Multifaktorska seroproiling secira doprinos već postojećih ljudskih korona virusa odgovora na SARS-CoV-2 imunitet (2. dio)

Za više informacija molimo kontaktirajtedavid.wan@wecistanche.com

Rezolucija of temporalni antitelo dinamika by ABCORA ser-oprofiling.  Cross-sekcijskianaliza of reaktivnost antitijela nakon SARS-CoV-2dijagnoza pomoću RT-PCR (N = 369) inakon početka ofsimptomi (N = 333) podvučeno the kapacitet of ABCORA ser- oprofisecirati početak, vrhunac i jenjavanje SARS-CoV-2 antitelo odgovore (Fig. 5a, b, Dodatna slika 11). Kod pojedinaca sa a poznato datum of fiprvo SARS-CoV{1}} RT-PCR dijagnoza ili pojavu simptoma, ABCORA 2.3 detektujeed rano seroconvert-sion in 98 posto (48of 49) i100 posto (9of 9) of pojedinci unutar7 dana post-RT-PCR i početak simptoma, respektivno. Osim toga IgM i IgA reaktivnost, IgG odgovori su se lako detektirali u ABCORA 2.0 nakon nekoliko dana infekcije (SupplementaryFig. 11a).

Longitudinalna procjena kohorteof rekonvalescent pacijenata goreto  11  mjeseci nakon infekcije (251 mjerenje na 120 pacijenata)  istaknutothetemporalnidinamikaof SARS-CoV-2 vezujuća antitela. Procijenili smo propadanje of vezivanje reaktivnost zapošljavanje azakon moći mješoviti model i identificirao značajan reduakcija in RBD, S1, i N in sve Ig podtipovi (Fig. 5b) sapoluživoti rasponu od 67 to 404 dana, sa opadanjem titra IgG N najbrži,inlinijasaprethodni   izvještaji10.   Pola-zivotiofthe neutralanizacija relevantan IgG odgovore to RBD i S1 bili 125 i 404 dana, respektivno. Intrigantno, kinetika neutralizacije antitela učinio ne ogledalo the propadanje stope posmatrano za vezivanje antitela. Aktivnost neutralizacije je prekomjerno smanjenall at a sporijestopa, sa a pola-životni vijek od 991 dan (sl.5c). Ovo je dijelom bilo zbog amješovitoreaktivnostuzoraksanekipojedincipokazujućianpovećati in neutralizacija aktivnost pošta pozitivno SARS-CoV-2 RT- PCR5, dok je aktivnost neutralizacije kod drugih brzo opala (Dopunski Slika 11c).

Efekti of HCV imunitet on SARS-CoV-2 akvizicija. To

omogućiti istraživanje međuzavisnosti između već postojećihng immjedinstvo to HCoV i SARS-CoV-2 infekcija, mi prošireno theABCORA perla antigen niz to uključiti S1 proteini of sve četiri kruže  HCoVs  (HCV-NL63,  HCV-229E, HCV-HKU1,HCV-OC43) (Sudopunski Fig. 12a). Prema to itskapacitet to monitor antitela to five koronavirusi, mi termin test ABCORA 5.0 i obučeni i validirano to on the istokohorte as ABCORA 2.0 (Fig. 1). Da bi se omogućilo direktno poređenje sa ABCORA 2.0 ithekoristiti modela predviđanja neutralizacije, mikorišteno the prag-/Postavke analize zasnovane na SOC-u za ABCORA 2.0 takođe za ABCORA 5.0. Na osnovu on ABCORA 5.0 mjerenja od obuku kohorte I–III, mi osmislio dva nasumično šuma-baziranu analizu modeli. ANCORA 5.4 uključeno isključivo the 12 SARS-CoV-2 parametre, a ABCORA 5.5 uključujed indodatak the  S1  HCoV mjerenja dodavanje do 24 parametra ukupno. Po analogiji saABCORA 2.3, inkorporacija of HCV reaktivnost into the modelbio povoljan. ANCORA 5.5 pruža najveću osjetljivost ispecifigrad među the analiza algoritmi probed ABCORA 5.0 (Dopunski Slika 12b, Dodatna tabela 10).

Međuzavisnosti izmeđuantitelo  reaktivnost  to  the  četiri HCoV i SARS-CoV-2 ogledalo šta mi prethodno posmatrano

za HKU1 sa a posebno visoko korelacija of IgM reaktivnost of

SARS-CoV-2 i HCoVs in pre-pandemija pojedinci, posebno inonesanedavno  HCV  infekcija  (DopunskiSlika 13). HCV infekcije su česte, ali podložne sezonskim promjenamaitheprevalencija of pojedinac HCV infekcije luctuates41,42. U redu uz ovo, prevalencija odgovora na HCV mjerena od strane ABCORA 5.0 in lokalni krv donatori in Januar 2019 (N = 285), maja  2019   (N=288), i januar 2020. (N=252) variraoznatno  (Fig. 6). To omogućiti a vrijeme-kontrolisan poređenje od HCV reaktivnost između SARS-CoV-2-inficiran i zdravi donori, mi screened krv donatori od maja 2020  (N = 672), kada SARS-CoV-2 prevalencija bio procijenjeno ispod 2 posto u Cirihu, Switzerland43, by ABCORA 2.{{0}}/5.0 i isključio sve uzorke sa SARS-CoV-2 reaktivnost. The rezidualni maja 2020kohorta (N=653)formirana a pandemija, zdravo donator kontrolu grupa. Zanimljivo,Obrasci reaktivnosti HCV-a u 2019. i 2020. razlered suštinski as procijenjeno by jedan-način ANOVA, sa januarom 2020. koji prikazujekomparativno najniže i maja 2020 the najviši IgA i IgGreactiveity, koji svibanj ukazati a kasnije početak of an HCV epidemija u 2020. u odnosu na 2019. (t-testovi iz maja 2020. u odnosu na druge grupe shown in Fig. 6).

