažiti stepen starenja tijela.

Click cistanche tubulosa pogodnosti

Ključne riječi:

fibroblasti; replikativno starenje; epigenetska regulacija; nc886; ekstrakt zelenog čaja.

1. Uvod

Ćelijsko starenje u ireverzibilnom stanju nakon zaustavljanja ćelijske proliferacije pokazalo se kao potencijalno važan faktor koji doprinosi disfunkciji tkiva i starenju organizama [1]. Starenje karakteriše visoka aktivnost beta-galaktozidaze povezane sa starenjem (SA- -gal), povećanje ekspresije biomarkera starenja kao što su p16INK4A i p21Waf1/Cip1, i smanjena ekspresija LaminB1 [2]. Postoje dva osnovna tipa ćelijskog starenja: replikativno starenje i prerano starenje izazvano stresom. Replikacijsko starenje se definira kao fenomen kada normalne stanice prestanu da se dijele nakon što dosegnu ograničeni broj dioba. Vezano je za hronološko starenje. Kontinuirano nakupljanje oštećenja može izazvati replikativno starenje fibroblasta, što dovodi do gubitka sposobnosti remodeliranja i organiziranja ekstracelularnog matriksa (ECM). Glavne karakteristike ostarjelog dermisa su smanjena količina kolagenih vlakana i povećana proizvodnja matriksnih metaloproteinaza (MMP), koje doprinose tankoj i neorganiziranoj strukturi dermisa [3,4].

Epigenetički regulatorni mehanizmi ključni su posrednici procesa starenja, prilagođavajući se stresorima i promjenama vezanim za starenje u genomskom i molekularnom okruženju. Ove epigenetske promjene se javljaju na različitim nivoima, uključujući masivnu redukciju histona u jezgru, deformaciju histona post-translacijskom modifikacijom i metilacijom DNK, zamjenu kanonskih histona varijantama histona i promijenjenu ekspresiju nekodirajuće RNK (ncRNA) tokom organskog i replikativnog starenja [5]. ,6]. nc886 je ncRNA duga 101 nukleotid koja se može vezati za ciljni protein, posredujući na taj način aktivnost proteina i kontrolirajući ekspresiju gena [7]. nc886 je također predložen kao supresor tumora u velikoj mjeri na osnovu njegovog obrasca ekspresije i njegove genomske lokacije na ljudskom hromozomu 5q31, lokusu gena za supresor tumora. Karakteristika ekspresije nc886 je često utišavanje maligniteta metilacijom CpG DNK u promotorskoj regiji [8]. Na osnovu prethodnih studija, otkrili smo da je smanjenje ekspresije nc886 uzrokovano UVB zračenjem povezano s povećanjem COX-2 i MMP-9 putem protein kinaze RNA-aktiviranog (PKR) puta u keratinocitima i da promocija ekspresije nc886 može biti korisna strategija za razvoj UVB zaštitnih materijala [9,10].

Zeleni čaj je proučavan kao tretman za niz dermatoloških stanja, kao što su akne, rozacea, psorijaza, virusne bradavice, pa čak i rak kože. Fenolna jedinjenja uključujući galnu kiselinu (GC) i epigalokatehin galat (EGCG) su dobro poznata aktivna jedinjenja u zelenom čaju. (-)-Epigalokatehin-3-(3"-O-metil) galat (3" Me-EGCG) je jedinstveni O-metilirani oblik EGCG-a i sadržan je u oolong čaju i zelenom čaju. Konkretno, Jangwon br. 3 (amorepacifičke sorte zelenog čaja) sadrži više 3" Me-EGCG od drugih vrsta zelenog čaja [11]. Prijavljeno je da 3" Me-EGCG pokazuje antioksidativne i fotoprotektivne efekte na keratinocite [12] . U ovoj studiji smo istražili ulogu nc886 u replikativnom starenju fibroblasta i utvrdili da li visokokoncentrirani pripravak zelenog čaja 3" Me-EGCG (AbsoluTea Concentrate 2.0) koji može povećati ekspresiju nc886 može poboljšati ćelijsko starenje.

2. Rezultati

2.1. Hemijski profil AbsoluTea koncentrata 2.0 (ATC)

Hemijski profil AbsoluTea koncentrata 2.0 (ATC) prikazan je na slici 1B. Rezultati su dobijeni korišćenjem HPLC za ATC pripremljen kako je opisano u odjeljku Metoda. ATC je sadržavao 30 posto ili više 3" Me-EGCG (Slika 1B). Poznato je da ekstrakt zelenog čaja ne sadrži 3" Me-EGCG ili pokazuje koncentraciju manju od 6 posto [13,14]. I mladi i stari fibroblasti tretirani ATC-om pokazali su više povećanja ekspresije nc886 od onih tretiranih sa 70 posto etanolnog ekstrakta zelenog čaja (dodatna slika S1A). Osim toga, nivoi ekspresije SA- -gal u senescentnim fibroblastima tretiranim ATC-om su smanjeni više nego u onima tretiranim ekstraktom zelenog čaja (dodatna slika S1B).

