Nano Milk Protein-Mucilage Complexes: Characterization And Anticancer Effect Part 2

Za više informacija kontaktirajtetina.xiang@wecistanche.com

Kliknite na link da biste naučili 1. dio:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049142.html

3. Materijali i metode

3.1. Materijali

Plantago ovata (subgoal) husk i zreo plod Ziziphus Spina-Christi(Nabeq)kupljeni su od Gize, Egipat; Mliječni proteinski koncentrat (MP,81,3% proteina) je kupljen od kompanije Fonterra(Auckland, Novi Zeland). Kazini i proteini sirute u MPC-u su uglavnom u njihovom domorodašnom i sličnom, micelarnom obliku kao oni koji se mogu naći u mlijeku. Sve korištene hemikalije bile su analitičke čistoće.

3.2.Priprema Isabgol Husk Mucilage (IHM) i Nabeg Mucilage (NabM)

Izabgolska mucilaža huska (IHM) i Nabeq mucilage (NabM)su pripremljene prema metodi koju je opisao El-Maksoud et al. [5]. Nakratko je pripremljena suspenzija isabgolske huske rastvaranjem 1,2 g u 100 mL destilovane vode i pročišćena otopinom acetona. Dobijeni gel se čuvao u hladnjaku (4-5°C) do korišćenja.

Za NabM su sazreli plodovi Nabeqa temeljito oprani vodom iz slavine kako bi se uklonila prljavština. Svježi plodovi su odvojeni od sejma i pomiješani sa destilovanom vodom u omjeru 1:10(w/v) nakon što su izrezani na male komadiće. Smjesa je pomiješana pomoću laboratorijskog miksera (Toshiba Mixie, Japan) i dozvoljeno je da stoji 12 h u hladnjaku.

Mucilaginozan ekstrakt je tada centrifugiran na 2000 o/min 30 min i filtriran kroz muslin krpu. Rezultujući viskozni rastvorljivi mucilaž je bio precipitiran acetonom. Dobivena sirova mucilaža je bila uskladištena u hladnjaku dok se nije koristila.

U analitičke svrhe, mucilaža je sušena u zračnoj pećnici na 40°Cand ground koristeći kuglasti mlin MM400(Retsch, Njemačka). Izmjeren je hemijski sastav psyllium husk mucilage puder (PHMP) i Nabeq mucilage puder (NabMP). Vlaga, proteini, masti, pepeo, sirova vlakna, i ukupan sadržaj ugljikohidrata je bio 8,49, 0,34,0,21,2,13,1,53,i87,44% za PHMP i 9,18,4,72,2,05,2,69,1,70,odnosno 78,26% za NabMP. Rezultantni prah se čuvao na hladnoj temperaturi (4-5°C) do daljnje analize.

Kliknite da biste saznali više informacija

3.3. Priprema mliječnih proteinsko-mucilažnih kompleksa(MPMC)

Kompleksi mliječnih proteina (MP) sa IHM-om i NabM-om su pripremljeni prema Morr et al.uz neke modifikacije [44]. Koncentrat mliječnih proteina rekonstituiran je u destilovanoj vodi(10%). Rezultantni mliječni proteinski koloid je pomiješan sa IHM i NabM u omjeru 1:3 (o/o). PH smjese je podešen na 10 i ostavljen da stoji 10 min. Nakon toga, pH je spuštena na 3,5 koristeći 0,1 N HCl i otišla još 10 min. PH je tada podešen na pH 4,6 koristeći 0,5 M NaOH za prikupljanje MPMCby filtracije na filter papiru: MP, kao i rezultat MPMC, sušeni su liofilizacijom na -45°CC za 24h koristeći Novalyphe-NL500 liofilizer, Savant Instruments, Holbrook, NY, USA.

3.4. Fizikohemičke i funkcionalne karakteristike

3.4.1.pH Mjerenje

PH rezultujućih proizvoda pri 10% otopini izmjeren je pomoću kalibriranog pH mjerača (HANNA, HI 902 m, Njemačka).

3.4.2.Određivanje bulk Density (BD), Tapped Density (TD), i Carr's Index

MPMC prah se izlio u mjerni cilindar od 50 mL do 25 mL, što odgovara neiskorištenom volumenu, a zatim tapkajte 5-10 puta dok nije zamiječena daljnja promjena volumena praha koja odgovara tapped volumenu.