Najintrigantnije, vremenski usklađena analiza comparing maja2020 zdravih donora sa SARS-CoV-2-pozitivnim uzorkom pacijenataledupril, maj, i juna 2020 (N = 65) otkriveno significantly nižeHCV reaktivnost in SARS-CoV-2 pozitivno pacijenata (Fig. 7a). Ovo uzorak bio takođe evidentno kada mi proširio analizu tako da uključuje thepunkohortaof SARS-CoV-2  izmjerene zaražene osobesa  ABCORA  5.0 (N=389, uzorkovano od marta 2020. dofebruar  2021,  Dopunski  Fig. 14). Sve u svemu, ovi rezultati indicated to pre-postojeći imun odgovore to HCoVs svibanj to a određeni stepen zaštite od zaraze SARS-CoV-2ion.

Kliknite ovdje da saznate više o Cistancheu

Fig. 5 Monitoring temporalni evolucija of antitelo odgovore. an ABCORA 2.3 definicija of seropozitivnost in donatori sa pozitivno RT-PCR potvrđeno SARS- CoV-2 infekcija i poznati RT-PCR datum (N = 369). Seropozitivnost rejtingo plazma uzorkovanje vrijeme tačkapost-dijagnoza je prikazano. siva zasjenjeno područje ističe the prvo sedam dana pošto pozitivno RT-PCR detekcija. bMoćni zakon model, sa vrijeme pošto RT-PCR as fiksno efekat i pojedinačne kao slučajni efekat, procjena the propadanje of aktivnost vezivanja antitijela na osnovu ABCORA 2.{1}} mjerenja u 1-4 longitudinalne vremenske tačke na ukupno 120 osoba251 mjerants. Ljubičasta linije dopisivati ​​se to the modela procjena iljubičasto zasjenjen oblasti to the95 postosamopouzdanje intervalima. Antitelo pola-zivoti (t1/2 u danima) od značajan modeli su prikazano. Značaj bio procijenjeno koristeći Satterthwaite aproksimacija za a dva-sided t-test on the nagib parametri. c Moćni zakon model, sa vrijeme pošto RT-PCR as fiksno efekat i pojedinac as a nasumično efekat, procjena the propadanje of neutralizirajući kapacitet on 251mjerenja od 120 pojedinci. Samo pojedinci sa NT50 > 100at njihov prvo mjerenje bili korišteno to procjena the pola-život. The ljubičasta linija odgovara to the model procjena i the ljubičasta osenčeno području to the95 postosamopouzdanje intervalima. Značaj bio procijenjeno koristeći Satterthwaiteova aproksimacija za a dva-sided t-test on the nagib parametri.

Fig. 6 Sezonski i godišnje fluctuation in HCV reaktivnost. Reaktivnost to čovjek koronavirusi (HCV-NL63, HCV-229E, HCV-HKU1, HCV-OC43)bio uporedio by ABCORA 5.0. Reaktivnost in zdravo krv donatori od 2019 i 2020 bio uporedio. Pre-pandemija uzorci uključeno: Januar 2019 (N = 285), maja 2019 (N = 288), Januar 2020 (N = 252). Uzorci od maja 2020 (N = 672) bili prikupljeno tokom the pandemija in Switzerland. Samo uzorci bez SARS-CoV-2 specifično reaktivnost as definisano by ABCORA bili uključeno (N = 653). Zvezdice dopisivati ​​se to nivoa of značaj of dva-sided t-testovi poređenje the naznačeno grupe. Nivoi of značaj su ispravljeno by the Bonferroni metoda za višestruko testiranje i naznačeno as slijedi:        *p< 0.05/36, **p < 0.01/36,="">p< 0.001/36.Boxplots predstavljaju the prateći: medijana sa the srednji linija, gornji i niže kvartila sa the kutija granice, 1.5x interkvartil rasponi sa the brkovi, i outliers sa bodova.

Efekti of  HCV  imunitet in  SARS-CoV-2  infekcija.  To

dalje istraživati ​​međuzavisnosti sa HCV imunitetom, ne možemoxtistraženo da li HCV odgovore su povezan na evolucijuof SARS-CoV-2 antitela. To ovo na kraju, analizirali smo antitelaodgovore u plazmi 204 osobe uzorkovane sain 60 dana nakon SARS-CoV-2dijagnoza korištenjem modela linearne regresije prilagođeno starosti, spolu i vremenu od pozitivnog RT-PCR-a i HCV-areaktivnost. To stratificirati HCoV reaktivnost into visoko i nisko HCoV aktivnost, medijanalog MFI-FOE bili defined za svaki HCV iantiteloklasa. LogMFI-FOE veći od odgovarajućegmedijana za najmanjet tri HCoVs (HKU1, OC43, NL63, ili 229E) u konkretnomc Ig klasa bili rangiran as vlasništvo visoko HCV aktivnostu okviru ove klase. Prvo, samo reaktivnosti među istim antibodyclass were istražen in the model (i.e., HCV IgG visoko on SARS- CoV-2 IgG). Primetili smo izuzetakllyjakameđuzavisnosti za IgA i IgM odgovore na SARS-CoV-2, kojisvebilisignificantlyvišiinpojedincisavisoko HCVreaktivnost (Fig. 7b). Ovo snažno sugerira da već postojeći HCV imunitet može pružitie an prednost in montaža SARS-CoV-2 odgovore.Međuzavisnosti između HCV IgG i SARS-a CoV-2  specifični IgG su uočeni samo za S2 odgovor. Intrigantno, podržavajući ovaj nalaz, HCV S2 helper odgovorebili nedavno pronađeno to pojačati SARS-CoV-2 imunitet, inposebno Aktivnost S2 antitela31. Da istraži mogu li SARS-CoV-2 IgGgraditi on nedavno HCV IgA i IgM odgovore mi sljedeći probedda li su HCV IgM i IgA povezani sa elevated SARS-CoV-2 specific  IgGnivoa.Iako nikakav efekat nije bio evidentan za IgM, mi primetio znakificant udruženje of visoko HCV IgA aktivnost onsvečetiriizmjereno  SARS-CoV-2  odgovore  (Fig.  7c,  d). Ovo snažno predlažetonedavno  HCV  infekcija imaa beneficijal efekat na povećanje odgovora na SARS-CoV-2 antitijelases.

