Nanozyme Hydrogel za pojačano stvaranje alkil radikala i moćnu antitumorsku terapiju†

Alkilni radikali (Rc), koji se ne oslanjaju na stvaranje kisika kao uzrokćelijski stres, primijenjeni su utretman tumora, ali velika količina glutationa (GSH) u tumorskim stanicama reagira s alkil radikalima, čimesmanjujući njihov antitumorski efekat. U ovoj studiji, poboljšani sistem generisanja alkil radikala koji reaguje nablisko infracrveno svetloje dizajniran. Alkilni radikal okidač 2,20 -azobis[2-(2-imidazolin-2-il) propan]-dihidrohlorid (AIPH) i enzim pirit (FeS2) su kapsulirani u agarozni hidrogel za pripremu AIPH–FeS2–hidrogel (AFH) sistem. FeS2 se može koristiti kao fototermalni agens za pretvaranje bliske infracrvene svjetlosne energije u toplinsku energiju, što dovodi do rastvaranja hidrogela. AIPH se istovremeno inducira da proizvodi alkil radikale. FeS2 se takođe može koristiti kaopojačivač oksidativnog stresaza smanjenje intracelularnog sadržaja GSH, čime se pojačava terapeutski učinak alkil radikala. Na kraju, slobodni radikali nezavisni od kiseonika koje stvara AFH sistem pod bliskim infracrvenim laserskim zračenjem i fototermalnim tretmanom moguubija ćelije rakakroz sinergijuoksidacija/fototermalni efekat. AFH sistem razvijen ovdje pruža nove uvide u poboljšanje terapeutskog efekta alkil radikala.

KLIKNITE OVDJE DA ZNATE KAKO CISTANCHE ZA PROTIV RAKA

Uvod

Poslednjih godina, tretmani zasnovani na slobodnim radikalima kao što je fotodinamička terapija, tako da nedinamička terapija i elektrodinamička terapija postali su popularni izbori za lečenje raka dojke.1–3 Vanjski stimulansi (laser, ultrazvuk, električna polja) potiču proizvodnju reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) koje induciraju ćelijsku smrt uzrokujući ozbiljno oksidativno oštećenje ili disfunkciju ćelijskog metabolizma.4–6 Nažalost, okruženje hipoksičnog tumora i brza proliferacija tumorskih ćelija smanjuju terapijske rezultate takvih tretmana koji se oslanjaju na proizvodnju ROS, posebno u tretman solidnih tumora.7–10 Alkilni radikali su nova vrsta slobodnih radikala koji ne zavise od stvaranja kiseonika da bi ubili ćelije i pokazali su se efikasnim u lečenju tumora u normoksičnim i hipoksičnim sredinama.11 Oslobođeni alkil radikali mogu inducirati apoptozu ćelija raka povećanjem oksidativnog stresa, što dovodi do oštećenja ćelijskih lipida i DNK. Kao tipičan pokretač slobodnih radikala, 2,20 -azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propan]-dihidroklorid (AIPH) može generirati alkil radikale na visokim temperaturama. 12 To čini čak i u nedostatku kiseonika. Stvoreni slobodni radikali su toksični za ćelije i odmah će oksidirati ćelijske elemente ili će stupiti u interakciju s kisikom kako bi se proizvele sekundarne toksične tvari.13 Čak iu hipoksičnom tumorskom mikrookruženju, AIPH može proizvesti alkil radikale kako bi povećao intracelularni lipidni hidroperoksid i dalje pokrenuo apoptozu tumorskih stanica.14 Sve ovo ukazuje da je Rc obećavajući lijek za liječenje raka.

Svetlost ili toplota se koriste kao spoljašnji stimulans u fototermalnoj terapiji.15–17 Fototermalna terapija (PTT) zasnovana na zračenju laserom blizu infracrvenog (NIR) lasera se koristi za sprečavanje agregacije tumorskih ćelija; oslanja se na lokalne termalne efekte za uklanjanje tumora.18–20 Nekoliko fototermalnih agenasa (PTA) kao što su nanokristali zlata i molibden disulfid se koriste u kombinaciji sa AIPH za oslobađanje alkil radikala kao odgovor na infracrveno lasersko zračenje.19,21–23 Međutim , tumorsko mikrookruženje (TME) obično ima visok nivo ekspresije glutationa (GSH) u solidnim tumorima jer GSH igra važnu ulogu u otporu radioterapiji kroz spontanu reakciju ili reakciju kataliziranu GSH S transferazom sa ksenogenom.24,25 Osim toga, kao redukciono sredstvo, GSH može direktno ukloniti alkil radikale.21,26 Ovo smanjuje efikasnost terapija zasnovanih na alkil radikalima. Nano-enzim pirita (FeS2), kao novi fototermalni nanomaterijal, ne samo da ima dobar fototermalni efekat pod NIR svjetlošću, već ima i nano-enzimsku aktivnost.27 FeS2 nanaza je pokazala sličnu aktivnost kao glutation oksidaza (GSH OXD), oksidirajući GSH u oksidirani glutation (GSSG).28 U TME je utvrđeno da smanjenje GSH narušava REDOX ravnotežu ćelija i uzrokuje oksidativni stres.29 Stoga se očekuje da će FeS2 postići dobar sinergistički efekat sa AIPH.