2.2. nc886 Reguliše ćelijsko starenje fibroblasta

Da bismo promatrali ulogu nc886 u ćelijskom starenju fibroblasta, koristili smo replikativni model starenja kroz uzgoj i subkulturu. Kao što je prikazano na dodatnoj slici S2, aktivnost SA- -gal i nivoi ekspresije staračkih markera p16INK4A i p21Waf1/Cip1 su povećani, a ekspresija Lamina B1 je smanjena u senescentnim fibroblastima u poređenju sa mladim ćelijama. Mnoge prethodne studije su izvijestile da je starenje uzrokovano oksidativnim stresom. Da bi se potvrdilo da li je ova serija oksidativnog stresa povezana sa ćelijskim starenjem, izmjereni su nivoi ROS u mladim (p3) i starim fibroblastima (p30). Rezultati su pokazali da se nivoi ROS povećavaju sa starenjem (dodatna slika S2D).

Da bi se uočio potencijalni uticaj nc886 na ćelijsko starenje u fibroblastima, određen je nivo ekspresije gena nc886 u svakom broju pasaža. Nivo ekspresije nc886 se smanjivao sa povećanjem broja prolaza (Slika 2A). Prijavljeno je da se ekspresija nc886 smanjuje sa metilacijom CpG ostrva. Da bi se utvrdilo da li je smanjenje nc886 u starim fibroblastima posredovano metilacijom nc886, izveden je PCR specifičan za metilaciju. Kao što je prikazano na slici 2A, metilacija nc886 je povećana sa povećanjem broja prolaza (slika 2A). Ovaj rezultat pokazuje da je smanjena ekspresija nc886 u velikom broju prolaza fibroblasta posljedica povećanja metilacije nc886 DNK. Da bi se potvrdila uloga nc886 u starenju fibroblasta, određene su promjene u markerima starenja u prekomjernoj ekspresiji nc886 i modelima knock-down. Rezultati su otkrili da je grupa senescentnih fibroblasta sa prekomjernom ekspresijom nc886 pokazala smanjenu aktivnost SA-beta-gal, smanjene nivoe ekspresije p16INK4A i p21Waf1/Cip1 i povećane nivoe laminB1.

Osim toga, povećanje ROS-a u senescentnim fibroblastima je smanjeno prekomjernom ekspresijom nc886 (slika 2B). Suprotno tome, u grupi mladih fibroblasta sa nc886 knock-downom, ćelijsko starenje je ubrzano i nivoi ekspresije ćelijskih markera starenja kao što su p16INK4A i p21Waf1/Cip1 su povećani (slika 2C). Ovi rezultati sugeriraju da nc886 može regulirati ćelijsko starenje fibroblasta regulacijom ekspresije markera starenja (Slika 2B, C).

2.3. ATC ublažava ćelijsko starenje regulacijom ekspresije nc886

Gore dobijeni rezultati su pokazali da povećanje ekspresije nc886 može poboljšati ćelijsko starenje posredovanjem markera starenja. Da bi se posmatrao efekat ATC-a na ekspresiju nc886, nivo ekspresije i metilacija nc886 u senescentnim fibroblastima procenjeni su nakon tretmana ATC-om u necitotoksičnoj koncentraciji (Slika 3A). Kao što je prikazano na slikama 3B i C, ATC je značajno povećao ekspresiju nc886 i smanjio metilaciju nc886 na način ovisan o koncentraciji. Ovaj rezultat je pokazao da je povećanje ekspresije nc886 pomoću ATC-a posredovano inhibicijom metilacije nc886. Osim toga, primijetili smo da ATC inhibira SA- -gal aktivnost i smanjuje nivoe ekspresije staračkih markera p16INK4A i p21Waf1/Cip1 u senescentnim fibroblastima (Slika 3D, E). Međutim, ekspresija LaminB1 za koju se zna da je smanjena sa starenjem je povećana u senescentnim fibroblastima tretiranim ATC-om (slika 3E). Ovi rezultati pokazuju da ATC može ublažiti ćelijsko starenje povećanjem ekspresije nc886.