U the sljedeći analiza, mi probed ako pre-postojeći HCV imunitetima an uticaj na ozbiljnost bolesti u COVID- 19. U tu svrhu, miprobed HCoV imunitet in 80 hospitalizirano i nehospitaliziranopojedinci inficiran za manje od 30 dana (sl.8a). Kontroliranje za starosti i spola, otkrili smo da osobe sa high pre-postojeći HCV reaktivnost je bila značajnaantlyniže  DDStozahtijevajuhospitalizacija  (logističkiregresija  ILI = 0.16, 95 posto CI (0.04, 0.67), Fig.8b, Dodatna slika 15). Daljnji stratifikation ofppacijenti by da li oni potrebno tretman at an ICU pokazao a smanjena vjerovatnoća da pacijentts sa visoko HCoV odgovor potrebne stope hospitalizacija sa intenzivno briga (redni regresijaILI {{0}}.36, 95 posto CI (0. 13, 0.96), Fig.8b, dopunskiFig. 15). Dakle, pojedinci sa visoko HCoV nivoa imao a 6Šanse su smanjene za 4 posto o potrebi hospitalizacije prema ilidinal rang regresiona analiza poređenje hospitaliziran in redovno odjeljenja, in ICU, inonhospitalized pojedinci   (Fig.  8a,  b).   Kolektivno,  ove zapažanja snažno ukazuju na unakrsni zaštitni efekatof HCVimunitet na formiranje imunološke odbrane protiv SARS-a-CoV-2.

Fig. 7 Efekti of pre-postojeći HCV imunitet tokom SARS-CoV-2 akvizicija. a Vrijeme-podudaraju poređenje of ABCORA 5.0 reaktivnost za SARS-CoV-2i HCoVs in zdravo i SARS-CoV-2 inficiran pojedinci. Zdravo donatori bili uzorkovano in maja 2020 (N = 653; plava). Plazma od SARS-CoV-2     zaražena osobas bio prikupljeno između april–juna 2020 (N = 65; crvena). Vidi Dopunski Fig. 14 zaananaliza of the pun SARS-CoV-2 pozitivno kohorta(N = 389). siva kutije ukazati vrijednosti gore the pojedinac MFI-FOE cut-offs za SARS-CoV-2 specifično odgovore za svaki antigen. Zvezdice dopisivati ​​se do nivoa of značaj of dva-sided t-testovi poređenje negativan protiv pozitivno pacijenata. Nivoi of značaj su ispravljeno by the Bonferroni metoda za višestruke testiranje i naznačeno as slijedi: *p< 0.05/12, **p< 0.01/12, ***p< 0.001/12 (IgG HKU1: p = 0.66, IgG OC43: p = 0.45, IgG NL63: p=3.3 × 10−04, IgG 229E: p = 1.6 × 10−05, IgA HKU1: p=1.8 × 10−03, IgA OC43: p=1.3 × 10−05, IgA NL63: p=1.4 × 10−07, IgA 229E: p=3.0 × 10−05, IgM HKU1: str = 3.3 × 10−08, IgM OC43: p = 4.3 × 10−03, IgM NL63: p = 1.1 × 10−07, IgM 229E: p = 2.7 × 10−02). Boxplots predstavljaju the prateći: medijana sa sredina linija, gornji i niže kvartila sa the kutija granice, 1.5x interkvartil rasponi sa the brkovi, i outliers sa bodova. b Linearno regresija prikazani modeli the udruženje između SARS-CoV-2 i HCV signale in 204 SARS-CoV-2 pozitivno pacijenata sa poznato datumi of irst pozitivno RT-PCR detekcija. Utjecaji unutar the isto antitelo klasa su istraženo. The modeli bili prilagođeno on Dob (spline sa 3 stepeni of sloboda), spol, vrijeme od tada pozitivno RT-PCR (spline sa 3 stepeni of sloboda), i nivo of HCoV reaktivnost. Uzorci su dizajniran to luka visoko HCV reaktivnost ako oni show ABCORA 5.0 HCVlog MFI-FOE vrijednosti viši nego the odgovarajući medijana in at najmanje 3 HCoV mjerenja (HKU1, OC43, NL63, ili 229E). Krive odgovaraju to the modela procjena i osenčeno oblasti to the95 postosamopouzdanje intervalima. p-vrijednosti bili dobijeno by trčanje a dva-sided Student t-test na parametar povezane sa HCV reaktivnost in the linearno regresija. c Linearno regresija model pokazujući the udruženje između SARS-CoV-2 IgG i HCV IgA signale. Curves dopisivati ​​se to the modela procjena i osenčeno oblasti to the95 postosamopouzdanje intervalima. p-vrijednosti bili dobijeno by trčanje a dva-sided Student t-test on the parametar povezane sa HCV reaktivnost in the linearno regresija. d Linearno regresija model pokazujući the udruženjeizmeđu SARS-CoV-2 IgG i HCV IgM signala. Krivulje odgovaraju procjeni modela i zasjenjene oblasti u intervalima pouzdanosti od 95 posto. p-vrijednosts were dobijeno by trčanje a dva-sided Student t-test on the parametar povezane sa HCV reaktivnost in the linearno regresija.