Minimalno invazivni fotoreaktivni hidrogelovi su nedavno postali popularni kao platforma za kontrolirano oslobađanje lijeka.30–32 Hidrogeli se koaguliraju dok se ubrizgavaju u tumorsko tkivo i služe kao dugotrajni depo.33 Ovaj lokalni oblik primjene može se ponoviti nakon jednog injekcija. Osim toga, parametri kao što su snaga lasera i vrijeme zračenja mogu se modificirati kako bi se promijenila brzina oslobađanja lijeka, čime se proširuje primjenjivost ove metode liječenja.34,35 S obzirom na ove prednosti, pretpostavljeno je da upotreba hidrogelova za isporuku FeS2 i AIPH prema TME bi poboljšao efikasnost terapija zasnovanih na slobodnim radikalima.

U ovoj studiji je dizajnirana metoda koja koristi intratumoralnu isporuku injekcijskog hidrogela koji sadrži enzim FeS2 i inicijator slobodnih radikala AIPH. Prvo je pripremljen hibridni sistem AIPH-FeS2-hidrogela (AFH) ubacivanjem FeS2 nanočestica i AIPH u agarozni hidrogel. Hidrogel je čvrst na sobnoj temperaturi, a FeS2 i AIPH su inkapsulirani unutar njegove matrice. Jednom ozračen bliskim infracrvenim (NIR) svjetlom, FeS2 pretvara NIR svjetlosnu energiju u toplotnu energiju, što uzrokuje zagrijavanje AFH sistema, a zatim se hidrogel topi i oslobađa FeS2 i AIPH. Na visokim temperaturama, AIPH se razgrađuje i proizvodi alkil radikale. Nakon toga, enzim FeS2, koji oponaša aktivnost GSH-OXD, smanjuje intracelularni GSH sadržaj. Uništavanje GSH će podstaći ubijanje alkil radikala. Budući da AFH može dugo boraviti na mjestu tumora, AFH sistem može omogućiti preciznu kontrolu nad oslobađanjem alkil radikala promjenom intenziteta lasera i vremena zračenja. Konačno, slobodni radikali nezavisni od kiseonika koje generiše AFH sistem pod NIR zračenjem i fototermalnim tretmanom mogu sinergistički ubiti ćelije raka kroz sinergistički oksidacioni/fototermalni efekat, a rast tumora tokom ciklusa lečenja je dobro naseljen. Ukratko, AFH sistem dizajniran ovdje dalje pojačava terapeutski efekat AIPH promjenom redoks homeostaze (šema 1).