Slika 2. nc886 reguliše ćelijsko starenje fibroblasta. (A) Ekspresija nc886 i metiliranog nc886 prema pasusu potvrđena je PCR-om u realnom vremenu i normalizirana sa 18s rRNA. (B) Fragment nc886 amplificiran i pročišćen iz ljudske genomske DNK transficiran je u stare ćelije sa lipofektaminom 3000. Prekomjerna ekspresija je potvrđena posmatranjem ekspresije nc886 PCR-om u realnom vremenu i ekspresije SA- -gal pomoću fluorescentne mikroskopije i protočne citometrije. Ekspresija proteina markera starenja i intracelularna generacija ROS-a uočena je u modelu prekomerne ekspresije nc886. (C) Ćelije su transficirane sa anti-oligos (si-ctrl i si-nc886) u koncentraciji od 250 ppm koristeći LipofectaminTM RNAiMAX reagens. Obaranje nc886 je potvrđeno posmatranjem ekspresije nc886 PCR-om u realnom vremenu i ekspresijom SA- -gal pomoću fluorescentne mikroskopije i protočne citometrije. Ekspresija markera starenja potvrđena je Western blot-om. Skala bar: 200 µm. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD za tri nezavisna testa. *, p < 0,05; **, p < 0,01 u poređenju sa kontrolom.

2.4. ATC reguliše starosne promene ECM i SASP

Karakteristika starenja fibroblasta je da je povećana aktivnost MMP-1, komponente koja razgrađuje kolagen, dok je sinteza kolagena smanjena [15,16]. Povećanje MMP-1 i smanjenje kolagena potvrđeno je u senescentnim fibroblastima sa visokim brojem prolaza (slika 4A).

Međutim, ATC je potisnuo ekspresiju MMP-1 i povećao sintezu kolagena u starim fibroblastima. Ovaj rezultat ukazuje da ATC može poboljšati promjenu ECM vezanu za starenje kroz regulaciju ekspresije MMP-1 i sinteze kolagena u starim fibroblastima (Slika 4B). Prijavljeno je da sekretorni fenotip povezan sa starenjem (SASP) u kojem starenje ćelije luče specifične proinflamatorne faktore, faktore rasta i proteolitičke enzime doprinosi nastanku i napredovanju bolesti povezanih sa starenjem [17–19]. Uočili smo efekat ATC-a na SASP, posebno na proinflamatorne citokine kao što su IL-1 , IL_6 i IL-8. Kao što je prikazano na slici 4C, ATC je smanjio nivoe ekspresije IL-1, IL-6 i IL-8 izazvanog starenjem. Ovo sugerira da ATC može ispoljiti efekat protiv starenja kroz supresiju SASP-a.

3. Diskusija

Stareće stanice prolaze kroz karakteristične morfološke promjene koje uključuju povećanu i često nepravilnu nuklearnu i kromatinsku reorganizaciju. Kada je starenje izazvano oštećenjem DNK, smanjenjem replikacije ili ekspresijom onkogena, Lamin B1 se prvenstveno gubi. Različiti unutrašnji ili vanjski stresori mogu pokrenuti put odgovora na oštećenje DNK (DDR) kako bi se aktivirao put p53 i/ili p16INK4A. p16INK4A može inaktivirati Cdk4/6, rezultirati akumulacijom fosforiliranog pRb, poremetiti regulaciju E2F transkripcionog faktora i inducirati zaustavljanje ili starenje ćelijskog ciklusa [20,21]. Povećana proizvodnja reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) koje uglavnom proizvode disfunkcionalne mitohondrije može dovesti do ćelijskog starenja putem oštećenja DNK i transaktivacije signalnih puteva starenja, uključujući p53, p16INK4A i p21Waf1/Cip1 [22].

U ovoj studiji smo otkrili da je ekspresija nc886 smanjena sa povećanjem broja prolaza i da je pojačana regulacija ekspresije nc886 ublažila ćelijsko starenje posredovanjem LaminB1, p16INK4A, p21Waf1/Cip1 i ROS proizvodnje. nc886 se transkribuje pomoću RNA polimeraze III (Pol III) i utišava se hipermetilacijom CpG DNK kod mnogih maligniteta [8]. Primetili smo da je ekspresija nc886 smanjena sa metilacijom CpG ostrva u senescentnim fibroblastima. Ovaj rezultat ukazuje da hipermetilacija CpG ostrva narušava funkcionalnost nc886 kao supresora ćelijskog starenja.

Specifični putevi ekspresije gena na koje utiče nc886 su nejasni. Vjerovatno će uključiti prethodno prijavljene za druge ncRNA. nc886 može igrati kritičnu ulogu u ćelijskom starenju putem direktnog ili indirektnog posredovanja signalnog puta starenja na nivoima strukture hromatina, aktivnosti transkripcionog faktora, post-transkripcione i posttranslacione regulacije gena [23]. Na primjer, nc886 može posredovati u starenju na putu progresije ćelijskog ciklusa.