Diskusijaion

Definition of  SARS-CoV-2  imunitet nakon vakcinacije iinfekcija je od neposredne važnosti44–46. Dešifrovanje antitijelokoreliraof SARS-CoV-2  zaštitaipraćenje vakcina odzivnost su izazovni zadaci koji su pred nama. Magnituda and dugovječnost of zaštitni antitelo odgovore to prirodno infekcija i drugačije vakcine potreba to biti ispitan to razumetiparametri to oblik zaštitni odgovore i usmjeravaju odluke o revakcinaciji kod nereagovanih i ponovnoj imunizacijinstroman nastaju SARS-CoV-2 varijante47. Isto tako, stvarati znači serološki razlikovati de novo infekciju, reinfekcija,i vakcina odgovore, njihov izdržljivost i neuspjesi će ostaticritical za klinički dijagnoza.

Evo mi demonstrirati the visoko korisnost of multi-parametar ser- profiliranje u rješavanju ključnih pitanja u defining  SARS-CoV-2 imunitet.  Simultaneousdetekcijaof odgovori antitela na a dometof SARS-CoV-2  antigeniidrugačije  Igcasovisa ABCORA  seroprofilingpružila sveobuhvatnu sliku o SARS-CoV-2 serološki status u jednom pregledu, što je can biti koristan za kliničku dijagnozu za određivanje prisutnostiof reinfekcija,  definereinfekcija,  iodgovorititovakcinacija. Računarskimodeliranjetakođedozvoljenopredviđanje plazma neu-realizacija kapacitet od ABCORA rezultate, omogućiti asveobuhvatan procjena of SARS-CoV-2 antitelo dinamika i njihov interplay withHCV odgovore. Mi studirao dva ABCORA esejverzije that oboje izmjereno HCV reaktivnost pored the  12 SARS-CoV-2 parametri.ANCORA 2 je uključivao S1 antigenHKU1. ANCORA 5 uključeno S1 of sve četiri cirkulirajući HCV.Posebno, računski modeli to uključeno the HCVmjerenja dozvoljeno a viši preciznost in utvrđivanje SARS-CoV- 2 seropozitivnost, visokaosvetljenje međuzavisnosti između HCoVi SARS-CoV-2 odgovori koje je potrebno riješiti.

Snimanje reaktivnost protiv sve četiri HCoVs in SARS-CoV-2neinficiran iinficiranpojedincimiposmatranointrigantnoudruženja. Uzaraženpojedinciprikazanoviši  HCVreaktivnost u poređenju sa zaraženim osobama što sugerišeadoprinos of HCV imunitet to rano odbrana protiv SARS-CoV- 2. HCV imunitet također može imati pozitivne efekte na SARS-CoV-2infekcija. U sporazum sa ostalo izvještaji, mi primetio aunakrsno hranjenje of SARS-CoV-2 i HCV odgovori u infekciji SARS-CoV-231,48 sa pojedinci sa visoko HCV reaktivnost razvijati-oping viši SARS-CoV-2 antitelo nivoa. Većina posebno, već postojeće HCV imunitet imao an uticaj on bolest ozbiljnost u našem kohorta. SARS-CoV-2 inficiran pojedinci sa nisko HCV reaktivnost imao a viši vjerovatnoća of zahtijevajući hospitalizacija.

Doknašstudijaisključivo izmjereni odgovori antitijela, apotencijalzaštitniefekatof HCoVimunitet protiv SARS-a-CoV-2 akvizicija trebalo bi ne biti pogledanoasograničeno to aktivnost antitela. Antitijela i ćelijski imunitet može biti relevantani koncertno aktivan31,49–51. Alternativno, odgovor antitelasesmeasured in the prisutan studija svibanj isključivo dokument nedavno HCV infection i dostaviti a surogat mjerenje of ostalo zaštitniHCV odgovore. The veza između viši HCV  i SARS-CoV-2 reaktivnost kod zaraženih osoba je posebno intrigantna. Najjači efekti bili viđeno za IgM i IgA HCoV odgovore, suggesting to nedavno HCV imunitet pruža an rano pojačati to Razvoj antitijela na SARS-CoV{1}}ent.  Da liovojezbogto unakrsno reaktivne reakcije B ćelija na kojethe  SARS-CoV-2imunitet gradi on i sazrijeva ili da li krst-reaktivan T pomagačaktivnostiigratidominantna uloga kao što je predloženo31  bice bitan to rešiti in naprijed-dolazi studije. The tačnu ulogu i timing of HCoVodgovoreuticanje  SARS-CoV-2  antiteloodgovore takođe ostati to biti defined. Rano nisko-affinity HCoV odgovori svibanj imati a pozitivno uticaj on the razvoj od SARS-a-CoV-2 imunitet formiranjem imunološke memorije na koju to graditi, dok amplifikation of non-zaštitniunakrsno reaktivanHCV antitjela prema to the antigenski grijeh princip svibanj imati negativnih efekata30.

Iakoudruženjestudije kao što je naša formalno ne mogu define uzročnost, the implikacije of naš nalazi su evidentni: Priorimunitet to HCV svibanj zaštititi to neki opseg protiv SARS-CoV-2 akvizicija, isvibanj obezbediti a pojačati to the razvoj od SARS-a-CoV-2 specific imunitet i sa ovo niže the rizik zaozbiljnehospitalizacija.  A  skromanzaštitni efekat HCoVimunitet bi biti a moguče objašnjenje za the visokoproporcijaof asymptomatic i blago SARS-CoV-2 infekcije52,53. Čak više intrigantne su buduće perspektive. Kao i drugi i miimati pokazano, SARS-CoV-2 i HCV imunitet to infekcija sučesto ne dugo-trajna (Fig. 5, Dopunski Fig. 11)5,54, ograničenjeto  SARS-CoV-2  vakcinenadatoprebroditi. Trebalo bi SARS-CoV-2  odgovoreinokreni seobezbeditistepen odbrane protiv HCV-a infekcija, široka zaštita protiv koronavirusi može biti u rsvaki.