Rezultati i diskusija

Agarozni hidrogel niske tačke topljenja je korišćen za pripremu kompozitnog hidrogela koji sadrži FeS2 i AIPH. FeS2 je pomiješan sa vodenim rastvorom agaroze na 60 C, a zatim napunjen alkil radikalnim okidačem AIPH, nakon čega je uslijedilo brzo hlađenje na sobnu temperaturu. Tako je formirana AFH hidrogel matrica. Transmisiona elektronska mikroskopija je korištena za karakterizaciju morfologije FeS2 (slika 1A). FeS2 nanozim pokazao je morfologiju nalik sferi sa prosječnom veličinom čestica od oko 148 nm (slika S1†). UV-vis apsorpcioni spektri FeS2 (slika 1B) pokazali su da je FeS2 snažno apsorbovan u NIR opsegu na 808 nm. Ovo svojstvo čini FeS2 dobrim PTA. Fototermalni učinak enzima FeS2 pri različitim koncentracijama (0, 25, 50 i 100 mg mL 1 ) je proučavan zračenjem rastvora laserskim sistemom od 0,5 W cm 2 808 nm (slika 1C). Učinak zagrijavanja otopine bio je direktno proporcionalan koncentraciji FeS2. Temperatura rastvora od 100 mg mL 1 FeS2 porasla je za oko 17,5 C za samo 5 minuta laserskog zračenja, što pokazuje dobre fototermalne performanse FeS2. Skenirajuća elektronska mikroskopija je također pokazala da AFH hidrogel ima složenu mrežu strukture pora i distribucije veličine pora (slika 1D), što hidrogel čini pogodnim za punjenje lijekom za isporuku. Fototermalna stabilnost je takođe važan kriterijum za procenu kvaliteta PTA.36 Rastvor od 200 mg mL 1 FeS2 zagrevan je 808 nm NIR laserom 5 minuta, zatim je laser isključen i rastvor FeS2 je ostavljen da se ohladi prirodno na sobnu temperaturu. Ovaj proces je ponovljen nekoliko puta kako bi se procijenila fototermalna stabilnost FeS2 (slika 1E). Nije bilo očigledne promjene u krivulji grijanja svakog fototermalnog ciklusa, a uočena je samo mala razlika u vršnoj temperaturi postignutoj nakon 5 min ozračivanja, što potvrđuje fototermalnu stabilnost FeS2. Reološka analiza je također otkrila visok modul skladištenja pripremljenog hidrogela u čvrstom stanju na sobnoj temperaturi (slika 1F). Kako se temperatura povećavala, hidrogel se postepeno otapao i rastvorio, a modul skladištenja se postepeno smanjivao. Zatim je proveden eksperiment fototermalnog rastvaranja na FeS2 hidrogelu. Stvrdnuti AFH (FeS2 sadržan u hidrogelu) stavljen je u staklenu posudu koja je sadržavala deioniziranu vodu. Na sobnoj temperaturi, pripremljeni AFH hidrogel je zadržao svoj čvrst oblik, ali nakon 10 minuta zračenja laserom od 808 nm, hidrogel se skoro potpuno otopio, a nanomaterijal FeS2 je oslobođen i otopljen u vodi u staklenoj posudi (Sl. 1G). Termalni infracrveni snimač je takođe potvrdio značajno povećanje temperature AFH tokom zračenja (slika 1H). Rendgen fotoelektronska spektroskopija (XPS) spektar FeS2 nakon reakcije sa hidrogelom pokazala je da FeS2 sadrži Fe i S elemente (Sl. S2†). Kao što je prikazano na slici S3,† sadržaj GSH je značajno smanjen nakon koinkubacije FeS2 i GSH, ima pozitivnu korelaciju sa vremenom i koncentracijom. Nadalje, aktivnost FeS2 slična POD-u ovisila je o veličini. Nanozimi veličine 150 nm pokazali su veću aktivnost od onih veličine 280 i 687 nm (slika S4†).

Na osnovu karakteristika visokih performansi AFH-a, procijenjeni su njegovi antitumorski efekti. Prvobitno, fluorescein diacetat/propidijum jodid kit za bojenje živih/mrtvih ćelija korišćen je da se istraži efekat ubijanja pripremljenog AFH hidrogela u kombinaciji sa NIR zračenjem. PBS plus NIR grupa i samo AFH grupa pokazale su jaku zelenu fluorescenciju, dok AIPH jedva da je pokazao bilo kakav ubijajući efekat (slika 2A). Pripremili smo hidrogel koji sadrži samo FeS2 (FH) kako bismo provjerili rezultate relativnih eksperimenata. Pripremljen hidrogel koji je sadržavao samo FeS2 (FH) u kombinaciji sa NIR imao je umjereno ubijajuće djelovanje. Značajno je da je tretman AFH plus NIR imao najbolji citotoksični efekat.

Diklorofluorescein diacetatna sonda je korištena za otkrivanje sposobnosti AIPH da proizvodi ROS. AIPH je pokazao slabiju sposobnost da indukuje ROS u odsustvu laserskog zračenja, dok je FH napunjen FeS2 pokazao umereni stepen proizvodnje ROS nakon NIR zračenja (slika 2B). Jarko zelena fluorescencija uočena u grupi tretmana AFH plus NIR može se pripisati oslobađanju FeS2 i AIPH nakon laserskog zračenja (slika 2C). Nadalje, grupe AIPH i AIPH plus NIR pokazale su vrlo malo zelene fluorescencije (slika S5†). CCK-8 test je također pokazao iste rezultate. Vijabilnost ćelija AFH plus NIR grupe bila je oko 8,5 procenata, što se značajno razlikovalo od one u drugim grupama (slika 2D). Visoka temperatura će potaknuti razgradnju AIPH za proizvodnju alkil radikala. U isto vrijeme, FeS2 može ispoljiti GSH-OXD aktivnost kako bi smanjio intracelularni GSH. GSH, kao sveprisutni tripeptid koji sadrži tiol, sintetizira se iz svojih sastavnih aminokiselina (glutaminska kiselina, cistein i glicin) u mnogim stanicama. GSH se proizvodi u izobilju u različitim tipovima ćelija raka. GSH u ćelijama generalno postoji u redukovanom obliku, koji može da reaguje sa oksidirajućim supstancama kao što su alkilne grupe, dok se oksidira u svoj oksidovani oblik glutation disulde (GSSG), čime se smanjuje antitumorski efekat zasnovan na slobodnim radikalima.37 Smanjenje GSH će poremetiti redoks ravnotežu ćelija, izazvati oksidativni stres i na kraju dovesti do apoptoze ćelije.38 Ellmanov reagens je korišćen za testiranje sposobnosti svake grupe da iscrpi GSH. AFH kombinovana NIR grupa pokazala je najbolju sposobnost smanjenja GSH (slika 2E).