Prijavljeno je da je AK156230 kao ncRNA povezan sa indukcijom replikacijskog starenja fibroblasta kroz svoju ulogu u autofagiji i progresiji ćelijskog ciklusa. Smanjenje regulacije AK156230 izazvalo je ćelije da pokažu odgovore na starenje aktivacijom p53 i p21 uz smanjenje ciklin zavisne kinaze 1 (CDK1) [24]. ncRNA1 (SAL-RNA1), MALAT1 i MIAT povezani sa starenjem poznati su kao negativni regulatori ćelijskog starenja. Oni su smanjeni u senescentnim fibroblastima. Smanjenje regulacije ovih gena može dovesti do povećanja markera starenja kao što su SAgal, p16, p21 i p53 [25]. Efekat MALAT1 na ćelijsko starenje postignut je smanjenjem onkogenog transkripcionog faktora b-Myb/Mybl2.

Iako je ekspresija različitih ncRNA pogođena tokom starenja, samo nekoliko je funkcionalno uključeno u starenje. Budući da je lokalizacija ncRNA važna za razumijevanje mehanizama uključenih u funkciju, nuklearne i citoplazmatske ncRNA se razmatraju odvojeno kada se opisuju molekularni mehanizmi koji utiču na starenje [26]. ncRNA koja se nalazi u citoplazmi može funkcionirati kao regulator translacije kroz uparivanje baza sa ciljnom mRNA [27]. ncRNA može uticati na nivoe ekspresije proteina povećanjem ili smanjenjem stabilnosti mRNA [28].

Na primjer, tokom starenja izazvanog RAS-om, citoplazmatski UCA1 doprinosi stabilizaciji mRNA p16 sekvestriranjem hnRNPA1 [29]. nc886 sadrži RNA-aktivirano mesto vezivanja protein kinaze (PKR). Vezanje PKR–nc886 može inhibirati aktivnost PKR. PKR, citoplazmatski receptor za dvolančanu RNA (dsRNA), reguliran je serin/treonin protein kinazom koja se aktivira infekcijom, citokinima, oksidativnim stresom i zračenjem (uključujući UV), što dovodi do naknadne indukcije upale i apoptoze [20]. ,21] [30,31]. nc886 se vezuje za PKR sa afinitetom uporedivim sa dsRNA i sprečava aktiviranje PKR. Nokdaun nc886 rezultira fosforilacijom podjedinice eukariotskog inicijacionog faktora 2 (eIF2) putem PKR puta, što uzrokuje ćelijsku smrt i inhibira globalnu sintezu ćelijskih proteina. Prijavljeno je da je proizvodnja COX-2, IL-8 i MMP od strane TNF-a posredovana PKR putem u ljudskim hondrocitima [32].

U prethodnoj studiji, također smo pokazali da se upala izazvana UVB zrakama može regulisati putem nc886-PKR puta u keratinocitima [10]. Štaviše, PKR je povezan s ozljedom izazvanom oksidativnim stresom u neonatalnim srčanim miocitima. Inhibicija PKR štiti od H2O2-indukovane ozljede slabljenjem apoptoze i upale [33]. Upala i oksidativni stres glavni su faktori koji indukuju proces starenja. Dakle, PKR put može posredovati u ćelijskom starenju fibroblasta induciranom deplecijom nc886. Da bi se razjasnio detaljan regulatorni mehanizam uključen u efekat nc886 na ćelijsko starenje fibroblasta, potrebne su dalje studije.

Efekti protiv starenja ekstrakta zelenog čaja su naširoko prijavljeni u prethodnim studijama. Antioksidativno i protuupalno djelovanje zelenog čaja dobro su poznati mehanizmi koji doprinose njegovom djelovanju protiv starenja. U preliminarnom testu, otkrili smo da je ATC značajno povećao ekspresiju nc886 za više od 70 posto etanolnog ekstrakta zelenog čaja (Slika S1A u dodatku). Ovaj rezultat sugerira da koncentrirani katehini uključujući 3" Me-EGCG mogu pripisati povećanju regulacije ekspresije nc886. Da bismo utvrdili da li nc886 stimulirajući agens može spriječiti ćelijsko starenje, primijetili smo efekat ATC-a na stare fibroblaste. ATC je povećao ekspresiju nc886 inhibiranje nivoa metilacije gena nc886 u senescentnim fibroblastima (Slika 3B, C). ATC je također ublažio ćelijsko starenje posredovanjem senescentnih biomarkera kao što su SA- -gal aktivnost, LaminB1, p16INK4A i p21Wafure1/Cip3E1 ( ). Štaviše, ATC je obnovio povećanu MMP-1 i smanjenu proizvodnju kolagena izazvanu ćelijskom starenjem (Slika 4B). SASP faktori neznatno variraju u zavisnosti od tipa ćelije i vrste stresa izazvanog starenjem, obično su poznati kao ciljni geni za NF-κB koji regulišu proinflamatorne citokine kao što su IL-6 i IL-8.