Density bulk, tapped density, and Carr's index were determined applying following equations [45]:

(1) BD = masa/ neiskoračeni volumen

(2) TD = masa/tapped volumen

(3) Carrov indeks (%)= (TD-BD)/TD×100

3.4.3. Indeks apsorpcije vode(WAI) i Indeks rastvorljivosti u vodi (WSD)

Rastvorljivost vode i indici apsorpcije vode MP i MPMC ispitani su prema metodi koju su opisali Yagc i Gogus uz neke izmjene [46]. Uzorci(0,5 g)su raspršeni u 10 mL destilovane vode na 25°Cin centrifugnom cijevi. Nakon sto je stajao 30 min, uz inverziju cijevi svakih 5 min, uzorci su centrifugiran na 3500 o/min 15 min. Filtrat je prebačen na aluminijsku ploču i sušen 3 h na 105°C. Težina preostalog gela je zabilježena i WSI i WAI su utvrđeni kako slijedi:

(4) WAI(g/g)= Dobivanje na težini gela/Suha težina uzorka

(5) WSI%= Težina suhih krutih u supernatantnim ×100/Suha težina uzorka

3.4.4. Probavljivost mliječnih proteina

Probavljivost proteina je određena prema Abd El-Ghany et al. [47]. Ukratko, uzorci MP i MPMC su raspršeni u destilovanim vodama u koncentraciji od 6,38 mg/mL, a pH je prilagođen na 8,0. Jedan mililiter svježe pripremljene otopine enzima (1,6 mg/mL trypsin, 3,1 mg/mL chymotrypsin, i 1,3 mg/mL ER amino peptidaze1

(ERAP1)je bio pomiješan sa suspenzijom proteina pri 37°C. PH je zabilježen nakon 10 min, a aktivnost enzima je određena pomoću caseina kao reference. Za izračunavanje probavljivosti proteina korištena je sljedeća jednadžba [47]:

(6)% Digestibility = 210,46-18,10 (pH)

3.5.Fenolički razlomci PHM i NabM

Fenolička spoja uzoraka mucilaže pomoću HPLC analize su obavljena protokolom koji je opisao Elsayed et al. [48]. Ukratko, ekstrakt mucilaže je analiziran pomoću Agilent 1260 series HPLC sistema (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). Odvajanje je prošlo pomoću kolone C18 (100 mm×4,6 mm i.d.,5 um). Mobilna faza je sadržavala (A) vodu 0,2% H3PO4, (B)metanola, i(C) acetonitrila pri protoku od 0,6 mL/min. Gradient elute je bio po sljedećoj shemi: 0-11 min (96%A., 2% B);11-13 min (50% A,25%B);13-17min (40% A,30%B);17-20,5 min (50%B,50%C);i 20,5-30 min (96% A,2% B). Detekciona talasna dužina (UV detektor,284 nm) je postavljena na 284 nm. Veličina injekcije je bila 20 μL, a temperatura kolone je održavana na 30°C. Spojovi su bili poznati uspoređujući njihovo vrijeme održavanja sa onima iz autentičnih standarda. Kalibracione krivine su bile korištene za procjenu količine spojeva.

3.6.Total Phenolic and Flavonoid Content of MP and MPMC

Polifenolički sadržaj je određen Metodom Folin-Ciocalteu sa nekim izmjenama [5]. Ukratko, 2,8 mL mili-Qwater koji sadrži 10 mg MP ili MPMC su pomiješani sa 2 mL od 2% natrijevog karbonata, a 0,1 mL od 50% Folin-Ciocalteau reagenta. Nakon 30 min inkubacije na sobnoj temperaturi, apsorpcija reakcijske smjese je izmjerena na 750 nm protiv deionizirane vode kao praznine koristeći spektrofotometar (Hitachi, Model 100-20). Galna kiselina(GA)je korištena kao standardni fenolički spoj, a konstruirana je standardna kriva (0-200 mg/L) sedam tačaka. Rezultati su izraženi kao ekvivalenti miligramske galne kiseline po gram proteinu (GAE/g).

Flavonoidisadržaj je određen metodom aluminij hlorida kako je prethodno opisao Abedelmaksoud et al. sa nekim izmjenama [5]. Ukratko, 2,8 mL mili-Q vode koja sadrži 10 mg MP ili MPMC pomiješana je sa 0,1 mL od 10% aluminij hlorid heksahidrata i 0,1 mL od 1 M kalija acetata. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi 40 min, apsorpcija reakcijske smjese je izmjerena na 415 nm protiv deionizirane vode kao praznine. Kvercetin je korišten kao standard koristeći standardnu krivinu od sedam tačaka (0-50 mg/L). Ukupan sadržaj flavonoida je izražen kao ekvivalenti miligrama kvercetina (QE/g).