Fig. 8 Uticaj of HCoV imunitet on COVID-19 ozbiljnost. a Udruženje of hospitalizacija status (ne hospitaliziran (N = 16); hospitaliziran ne in ICU(N = 42); hospitaliziran in ICU (N = 22)) i visoko ili nisko IgG HCoV reaktivnost. Pravougaonik veličine dopisivati ​​se to the proporcija of uključeno pacijenata. b Uticaj od HCoV reaktivnost (nisko/visoko) on the hospitalizacija status in a podset of N = 80 pacijenata, as procijenjeno sa kvote omjeri, in an redni regresija (sa nivoima = ne hospitaliziran (N = 16); hospitaliziran ne in ICU (N = 42); hospitaliziran in ICU (N = 22)) i a logistički regresija (referenca = ne hospitaliziran(N = 16); protiv sve hospitaliziran (N = 64)). Podaci je predstavljeno as parametar procjena i its95 postosamopouzdanje interval. Nivo of značaj of parametar je dobijeno sa a dva-sided t-test (p-vrijednost je prikazano ako <>inače naznačeno as n.s.).

Jathods

Čovjek uzorak. Serum a uzorci plazme su prikupljeni prije i nakon nicanja

SARS-CoV-2 uSwitzerland (pre ipost-februara 2020, respektivno) biliuključeno. br pacijent upis bio sprovedeno za the prisutan studija. Sveeksperimenti uključujući uzorci od čovjek donatori bili sprovedeno uz odobrenje the responsible lokalni etika komitet (Kantonale Ethikkommission) Zurich,

Switzerland (BASEC Nrs 2020-01327, 2020-00363; 2021-00437; 2020-00787), od the odredbe of the Deklaracija of Helsinki i the Good Clinical Vježbajte smjernice of Međunarodna konferencija o harmonizaciji. Uzorci bili dobijeno od sljedeći izvori: (i) davanje krvi u Cirihuservises (ZHBDS): Anonimizirano zdravo odrasla osoba plazma od pre-pandemija vrijemebodova (Januar 2019, maja 2019,i januara 2020.) i od prvog talasa pandemija u Cirihu, Švajcarska (maja 2020) bili obezbeđeno by the ZHBDS interni skladište seruma i nedostacient za ovo studija bio odustao by the etika komitet(BASEC 2021-00437). (ii) Anonimizirano ostaci uzoraka iz rutinske dijagnostike at the institut of Medicinski Virology, Univerzitet of Zurich, the Univerzitetska djeca Bolnica Cirih, i the kantonalni Bolnica Winterthur (BASEC Nrs2020-01327, 2021-00437). Od svih učesnika dobijen je pismeni informirani pristanakčiji uzorak was uzeti tokom the pandemija at the Univerzitet BolnicaCirih (BASEC 2020-01327). Za uzorke pandemije iz drugih bolnicad prepandemija uzorci saglasnost bio odustao by the etika komitet. (iii) Zdravstvena zaštitaradnici kod kojih je RT-PCR potvrđena infekcija SARS-CoV-2ion učestvujući in a studija na Univerzitet Bolnica Zurich (BASEC 2020-00363). Napisano informisani saglasnost je bila dobijeno od sve učesnika. (iv) Muško plazma donatori učestvujući in a SARS-CoV-2 plazma terapija studija sprovedeno u Univerzitetskoj bolnici u Cirihu(CPT-ZHP, Swissmedic 2020TpP1004; OSNOVNI 2020-00787). Pisano informisanod svih učesnika dobijena je saglasnost za istraživanje. Ton izvještavanje of sve čovjek and patient podaciu skladu satheSTROBE izjava. Pre-pandemija (SARS- CoV-2 negativanve, N = 825) i confirmed SARS-CoV-2 pozitivno uzorci (N = 389)bili podijeljeno into obuku i validacija kohorte (Dopunski Table 3).          Dostupni demografski podaci data on spol, Dob, vrijeme pošto pozitivno RT-PCR issimptom početak, i hospitalizacija status su prijavljen in Dopunski Table 11.The SARS-CoV-2 obuku kohorta (N = 175) uključuje plazmu prikupljenu tokominfekcija (N=114) i rekonvalescencija (N=61). Po donor samo jedan uzorkovanje vrijemetačka je uključena, longitudinalni uzorci of donatori uključeno in the obuku kohorta su bili ne uključeno in the validacija kohorte da utvrdi nezavisnost kadaocjenjivanje the osjetljivost i specifičnosti različitih dijagnostičkih metoda. The   SARS-CoV-2 validacija kohorta (N = 214), sastavljena plazma prikupljeno tokom infekcije (N = 90, jedna vremenska tačka uzorkovanja po donoru) i rekonvalescencija

(N = 124, 79 rekonvalescentnih pacijenata sa 1–4 longitudinalna uzorka). Više putabodova of rekonvalescent pacijenata bili uključeno in the skup podataka za validaciju za hvatanje a širok spektar waning antitelo titri. Poprečni presjek analiza bio zasnovano onuzorci sa poznato vrijeme pošto pozitivno RT-PCR (N = 369) ili poznato vrijeme od simptoma početak (N = 333), oba uključujući zapažanja longitudinalne analize.I vrijeme od pozitivne RT-PCR i vrijemepošto početak bio poznato za330 uzoraka, sa srednjim vremenom od tri days između simptom početak i RT-PCR(1st–3rdkvartil: 1–7 dana). Zasnovana je longitudinalna analiza reaktivnosti antitijela na 251 opservaciji od 120 konvalacent pacijenata sa poznato vrijeme pošto pozitivno RT-PCR i vrijeme od pojave simptoma. Neutralization was izmjereno on 467 SARS-CoV{1}} RT-PCRpozitivno uzorci (N = 369 sa poznato vrijeme pošto pozitivan RT-PCR, N = 333 sa poznato vrijeme pošto simptom početak).