U ovoj studiji smo potvrdili da je povećana ekspresija IL-1, IL_6 i IL-8 u starim ćelijama potisnuta ATC-om (slika 4C). Ne možemo isključiti mogućnost da se poboljšanje efekta zelenog čaja na ćelijsko starenje postiže višestrukim mehanizmima, uključujući regulaciju nc886, antioksidaciju i anti-inflamaciju. Međutim, naši rezultati sugeriraju da povećani nc886 od strane ATC igra kritičnu ulogu u supresiji ćelijskog starenja, nakon čega utječe na ECM proizvodnju fibroblasta.

4. Materijali i metode

4.1. Priprema ATC-a

Osušeni listovi zelenog čaja (Camellia sinensis var. sinensis cv. Jangwon No. 3) korišćeni za ovu studiju dobijeni su iz biljaka čaja uzgajanih u Dolsongi čajnoj bašti (33◦16023.900 N 126◦28058.300 E), Jeju, Južna Koreja. Suhi listovi čaja (170 g) su ekstrahovani sa 70 posto EtOH (v/v) na sobnoj temperaturi 16 h. Ekstrakt je zatim usitnjen u prah pomoću liofilizatora (TF10D, TEFIC BIOTECH, Xian, Kina). Da bi se pripremio ATC, ekstrakt EtOH je koncentriran desetostruko pomoću rotacionog isparivača i stavljen na kolonu napunjenu AB-8 smolom (unutrašnji prečnik 5 cm, dužina 45 cm). Eluiranje kolone rastvaračem je izvedeno sa 4 puta zapreminom sloja (BV) od 20 procenata, 30 procenata i 100 procenata EtOH (v/v). U ovoj studiji, zaostali rastvarači u koloni su uklonjeni vazdušnim kompresorom prije eluiranja. 30% EtOH eluat je koncentrisan dvadeset puta i nanesen na poliamidnu kolonu (unutrašnji prečnik 2,5 cm, dužina 40 cm). Poliamidna kolona je eluirana 5 puta BV od 10 posto i 100 posto EtOH. 100% EtOH eluat pažljivo je koncentriran i liofiliziran.

4.2. Ćelijska kultura i ćelijski tretman ATC-om

Ljudski dermalni fibroblasti (HDF) kupljeni su od ATCC (Manassas, VA, SAD). Ćelijska kultura je sprovedena u kontrolisanim uslovima na 37 ◦C sa 5 procenata CO2 koristeći Dulbecco modifikovani Eagleov medijum (WELGENE, Daegu, Koreja) sa dodatkom 10 procenata fetalnog goveđeg seruma (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) i 1 procenat penicilina -streptomicin (WELGENE, Daegu, Koreja). Ćelije su posađene u 6-ploče sa gustinom od 2 × 105 ćelija/ploči. Nakon postizanja 60 posto konfluencije, tretirani su naznačenom koncentracijom ATC-a 72 h.

4.3. SA- -Gal bojenje i analiza protočne citometrije

Ćelije su obojene pomoću SPiDER- -Gal (Dojindo, Kumamoto, Japan) prema uputstvima proizvođača. Ćelije su analizirane sa EVOS® FL Cell Imaging System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) i BD FACS Calibur protočnim citometrom (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, SAD).

4.4. Intracelularno ROS mjerenje

Proizvodnja intracelularnog ROS-a je praćena korištenjem C20,70 -dihlorodihidrofluorescein diacetata (H2DCFDA; Molecular Probes), fluorescentnog ROS indikatora. Ćelije su inkubirane sa H2DCFDA (5 µM) 30 minuta na 37 ◦C. Fluorescencija povezana sa ćelijama je detektovana protočnim citometrom BD FACS Calibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, SAD).

4.5. PCR u realnom vremenu i PCR specifičan za metilaciju

Ukupna RNK ekstrahirana je upotrebom TRIzola (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Kvantitativno mjerenje RNK je izvršeno pomoću Epoch mikroploče spektrofotometra (BioTek, Winooski, VT, USA). cDNK je sintetizovan korišćenjem am-fiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, SAD). Genomska DNK je ekstrahovana korišćenjem AccuPrep® kompleta za ekstrakciju genomske DNK (BIONEER, Daejeon, Koreja). Konverzija bisulfita je sprovedena korišćenjem EZ DNA metilacionog kompleta (Zymo Research, Kalifornija, SAD). Za izvođenje qRT-PCR korišćeni su AMPIGENE® cDNA Synthesis Kit (Enzo Life Sciences Inc., Farming-dale, NY, SAD) i ABI7500 PCR sistem u realnom vremenu (Ambion Inc, Austin, TX, SAD). Prajmer sekvence korištene u ovoj studiji opisane su u Tabeli 1.

4.6. Test laktat dehidrogenaze

LDH test je korišten za određivanje citotoksičnosti mjerenjem aktivnosti laktat dehidrogenaze (LDH) oslobođene iz oštećenih stanica. Test je izveden korišćenjem kompleta za ispitivanje citotoksičnosti LDH WST (Enzo life sciences, Farmingdale, NY, SAD) prema uputstvima proizvođača.