3.7. Antioksidantna aktivnost MP i MPMC

Ukupan kapacitet slobodnog radikalnog skalvenginga MP i MPMC je evaluiran pomoću tri različita antioksidantna assays: Stable 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), Azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonilna kiselina (ABTS), i hidroksil radikali (HS) radikali kao što su ranije opisali El-Maksoud et al. [5].

3.8. Aminokiseline Profil MP i MPMC

Uzorci proteina su hidrolizovani pomoću 6 N HCl prema Peksa i al. [49. Automatizirani analizator aminokiselina(AAA 400, INGOS Ltd.) korištena je za određivanje aminokiselina.

3.9. Reološka svojstva

Uzorci su pripremljeni kao što je opisao Barnes [50]uz neke izmjene. Viskoznost 2,5%(w/w)otopine na pH7 određena je na 25±1°C koristeći Brookfield viscometer(DV-II+ Pro, Rheocalc Software, Njemačka). Stres (σ)i viskoznost (n)su ispletene kao funkcija stope smicanja. Indeks dosljednosti(K) i indeks ponašanja protoka (n) modela power-law su izračunati:

Vrijednost n je jednaka 1 za njutonske tekućine i varira od 0 do 1 za tekućine koje su posmična i veće od 1 za smicajuće zadebljivanje tekućina [51].

3.10.Differential Scanning Calorimetry (DSC)

Termička svojstva MP i MPMC mjerena su pomoću kalorimetra za disencijalno skeniranje (PerkinElmer, SAD). Uzorci(4-6 mg)su bili 2-6 mg u aluminijumsku ploču i zatvoreni. Svaka posuda je tada zagrijavana na 350°C s protokom suhog dušika gasa na 20 mL min-I pri brzini zagrijavanja od 10°C min-1. Od endotermnog vrha DSC termograma procijenjena je temperatura denaturacije, maksimalna temperatura prijelaza i tačka degradacije [52]. Određena je prijelazna enthalpy vrijednost(AH) iz područja ispod endotermnog vrha u DSC krivini, a kao referenca korištena je prazna aluminijska posuda.

3.11. Fourier-Transform Infracrvena spektroskopija (FTIR)

Infracrveni spektri između 600 i 3500 cm-I mjereni su na 25°Cusing a FTIR spektrofotometar (QFA Flex, SAD) po attenuiranoj metodi totalne refleksije pomoću rezolucije od 4 cm-I i stjecanjem 10 skeniranja u sekundi.

3.12. Transmission Electron Microscopy

Mikrostrukturu MP i MPMC vizualizirali su pomoću elektronskog mikroskopa za prijenos (JEOL, JEM 1400 Flash, Japan) na 80 kV. Primijenjena je krio-faza u metodi negativnog mrljanja [53].

3.13.Biološke studije o MP i MPMC

3.13.1.In Vitro Anticancer Aktivnost

Sve ćelijske linije korištene u ovom eksperimentu dobivene su iz Američke kolekcije kulture tipa(ATCC, Manassas, VA, USA). U ovom testu su korištene dvije ljudske kancerogene ćelijske linije: adenokarcinom mamura (MCF-7, ATCCHTB-22TM)i hepatocellularni karcinom (HepG2, ATCC4 HB-8065TM). Ne kancerogeni fibroblast kože BJ-1(ATCC(8) CRL-2522TM) i epitelne dojke MCF-12F(ATCC CRL-10782TM) su također testirani na usporedbu. Ćelijske linije su uzgajane u Modificiranom Orlovom medijumu (DMEM/visoka glukoza, HyCloneTM, SAD)dopunjen sa 10% fetalnog seruma goveda (FBS, Gibco, Brazil), 100 U/mL penicilina, 100 ug/mL streptomicina, i 25 ng/mL amfotericina B(Sigma, Oakville, ON, Kanada) i kulturan na 37°C sa 5%CO, u vlažnom inkubatoru. Medij za kulturu je zamijenio svaki drugi dan svježim medijom. Kada su ćelije dostigli 70% utočišta, oni su se odvojili koristeći 0,25% Trypsin-EDTA(1X) Gibco, Kanada, i prebačeni u novu kulturnu pljosku. Nakon drugog prolaza, ćelije su bile tripsinizirane i tanjure u 96-dobroj pločici u koncentraciji od 2×10* ćelija/well. Nakon 24 h inkubacije, medij je dekontiran, a ćelije su dva puta oprane PBS-om zatim tretirane sa 200 μL medija kulture koji sadrži različite koncentracije uzoraka proteina(1, 5,10, i 20ug/mL). Doksorubicin HCl(4 ug/mL)je korišten kao pozitivna kontrola, dok su ćelije tretirane neusprovedenim medijom uzete kao negativna kontrola. Ploče su inkubirali na 37°CC za 24 h ianti-rakaktivnost uzoraka je određena pomoću neutralnog crvenog uptake assay prema Repetto et al. [54]. Nakratko, nakon perioda inkubacije, medij je zamijenjen sa 150 uL neutralne crvene boje(100 mg/mL) rastvorenog u mediju bez seruma, a ćelije su inkubirali na 37°CC za 3 h. Dalje, ćelije su isprane PBS-om, a 150 μL elucionog medija (EtOH/AcCOOH,50∶1)je dodano nakon toga nježno tresenje 10 min kako bi se osiguralo potpuno otapanje. Apsorpcija je mjerena na 540nm pomoću čitača mikrotitera ploča(BioTek,96 Well Plates, ELX808, USA).