Šema 1 Nanozyme hidrogel za pojačano stvaranje alkil radikala i moćnu antitumorsku terapiju

Slika 1 (A) TEM slika FeS2. (B) UV-Vis-NIR spektar apsorpcije rastvora FeS2. (C) Krivulje zagrijavanja za različite koncentracije rastvora nanočestica FeS2 nakon laserskog zračenja na 808 nm (0.5 W cm 2) tokom 5 min. (D) SEM slika hidrogela. (E) Varijacija temperature rastvora FeS2 pod cikličkim laserskim zračenjem. (F) Reološke i temperaturne krive (crvena i crna, respektivno) za pripremljeni AFH kao odgovor na 0.5 W cm 2 808 nm lasersko zračenje. (G) Morfologija pripremljenog AFH prije i poslije 0,5 W cm 2 808 nm laserskog zračenja u trajanju od 10 minuta i (H) infracrvene termalne slike pripremljenog AFH nakon ozračivanja.

S obzirom na njegove dobre in vitro performanse kao enzima koji oponaša PTA i GSH OXD, efekat AFH na NIR konverziju svjetlosti u toplinu proučavan je in vivo. BALB/c miševima su supkutano ubrizgane 4T1 ćelije kako bi se formirali tumori. Slika 3A prikazuje krivu promjene temperature PBS grupe i AFH grupe nakon 808 nm NIR lasera 0,5 W cm 2 zračenja tokom 10 min. Temperatura grupe AFH se nakon zračenja povećala za oko 17,6 C, dok se temperatura PBS grupe jedva povećala. Visoka temperatura može promijeniti vlažnost ćelijske membrane tumora, čime se povećava permeabilnost ćelijske membrane, što zauzvrat uzrokuje termičko oštećenje proteina.39,40 Na kraju, ćelije raka gube sposobnost proliferacije. Zatim je procijenjena antitumorska aktivnost posredovana AFH kod miševa sa tumorom 4T1. Miševi koji nose tumor nasumično su podijeljeni u  pet grupa. Volumen tumora miševa u PBS plus NIR grupi i AIPH grupi se brzo povećao tokom dvonedeljnog perioda lečenja, a AFH grupa je pokazala blagi efekat supresora tumora (slika 3C). To je bilo zato što se agaroza sporo metabolizirala, a neki lijekovi su se polako oslobađali. AFH plus NIR grupa imala je najjači učinak na rast tumora. Tokom tretmana, volumen tumora kod miševa je značajno potisnut. Nakon perioda tretmana, miševi su žrtvovani, a tumori su izolovani i izmereni. Rezultati za težinu tumora bili su u skladu sa rezultatima za zapreminu tumora (slika 3D).

Važno je da tokom čitave studije nisu uočene promene u telesnoj težini u grupi koja je tretirana, što ukazuje da tretman nije izazvao značajnu sistemsku toksičnost kod miševa (slika S6†). Ovaj rezultat je veoma ohrabrujući jer iako su mnogi materijali pokazali dobre eksperimentalne rezultate, oni su također izazvali ozbiljne nuspojave, koje ozbiljno ometaju njihove kliničke izglede.41,42 20 ,70 - Diklororescin diacetat je korišten za mjerenje intra -generacija tumora ROS kod tretiranih miševa. Bojenje je značajno pojačano kod tumora podvrgnutih kombinovanoj terapiji AFH plus NIR (slika 3E). Povećana proizvodnja slobodnih radikala dovela je do poboljšanog terapeutskog efekta na životinjskom modelu. TUNEL i Ki{6}} analize bojenja su korištene za verifikaciju apoptoze i proliferacije ćelija (slika 3E). Tumorska tkiva u grupi AFH plus NIR bila su masivno nekrotična bez značajne proliferacije.