4.7. Transfekcija DNK za prekomjernu ekspresiju nc886 i transfekcija siRNA za nc886 Knockdown

Da bi se dobila DNK za prekomernu ekspresiju nc886 u ćelijama, DNK je amplifikovana sa AccuPower® PCR PreMix-om (BIONEER, Daejeon, Koreja) koristeći genomsku DNK HDF-a kao šablon i sledeće prajmere opisane u Tabeli 2.

Amplificirana DNK je pročišćena korištenjem QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Hilden, Njemačka). Prečišćena DNK je transficirana sa LipofectamineTM 3000 reagensom (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Da bi se srušio nc886, ćelije su transficirane anti-oligos (si-ctrl i si-nc886) u koncentraciji od 250 pM koristeći Lipofectamine™ RNAiMAX reagens (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD).

4.8. Western blotting

Ćelijski lizati su pripremljeni sa PRO-PREP™ rastvorom za ekstrakciju proteina (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi do, Koreja). Ukupni proteini su odvojeni NuPAGE sistemom elektroforeze (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) i prebačeni na poliviniliden difluorid (PVDF) membrane. Imunoblotiranje je izvedeno korištenjem primarnog antitijela protiv p16INK4A, p21Waf1/Cip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD), MMP1, Col1A2 i -actin (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, SAD). Skeniranje denzitometrijskih vrijednosti traka analizirane su korištenjem ImageJ, verzija softvera 1.52a (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.9. Enzimski imunosorbentni test

Nakon naznačene inkubacije, kolagen (Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan) i MMP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) u supernatantu kulture su izmjereni pomoću enzimskog imunosorbentnog testa (ELISA) komplet prema uputama proizvođača.

4.10. Statistička analiza

Svi rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Razlike između ove dvije grupe procijenjene su t-testom ili analizom varijanse (ANOVA) koristeći GraphPad Prism. Statistička značajnost je označena kao p < 0.05 ili p < 0,01.

5. Zaključci

U zaključku, regulacija ekspresije nc886 može biti potencijalna meta ćelijskog starenja u fibroblastima, a ATC može biti moćan epigenetski sastojak protiv starenja.

Doprinosi autora:

Konceptualizacija, YK, KH i EJ; metodologija YK, HJ, N.-HP i K.-SL; kuriranje podataka, YK, HJ i EC; istraga, YK, HJ, EC, K.-SL, N.-HP i EJ; administracija projekta, WP, DP i EJ; resursi, WP i DP; nadzor, DP i EJ; pisanje— originalni nacrt, YK; pisanje—recenzija i uređivanje, N.-HP, KH, WP, DP i EJ Svi autori su pročitali i pristali na objavljenu verziju rukopisa.

finansiranje:

Ovo istraživanje nije dobilo vanjsko finansiranje.

Izjava institucionalnog odbora za reviziju:

Nije primjenjivo.

Izjava o informiranom pristanku:

Nije primjenjivo.

Izjava o dostupnosti podataka:

Podaci će biti dostupni na zahtjev.

Sukobi interesa:

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Reference

1. Campisi, J.; d'Adda di Fagagna, F. Ćelijsko starenje: Kada se loše stvari dogode dobrim ćelijama. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007, 8, 729–740. [CrossRef] [PubMed]

2. Kapoor, VK; Dureja, J. Starenje: pristupi njegovom kontroli. Drug Discov. Today Ther. Strategija. 2010, 7, 43–44. [CrossRef]

3. Fisher, GJ; Kang, S.; Varani, J.; Bata-Csorgo, Z.; Wan, Y.; Datta, S.; Voorhees, JJ Mehanizmi fotostarenja i hronološkog starenja kože. Arch. Derm. 2002, 138, 1462–1470. [CrossRef]

4. Tigges, J.; Krutmann, J.; Fritsche, E.; Haendeler, J.; Schaal, H.; Fischer, JW; Kalfalah, F.; Reinke, H.; Reifenberger, G.; Stuhler, K.; et al. Obilježja starenja fibroblasta. Mech. Aging Dev. 2014, 138, 26–44. [CrossRef]

5. Brunet, A.; Berger, SL Epigenetika starenja i bolesti povezanih sa starenjem. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S17–S20. [CrossRef] [PubMed]

6. Moskalev, AA; Aliper, AM; Smit-McBride, Z.; Buzdin, A.; Zhavoronkov, A. Genetika i epigenetika starenja i dugovječnosti. Cell Cycle 2014, 13, 1063–1077. [CrossRef]

7. Lee, K.; Kunkeaw, N.; Jeon, SH; Lee, I.; Johnson, BiH; Kang, GY; Bang, JY; Park, HS; Leelayuwat, C.; Lee, YS Prekursor miR-886, nova nekodirajuća RNA potisnuta kod raka, povezuje se sa PKR i modulira njegovu aktivnost. RNA 2011, 17, 1076–1089. [CrossRef] [PubMed]