gdje je Ac apsorpciju kontrole i kao što je apsorpciju uzorka. Procentna smrt ćelija predstavljena kao cistotoksičnost(%), a koncentracija koja ubija 50% ćelija (IC50)je izračunata za svaki uzorak.

3.13.2.Određivanje nivoa proteina P53, Bax, Caspase-3 i Bcl-2

Ćelijski nivoi kljucnih apoptozinih proteinskih markera su utvrđeni nakon 24 h nakon liječenja ICso-om MP i MPMC-a. Ukratko, Hep G-2, MCF-7, Bj-1, i MCF-12F ćelije su zasjejane na 5× 10* ćelija/dobro u 6-well pločama. Nakon 24 h inkubacije sa uzorcima na 37 °C, ćelije su prikupljene i lysed zatim centrifugiran na 10.000rpm 20 min na 4°C. Koncentracija proteina je kvantificirana u supernatantu od strane Bradforda [55]. Aktivnost Caspase-3 je analizirana pomoću colorimetričkog assay kita (Abcam, ab39401)prema uputama proizvođača [56]. Ukratko, 10 mg proteina je dodano na 50 uL Kaspase supstrata i konačni volumen je prilagođen na 200 μL koristeći reakcijski tampon na 37 °C, a smjesa je inkubirana 1 h u mraku, a slijedi mjerenje koncentracije Kaspase-3 pri 405 nm.

Nivo pro-apoptotiиnog markera p53, Pridružena X(Bax), i antiaposoptotski marker B-cell limfoma-2(Bcl-2)su utvrđeni u lisatu ćelija pomoću Enzimom povezanih Imunosorbent Assay Simple Step ELISA prema uputama proizvođača (ab207225, ab119506 i ab199080; Abcam, USA), odnosno [57.58].

3.13.3.OŠTEĆENJE DNK izazvano oksidativnom zaštitom od stresa

Test oštećenja DNK je izvršen kako je ranije opisano od strane Leba et al. [59] uz blago modifikaciju. Ukratko, 3 μL inhibitora ribonukleaze PLAZMMID RNH1(NM_203387)Humani označeni ORF Klon 10 μg/μL su pomiješani s Fentonov reagentom(5 mM od H2O2 i 0,3 mM FeSO4 i 0,6 mM EDTA), a konačni volumen je prilagođen na 25 μL pomoću fosfatnog bafera(H2POA, 8,3 mM, pH 7.4). Zatim se otopina inkubirao 20 min na 37°C. Da bi se procijenio antioksidativni kapacitet zaštite MP i MPMC protiv OŠTEĆENJA DNK izazvane Fentonov reagent, prije inkubacije su dodani 5 μg/mL MP/NabM, MP/IHM i MP. RNH1 plazmidna DNK(3 μL, 10 μg/μL) je korištena kao kontrola zaštite DNK.

3.13.4.PCR-based Genomic DNK Damage Assay

Homo sapiens methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gen je pojačan pomoću PCR-a iz genoma krvi koji je prethodno ekstrahiran iz zdravih uzoraka krvi koristeći standardni set za ekstrakciju DNK [60]. DNK je inkubiran 10 min sa Ili bez Fentonova reagenta dopunjenim MP ili MPMC- om. 198-bp fragment je pojačan koristeći naprijed5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3' i obrnuti 5'-AGGACGGGGGGGGGAGTG-3'primers. Koristeći 50ng liječenog DNK, PCR pojačanje je izvršeno nakon sljedećeg termociklera (94°C 5 min, Slijedi 25 ciklusa denaturacije, 30-te na 94°C; annealing, 30s na 60°C; i produžetak,30 s na 72°C)za 25 ciklusa i 1 završni ciklus produžetka na 72°C za 5min. Uzorci PCR reakcije su primijenjeni za elektroforezu agaroze gela (2%).