Slika 3 (A) Infracrvene termalne slike tumora nakon ozračivanja laserom od 808 nm (0.5 W cm 2) u trajanju od 10 min u naznačenim grupama tretmana. (B) Porast temperature kod miševa sa implantiranim 4T1 tumorima nakon laserskog zračenja od 808 nm (0,5 W cm 2 ) u trajanju od 10 minuta u naznačenim grupama za liječenje. (C) Volumen tumora se mijenja tokom vremena u grupama tretiranim prema indikacijama. (D) Prosječne vrijednosti težine tumora povezane s indiciranim tretmanima. (E) ROS, Ki{13}} i TUNEL obojeni dijelovi tumora iz navedenih grupa za liječenje. **P < 0,01, ***P < 0,005; Studentov t-test.

Nakon tretmana vitalni organi (srce, jetra, slezena, pluća i bubrezi) nisu imali upalu ili oštećenje. Indeksi jetre i bubrega bili su normalni (sl. 4A–D i S7†). Sveobuhvatni in vivo eksperimentalni podaci pokazuju da sinergistička AFH i PTT terapija ima dobre terapeutske efekte i biokompatibilnost. Ima dobre izglede za kliničku medicinsku primjenu u budućnosti.

Slika 4 Rezultat in vivo sigurnosnih eksperimenata. Biohemijski podaci krvi uključujući markere funkcije bubrega: (A) markeri funkcije jetre: CRE, (B) BUN i (C) ALT nakon različitih tretmana. (D) Rezultati histopatološke analize (H&E obojene slike) glavnih organa, srca, pluća, jetre, bubrega i slezene, miševa koji su bili izloženi različitim tretmanima 16 dana nakon injekcije. Skala bar: 100 mm.

Zaključak

Dizajnirali smo injekcioni foto-reaktivni hidrogel koji može istovremeno postići terapiju slobodnih radikala i PTT kapsuliranjem enzima FeS2 i izvora alkil radikala AIPH u agarozni hidrogel. Pod laserskim zračenjem od 808 nm, PTA FeS2 pospješuje zagrijavanje AFH sistema i dovodi do oslobađanja AIPH i njegovog razlaganja kako bi se proizveli alkil radikali. U isto vrijeme, FeS2 može smanjiti intracelularni GSH sadržaj, čime dodatno uništava redoks homeostazu. Brzina rastvaranja hidrogela može se mijenjati parametrima kao što su gustina snage lasera i veličina mrlje. I in vivo i in vitro studije su pokazale da kombinacija AFH sa NIR zračenjem može postići moćne efekte ubijanja tumora sa beznačajnim štetnim efektima. Hidrogel sistem dizajniran u ovoj studiji pruža strategiju za poboljšanje terapijskih sistema zasnovanih na alkil radikalima.

Reference

1 D. Zhu, J. Zhang, G. Luo, Y. Duo i BZ Tang,Adv. Sci., 2021, e2004769.

2 C. Huang, S. Ding, W. Jiang i F.-B. Wang,Nanoskala, 2021, 13, 4512–4518.

3 J. Wu, Y. Qu, K. Shi, B. Chu, Y. Jia, X. Xiao, Q. He i Z. Qian,Brada. Chem. Lett., 2018, 29, 1819–1823.

4 S. Ning, Y. Zheng, K. Qiao, G. Li, Q. Bai i S. Xu,J. Nanobiotechnol., 2021, 19, 344. 

5 D. Zhu, T. Zhang, Y. Li, C. Huang, M. Suo, L. Xia, Y. Xu, G. Li i BZ Tang,Biomaterijali, 2022, 283, 121462. 

6 D. Zhu, R. Ling, H. Chen, M. Lyu, H. Qian, K. Wu, G. Li i X. Wang,Nano Res., 2022, DOI:10.1007/s12274-022-4359-6. 

7 D. Zhu, M. Lyu, W. Jiang, M. Suo, Q. Huang i K. Li,J. Mater. Chem. B, 2020, 

8, 5312–5319. 8 H. Ranji-Burachaloo, PA Gurr, DE Dunstan i GG Qiao,ACS Nano, 2018, 12, 11819–11837. 

9 D. Zhu, Z. Liu, Y. Li, Q. Huang, L. Xia i K. Li,Biomaterijali, 2021, 274, 120894. 

10 X. Li, R. Luo, X. Liang, Q. Wu i C. Gong,Brada. Chem. Lett., 2021, DOI:10.1016/j.cclet.2021.11.048.