8. Park, JL; Lee, YS; Song, MJ; Hong, SH; Ahn, JH; Seo, EH; Shin, SP; Lee, SJ; Johnson, BiH; Stampfer, MR; et al. Epigenetska regulacija transkripcija RNA polimeraze III u ranoj tumorigenezi dojke. Oncogene 2017, 36, 6793–6804. [CrossRef] [PubMed]

9. Lee, KS; Shin, S.; Cho, E.; Im, WK; Jeon, SH; Kim, Y.; Park, D.; Frechet, M.; Čajra, H.; Jung, E. nc886, nekodirajuća RNA, inhibira ekspresiju MMP-9 i COX-2 izazvane UVB-om putem PKR puta u ljudskim keratinocitima. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2019, 512, 647–652. [CrossRef] [PubMed]

10. Lee, KS; Cho, E.; Weon, JB; Park, D.; Frechet, M.; Čajra, H.; Jung, E. Inhibicija UVB-indukovane inflamacije ekstraktom Laminaria japonica putem regulacije nc886-PKR puta. Nutrients 2020, 12, 1958. [CrossRef]

11. Ji, HG; Lee, YR; Lee, MS; Hwang, KH; Kim, EH; Park, JS; Hong, YS Identifikacija epigalokatehin-3-O-(3-Ometil)-galata (EGCG300Me) i profila aminokiselina u različitim sortama čaja (Camellia sinensis L.). Data Brief. 2017, 14, 607–611. [CrossRef]

12. Kim, E.; Han, SY; Hwang, K.; Kim, D.; Kim, EM; Hossain, MA; Kim, JH; Cho, JY Antioksidativni i citoprotektivni efekti (-)-epigalokatehin-3-(300-O-metil) galata. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3993. [CrossRef]

13. Huang, LH; Liu, CY; Wang, LY; Huang, CJ; Hsu, CH Efekti ekstrakta zelenog čaja na žene sa prekomjernom težinom i gojaznost s visokim nivoom lipoproteina niske gustine (LDL-C): randomizirano, dvostruko slijepo i unakrsno kontrolirano kliničko ispitivanje. BMC Complement. Altern. Med. 2018, 18, 294. [CrossRef] [PubMed]

14. Soares, S.; Soares, S.; Brandao, E.; Guerreiro, C.; Mateus, N.; de Freitas, V. Oralne interakcije između ekstrakta flavanola zelenog čaja i ekstrakta antocijanina crvenog vina korištenjem novog modela baziranog na ćelijama: Uvid u učinak različitih oralnih epitela. Sci. Rep. 2020, 10, 12638. [CrossRef] [PubMed]

15. Levi, N.; Papizmadov, N.; Solomonov, I.; Sagi, I.; Krizhanovsky, V. ECM put starenja u starenju: Komponente i modifikatori. FEBS J. 2020, 287, 2636–2646. [CrossRef] [PubMed]

16. Pitozzi, V.; Mocali, A.; Laurenzana, A.; Giannoni, E.; Cifola, I.; Battaglia, C.; Chiarugi, P.; Dolara, P.; Giovannelli, L. Liječenje hroničnim resveratrolom poboljšava ćelijsku adheziju i ublažava inflamatorni fenotip u starim ljudskim fibroblastima. J. Gerontol. Ser. 2013, 68, 371–381. [CrossRef] [PubMed]

17. Coppe, JP; Patil, CK; Rodier, F.; Sun, Y.; Munoz, DP; Goldstein, J.; Nelson, PS; Desprez, PY; Campisi, J. Sekretorni fenotipovi povezani sa starenjem otkrivaju ćelijske neautonomne funkcije onkogenog RAS-a i supresora tumora p53. PLoS Biol. 2008, 6, 2853–2868. [CrossRef]

18. Tchkonia, T.; Zhu, Y.; van Deursen, J.; Campisi, J.; Kirkland, JL Ćelijsko starenje i fenotip sekrecije starenja: Terapijske mogućnosti. J. Clin. Investig. 2013, 123, 966–972. [CrossRef] [PubMed]

19. Munoz-Espin, D.; Serrano, M. Ćelijsko starenje: od fiziologije do patologije. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014, 15, 482–496. [CrossRef]

20. Lagger, G.; O'Carroll, D.; Rembold, M.; Khier, H.; Tischler, J.; Weitzer, G.; Schuettengruber, B.; Hauser, C.; Brunmeir, R.; Jenuwein, T.; et al. Bitna funkcija histon deacetilaze 1 u kontroli proliferacije i potiskivanju CDK inhibitora. EMBO J. 2002, 21, 2672–2681. [CrossRef] [PubMed]