3.13.5. Gene Expression Profiling by RT-qPCR

Analize genskog izražavanja ključnih pro-i anti-apoptotički marker gena su obavljene sa HepG-2, MCF-7, Bj-1 i MCF-12F ćelijama izloženim IC50 dobivenim podacima (Tabela 3)za 72 h. Ukratko, totalna RNK je izvađena koristeći Total RNA Purification Kit(QIAGEN., Thorold, ON, Canada) prema uputama proizvođača. cDNA

sinteza je izvršena kako je prethodno opisano od strane Aboul-Sound et al. [61]. Programi pojačanja i specifičnost PCR amplicona su izvedeni i ocijenjeni korištenjem Rotor-Gene O 5-Plex HRM termalnog ciklusa (Qiagen, Njemačka) s Quanti-Tect SYBR-Green PCR Kit (Qiagen, Njemačka) kao što je prethodno dokumentiran slijedeći standardne protokole [61]. Korišteni su sljedeći primeri: Hs_P53_1 SG QuantiTect Primer Assay (QT00060235); Hs_CASP3_1_SG Quan-tiTect Primer Assay (QT00023947); B-cell lymphoma 2 Hs_BCL2_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00025011); Bcl-2-like protein Hs_BAX_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00031192); i 18S rDNA kuća-držanje (HK) gen Hs_RRN18S_1_SGQuantiTect Primer Assay(QT00199367). PCR termalni biciklizam program i analiza ekspresije gena za određivanje preklopne promjene u relativu 18S gena su u suštini izvedeni kao što je prethodno prijavljeno [61].

3.14.Statistička analiza

Dobiveni rezultati su izraženi kao ± standardne devijacije. Statistika je postignuta koristeći SPSSsoftware 11.5 (SPSS, Inc.Chicago, IL, USA). Duncanov test višestrukog dometa korišten je za određivanje značajnih razlika među svim uzorcima, a razlike su smatrane značajnima na p<>

4. Zaključci

U zakljuèku, ova studija je otkrila da miješanje mliječnih proteina sapolisaharidikroz differentiaciju rastvora pH je pogodan tehnika za kompleksaciju. Rezultirajući kompleksi mucilaže mliječnih proteina (MPMC) imaju znatno veći fenolički iflavonoidisadržaja od proteina mlijeka (MP). Rezultati DSC-a su pokazali da je kompleksacija MP sa polisaharidi značajno povećala toplotnu stabilnost sa pomakom u temperaturi denaturacije. FTIR analize su izvršene kako bi se identificirale funkcionalne grupe, a istraživao se i ponašanje protoka pripremljenih kompleksa. WSI i WAI mliječnih proteina su povećani kompleksacijom sa NabM ili IHM. TEM je korišten za vizualizaciju mikrostrukturu pripremljenih kompleksa. S druge strane, očekuje se da će rezultujući mliječni proteinski kompleksi sa izabgolskom mucilažom (HM) ili Nabeq mucilažom (NabM) nadmašiti proteine domorodca u antioksidantskom i antitumonskom efektu. U sažmu, MPMCexpressed jedinstvena antitumorana svojstva protiv modela raka dojke i jetrenih karcinoma ćelija linije (MCF7 i HEPG2, odnosno)kao što je dokazano neutralnim crvenim unosa assay.

MPMC je poboljšao obaantioksidansi aktivnost protiv proliferacije. Kaspase su ključni regulatorni proteini koji su upleteni u indukciju apoptoze. Upregulacija kaspase 3 transkripta proteina i mRNA (figure 9A, B) kontrolira druge proteine na putu apoptoze, koji se karakteriziraju kolapsom mitohondrijske membrane sa Bax-induciranim oslobađanjem od c i aktivacijom kaspaze 9 koja je podlijegala naknadnom angažmanu kaspase 3. Up-regulacija Casp3, p53 i Bax, zajedno sa redukcijom Bcl-2 izraza otkrila je da je MPMCinduced apoptosis indukcija, gdje će upregulacija p53 stimulirati izražavanje Baxa, koji će, za nogom, potaknuti oslobađanje od cistokroma c, a slijedi aktivacija kaspaze-9 i-3. Štaviše, Bcl-2 je poznat po inhibicijama oslobađanja cistokroma c. U našoj studiji, pokazalo se da je Bcl-2 downregulacija izazvana MPMC-om olakšala neopponiranu bax-induciranu citohrom c oslobađanje i naknadno apoptozu.

Antitumonski efekat proteinsko-polisaharidnih kompleksa pruža dalje prosvjetljenje na primenljivost ovih kompleksa koji će se koristiti u razvoju pristupačnih i efikasnih terapija raka uz minimalne nuspojave.