Dalje smo procijenili unakrsnu reaktivnost ABCORA 2.0 i 5.0 na lijevoj stranit-gotovo plazmaiz rutinske dijagnostike u prepandemijskoj kontrolnoj grupi with dokumentovano, nedavni HCV infekcija (Trening II, N = 75; OC43 (N = 27), HKU1 (N = 17), NL63      (N = 22), 229E (N = 9)). Cirkulira HCV je uobičajeno samo screened za inhospitalizirani, teške respiratorne infekcije i oslabljen imunitet pojedincikoji se rutinski podvrgavaju bratuad skrining za respiratorni infekcije. Dakle, in ovog pacijenta grupa, oboje smanjena antitelo reaktivnost zbog to imun kompromitujući ilipovišen HCV antibody reaktivnost zbog to nedavno ili ponavljajući HCV infekcija svibanjpojaviti. Kako je ova grupa dijagnozastatički relevantan mi razmatrano to razborit to uključi ovo kohorta as Trening II podaci set to verify ako krst-reaktivnost sa SARS-CoV-2 inABCORA javlja u ovoj postavci. Podaci o obuci II nisu uključeni u prag definition to ne gotovo-predstavljaju pojedinci sa teškom bolešću. Ovaj HCV-inficirangrupa prikazano sveukupno niže reaktivnost sa SARS-CoV-2 nego plazma izzdravo odrasli ali vazno pokazao br indikacija of unakrsna reaktivnost (sl.1a, b). Pandemic samples od anoniman krv donatori sa nepoznato SARS-CoV-2status prikupljeno in maja 2020 (N = 672) bili ne uključeno in obuku i validaciju kohorte.

Reagensi i ćelijske linije. His-tostarjeli SARS-CoV-2-izvedeno antigeni (receptor

vezujući domen (RBD), podjedinica S1 (S1), podjedinica S2 (S2), nucleocapsid proteina (N)) i S1 od ton četiri cirkulirajući HCoVs (HKU1, OC43, NL63, 229E) bili kupljeno iz Sino Biological Europe GmbH, Eschborn, Njemačka (DopunskiTable 12). Izvori, specifičnosti i koncentracija antitijela za detekciju i kontrolu i serumi koji se koriste za ABCORA i neutralizacijske testovets su na listi in Dodatna tabela 13. 293-T ćelije su dobijene iz Američke kolekcije tipskih kultura(ATCC CRL- 11268)55. HT1080/ACE2cl. 14 ćelije33 bili ljubazno obezbijedio P.Bieniasz, Rockefeller Univerzitet, NY. Oba ćelija linije bili kulturan in DMEMcontaining10 postoFCS.

Dizajn of multipleks perla esej ABCORA 2.0. Mi uspostavljena dva perla-zasnovanomultipleksirani SARS-CoV-2 imunoeseji (ABCORA 2.0 i ABCORA 5.0) touključivao niz SARS-CoV-2 i HCoV antigeni (Sino Biološki EvropaGmbH, Eschborn, Njemačka, Dodatna tabela 12). Četiri SARS-CoV-2 antigens- RBD, S1, S2, i N - bili uključeno in oboje ABCORA 2.0 i ABCORA 5.0.ANCORA 2.0 uključeno in dodatak S1 of HCV-HKU1, iABCORA 5.0 uključeno S1of sve cirkulirajući HCoVs (HCV-NL63, HCV-229E, HCV-HKU1, HCV-OC43). U brief, pojedinac MagPlex perle (Luminex Corporation, Austin, TX)    sa unique fluorescentna perla regioni bili izabrani za svaki antigen, perle bilispregnute i mješavine antigen spregnutih kuglicasbiliinkubirano sa pacijent plazma in a 96-dobro ploča set-gore. TheMedijan Fluorescentno Intenzitet (MFI) of plazma vezana za kugliceantibodies bio izmjereno koristeći a FlexMap 3D čitalac (Luminex Corporation,Austin, TX). Mi dizajniran the esej to fulfill the prateći kriterijuma: (i) visoko brzina-cifigrad, osjetljivost, i reproduktivnost, (ii) fleksibilan multipleks dizajn to omogućava direktno dodatak i/ili izmjena of antigeni; (iii) širok dinamičan domet;  (iv) opciono quantifikation of antitelo odgovore; (v) opciono snimanje ofanti-teloodgovore na HCoV i (vi) upotrebu u rutinine dijagnostika i istraživanja.

Izabrali smo sterical orijentacija uhvatiti preko anti-Njegovo antitela to osigurati a prikaz homogenog antigena. Stoga, karboksilirani MagPlex perle (Luminex

Corporation, Austin, TX) bili spojeno sa anti-Njegovo antitelo (Sino Biološki

Evropa GmbH, Eschborn,Njemačka, Dodatna tabela 13), a zatim spojeno sa His-tagovanimantigeni koristeći Bio-Plex Amine spojnica (Bio-Rad LaboratorijeAG, Cressier, Švicarska) prema iuputstva i asopisano56.

Serum/plazma titracija se općenito smatra najpreciznijim strategy toretrieve kvantitativno informacije on antitelo reaktivnost. kako god, in dijagnostički koristititestovi idealno trebalo bi dostaviti (semi)-kvantitativno informacije od a pojedinačni serumrazblaživanje to dozvola dovoljnu propusnost. Završeni uslovi analize pokrivali su a 2-log MFI raspona u svim ispitivanim kombinacijama antigen-Ig (dopunska slika 1).Ratifikacija the valjanost of koristeći a single plazma razblaživanje, mi confirmed to plazmaod SARS-CoV-2 pozitivno pacijenata i pre-pandemija SARS-CoV-2negativanuzorci plazme pokazuju optimalnu dozu-odgovor krive gotovo a širok plazma razblaživanjedomet (Dopunski Fig. 1f). Važno je, a 1/100 razblaživanje of plazma bio in sveslučajevima zatvori do maksimalnog signala, naglašavajući to povećanje plazmekoncentracija ne bi povećala intenzitet signala, već bi radije endanger opadajućisignals zbog to prozone efekti (Dopunski Fig. 1f).