21. Freitas-Rodriguez, S.; Folgueras, AR; Lopez-Otin, C. Uloga matriksnih metaloproteinaza u starenju: remodeliranje tkiva i dalje. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 2017, 1864, 2015–2025. [CrossRef]

22. Victorelli, S.; Passos, JF Detekcija vrsta reaktivnog kiseonika u starim ćelijama. Metode Mol. Biol 2019, 1896, 21–29. [PubMed]

23. Puvvula, PK LncRNAs Regulatory Networks in Cellular Senescence. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2615. [CrossRef] [PubMed]

24. Chen, YN; Cai, MY; Xu, S.; Meng, M.; Ren, X.; Yang, JW; Dong, YQ; Liu, X.; Yang, JM; Xiong, XD Identifikacija lncRNA, AK156230, kao novog regulatora ćelijskog starenja u embrionalnim fibroblastima miša. Oncotarget 2016, 7, 52673–52684. [CrossRef] [PubMed]

25. Abdelmohsen, K.; Panda, A.; Kang, MJ; Xu, J.; Selimyan, R.; Yoon, JH; Martindale, JL; De, S.; Drvo, WH, 3.; Becker, KG; et al. lncRNA povezane sa starenjem: duge nekodirajuće RNA povezane sa starenjem. Aging Cell 2013, 12, 890–900. [CrossRef]

26. Montes, M.; Lund, AH Nove uloge lncRNA u starenju. FEBS J. 2016, 283, 2414–2426. [CrossRef] [PubMed]

27. Carrieri, C.; Cimatti, L.; Biagioli, M.; Beugnet, A.; Zucchelli, S.; Fedele, S.; Pesce, E.; Ferrer, I.; Collavin, L.; Santoro, C.; et al. Duga nekodirajuća antisens RNK kontroliše translaciju Uchl1 kroz ugrađeno ponavljanje SINEB2. Nature 2012, 491, 454–457. [CrossRef]

28. Kretz, M.; Siprashvili, Z.; Chu, C.; Webster, DE; Zehnder, A.; Qu, K.; Lee, CS; Flockhart, RJ; Groff, AF; Chow, J.; et al. Kontrola diferencijacije somatskog tkiva dugom nekodirajućom RNK TINCR. Nature 2013, 493, 231–235. [CrossRef] [PubMed]

29. Kumar, PP; Emechebe, U.; Smith, R.; Franklin, S.; Moore, B.; Yandell, M.; Lessnick, SL; Moon, AM Koordinirana kontrola starenja pomoću lncRNA i novog T-box3 korepresorskog kompleksa. Elife 2014, 3, e02805. [CrossRef]

30. Freund, A.; Laberge, RM; Demaria, M.; Campisi, J. Lamin Gubitak B1 je biomarker povezan sa starenjem. Mol. Biol. Cell 2012, 23, 2066–2075. [CrossRef]

31. Gal-Ben-Ari, S.; Barrera, I.; Ehrlich, M.; Rosenblum, K. PKR: Kinase za pamćenje. Front. Mol. Neurosci. 2018, 11, 480. [CrossRef] [PubMed]

32. Ma, CH; Wu, CH; Jou, IM; Tu, YK; Hung, CH; Hsieh, PL; Tsai, KL PKR aktivacija uzrokuje upalu i lučenje MMP-13 u ljudskim degeneriranim zglobnim hondrocitima. Redox Biol. 2018, 14, 72–81. [CrossRef] [PubMed]

33. Wang, Y.; Muškarci, M.; Xie, B.; Shan, J.; Wang, C.; Liu, J.; Zheng, H.; Yang, W.; Xue, S.; Guo, C. Inhibicija PKR štiti od H2O2 -indukovane ozljede na neonatalnim srčanim miocitima slabljenjem apoptoze i upale. Sci. Rep. 2016, 6, 38753–38763. [CrossRef] [PubMed]

Yuna Kim 1 , Hyanggi Ji 1 , Eunae Cho 1 , Nok-Hyun Park 2 , Kyeonghwan Hwang 2 , Wonseok Park 2 , Kwang-Soo Lee 1 , Deokhoon Park 1 i Eunsun Jung 1,*.

1 Biospectrum Life Science Institute, A-1805, U-TOWER, Yongin-si 16827, Koreja; bioyn@biospectrum.com (YK); biocr@biospectrum.com (HJ); biozr@biospectrum.com (EC); bioyc@biospectrum.com (K.-SL); pdh@biospectrum.com (DP)

2 Odjel za osnovna istraživanja i inovacije, Centar za istraživanje i razvoj Amorepacific Corporation, Youngin-si 17074, Koreja; aquareve@amorepacific.com (N.-HP); khhwang@amorepacific.com (KH); wspark@amorepacific.com (WP)

* Correspondence: bioso@biospectrum.com

For more information:1950477648@nn.com