Maksimalno anti-Njegovo antitelo učitavanje bio postignuto at 5 µg antitelo per milionaperle (Supplemulaz Fig. 1c) i korišteno as a standard spojnica stanje. U the finalprotokol,inkubirano je pet miliona magnetnih kuglica povezanih sa anti-His antitelom Njegovo-tagged antigeni razrijeđen u PBS-u u koncentraciji od 320 nM.Fikoeritrin (PE) označena sekundarna antitela specifična za IgG, IgA, ili IgM bilikoristi se kao detektor antitijela (dopunskiTable 13). Kvaliteta kontrolu of theantigen loading bio izvedeno by inkubiranje the perle sa monoklonskiantitijela koja ciljaju na odgovarajući CoV-derived antigen as detaljan inDodatna tabela 12. Analiza je obavljena sah the FlexMap 3D čitalac(Luminex Corporation, Austin, TX) sa the akvizicija of at najmanje 50 perle perperlica region. Rezultati are snimljeno as MFI per perla region.

Uvedeno je nekoliko mjera kontrolealled to utvrditimeđu-i intra-esejperformanse. Da bi se utvrdila niska analiza do-esej varijabilnost, veliko serije ofindividualni antigen napunjen beads bili pripremljeno i smrznuto in alikvoti do korišteno at-20 stepenC to zaobićithepropadanje of the antigen-spojeno perle (dopunska slika 1). Pojedinačne spojene perle su pomiješane na dan testiranja do yiel the potrebno antigenkoktel od perli. Kokteli su sadržavali 60 perli strer perla region per µl. U dodatak toregije SARS-CoV-2 i HCV kuglica, svaki koktel je sadržavao ispražnjenjey perlica region (br antigen spojeno) to kontrolu za unspecific vezivanje. Kvaliteta kontrola i validacija procedure za the FlexMap 3D instrument bili urađeno on svaki dan of theeksperiment accnaručivanje totheproizvođač's instrukcije. The varijabilnost of the esejbio analizirano as slijedi56: plazma uzorci od 20 RT-PCR confirmed SARS-CoV- 2 zaražena pacijenta su spojena i testirana over a domet of sedam razblaženja in 31  različiti titracije izvedeno on 10 drugačije dana (Dopunski Fig. 2). Preko putasve antigeni i Ig casovi, signale bili zadržano gotovo the test period of 25dana post zrna spojnica. Koeficijenti varijacije (CV) signala vezivanja preko titracijeod 12 kombinacije antigen-Ig klasenacije dokazano nisko (domet: 0.010–0. 128, medijana  0.059, dopunska slika 3c, d, dopunske tabele 1, 2). Isti dan i iz dana u danvarijabilnost strroved nisko i uporedivi (Dopunski Fig. 3e, f). Ispod a 1/ 100 plazma koncentracija, životopis povećana izrazito (Dopunski sl. 3d),         definišući 1/100 kao najveću koncentracijuon (najniže plazma razblaživanje) to biti testirano in the esej. Razrjeđenje plazme 1/100 je stoga definirano kao osnovnorazblaživanje za skrining plazma in ABCORA 2.0 kada a kvalitativno (tj. prisustvo ili odsustvo SARS-CoV- 2specifična antitela) ili semi-kvantitativno (tj. intenzitet signala MFI) očitavanje jerequired.

Sva ABCORA mjerenja su bila derived od single mjerenja osim akonavedeno drugačije. Za mjerenje specifičnosti SARS-CoV-2c antitela in pacijent plazma,toplotno inaktivirano plazma (1 h at56 stepeniC) bio razrijeđen 1/100 in PBS-BSA1 postoosim akodrugačije navedeno. 50 µl razblaženoged plazma bili inkubirano sa 50 µl of the ABCORAantigen perla koktel za 30 minuta at soba temperatura in 96-dobro tanjire, oprane tri puta sa PBS-BSA 1 posto, i inkubirano u odvojenim reakcijama with phycoerythrin (PE)-označeno detektor antitela za IgG, IgA ili IgM at a fikonačna koncentracija of 1/500 u PBS-BSA 1 posto. Ovo razrjeđivanje je prethodno bilo definirano pomoćutitracija detektorskih antitijela kako bi se dobili optimalni MFI signali. Nakon 45 minutes ofinkubacije na sobnoj temperaturi, perle su tri puta isprane sa PBS-BSA1 postoi analizirano in 96-dobro ploče na FlexMap 3D čitaču (Luminex Corporation, Austin, TX). A minimum of 50 perla čita per antigen bio stečeno.

Za kontrolu pravog unakrsnog reaktivnog antitijelagodine, svaki plazma uzorak bioocijenjeno sa beads bez antigen (prazan perla kontrolu) in kombinacija kojisvaki detektor antibody. Za analiza, sirovo MFI vrijednosti bili transformisan to MFI-FOE to ispravan za pozadini vezivanje.Ustanovili smo srednje prazne perle MFI-FOE za IgG, IgA i IgM zdravih donora prije pandemije (N=1016) i set Značenje MFI-FOEplus4x standardna devijacija kao prag za kontrolu prazne perle.U apsolutno nivoa, ove pragovi iznosio to MFI-FOE 41,58 (IgG), 55,91 (IgA), i 269,47 (IgM).Mmjerenja za koji the prazan perla kontrolu snimljeno vrijednosti above ovo prag bili razmatrano nevažeći i ponovljeno.

Svaka ploča za Luminex analizu 96-jažica je postavljena na kontain the isto set ofkontrolu uzorci, naime 7 serijski 4-fold razblaženja SARS-CoV-2 pozitivne kontroledonator bazen (N = 20 donatori, počinjati razblaživanje 1/100, Dopunski Fig. 1f) i a pre-pandemija zdravo donator bazen (razblaživanje 1/100, N =20 donatora, dopunskiSlika 1f). Ove pozitivne i negativne kontrole omogućavaju kontrolu performansi testancepreko nezavisnih mjerenja i dodatno omogućitiretrospektivnostandardizacija protiv eksternih kontrola ako je potrebnoded.

Definicija of SARS-CoV-2 seropozitivnost in ABCORA 2.0 i ABCORA 5.0. Torazlikovati SARS-CoV-2-specifična od unakrsno reaktivnih antitijela,efined MFI- FOE pragovi za svaki od 12 SARS-CoV-2 antigena i kombinacije Ig klases na bazi plazma antitela reaktivnost in obuku kohorte (Dopunski Stolovi 3 i 4). Ovo uključuje zdrave donore prije pandemije strlasma (Trening I, N = 573),donatori sa nedavno HCV infekcija (Trening II, N = 75; OC43 (N = 27), HKU1 (N = 17), NL63 (N = 22), 229E (N=9)) i donatori sa potvrđenom infekcijom SARS-CoV-2 (Trening III, N = 175). Pragovi bili set to minimiziratilažno pozitivnihdok osiguravanje osjetljivost za SARS-CoV-2otkrivanje antitela i da se dođe do anukupna specifičnost iznade99 postoi uključeno nivoa za granica-linija reaktivnost za IgGRBD,IgG S1, i IgG N to dopustiti takođe skroman antitelo reaktivnost to ove antigeni to biti ispitan. MFI-FOE čita of pojedinac uzorci bili transformisan intovrijednosti signala-over cut-off (SOC) (MFI-FOE/prag). SOC values su korišteno zamagarcasing pozitivno reaktivnost za svaki pojedinac antigen-antitelo klasa kombinacija, sa SOC > 1 označava pozitivnu reaktivnost, a SOC < 1 označava negativnu reaktivnost.Kada postavljanje pojedinac pragovi, to mora biti razmatrano to za svaki of the 12 probed aktivnosti može doći do unakrsne reaktivnosti. Sa 12 pojedinačnih SOC parametara snimljena, ukupna specifigrad će smanjiti ako bilo koji pozitivno SOC samostalno suffices to stopa a uzorak sveukupno as SARS-CoV-2 antitelo pozitivno. To primjer:Pretpostavljam nezavisnih odgovora, čak i visokih 99 posto specifičnosti za svaki antigen će dodati to ukupna niska specifičnost od 88 posto u cijelom testu. Stoga smo zahtijevali for SARS-CoV-2 pozitivno pozivanje in ABCORA 2.0 a minimum of dva specifigradova to dosegaktivnost goretheprag. Kombinovane vrednosti SOC-a koje se koriste za definisanje ukupnogserostatus datog uzorka detaljno je prikazan u Dodatnoj tabeli 5. Za IgG RBD, S1, i N,za koje smo takođe evidentirali graničnu aktivnost SPC, dozvolili smo akombinacija 1 antigena reaktivnost SOC > 1, druga reaktivnost SOC > granična. The final prag i pozitivno poziv kriterijuma dozvoljeno za diferencijaciju djelimičnog (rano serokonverzija sa samo IgM i IgA odgovore) to pun ser-          konverzija (ukljluding IgG odgovore) (Dopunski Table 5). U dodatak, kriterijume označavaju uzorke sa slabom reaktivnošću i/ili neodređenom reaktivnošću(Dodatna tabela 5).

Da olakšam poređenje izmeđueen ABCORA 2.0 i ABCORA 5.0 the istoprag graničnici su korišteni za ABCORA 5.0. Odlučili smo da ne stvaramo posebne granične vrijednostipragovi za reaktivnost HCV antitijela kao an precizan definition of a negativanodgovor je složen zbog široko rasprostranjene izloženosti HCoVs i konsiderableunakrsna reakcija antitelativnost između njima. HCV odgovore bili kako god uključeno u statisticical analize as MFI-FOE vrijednosti.

Definicija of SARS-CoV-2 seropozitivnost koristeći logistički regresija klasifikacija.

Classifikation of seropozitivan protiv seronegativni uzorci in Realizovana je ABCORA 2. 1koristećilogistički regresija. The identičan obuku i validacija podaci korišteno za the osnivanje of ABCORA 2.0 bili korišteno. As the ABCORA 2.0 vezujuće reaktivnosti su bile u visokoj korelaciji, uključili smo sljedeće varijable u model (dopunski Fig. 6a): the znači vrijednost svih IgG MFI-FOE odgovora (RBD, S1, S2, N), the znači vrijednost of IgA MFI-FOE odgovori na RBD, S1 i S2, i srednja vrijednost vrijednost IgM MFI FOE odgovora na RBD, S1 i S2. IgA i IgM odgovors do N su isključeni jer nisu bili grupirani s drugim odgovorima istog Ig klasa (Dopunski Fig. 6a). Logistička regresija je korištena za procjenu i predviđanje vjerovatnoća datog uzorkae to biti pozitivno (p) as opisano in jednačina (1).

stmetara  0, G, A, i  M bili procijenjeno on the obuku skup podataka. A uzorak je tada definisano kao pozitivno ako je njegova predviđena vjerovatnoća da će biti pozitivna većaa prag c/. Ovaj prag je definiran kako bi se postigla specifičnost od najmanje 0.99 i maksimalna osjetljivost na skup podataka za obuku (slično to c za the nasumično šuma). Usažetak, in ABCORA 2. 1, svaki novi uzorak se definira kao seropozitivan ako je njegova vjerovatnoća da je seropozitivan kako je procijenjeno logističkom regresijom iznad c/. Analizira mire izvedeno u R verzijin 3.6.3. Definicija of SARS-CoV-2 seropozitivnost koristeći nasumično šuma klasifikacija.  Klasifikacija seropozitivnih versus seronegativni uzorci inthekontekstu of ANCORA 2.0 i ABCORA 5.0 je bio realized koristeći a nasumično šuma pristup prateći theosnovna postavka random šume as opisano in57. The nasumično šuma sebe bio izgrađen ansambla od 1000 klasifikacionih stabala koji koriste MFI-FOE odgovore (IgA, IgG,iIgM protiv RBD, S1, S2,N). The vjerovatnoća of a uzorak biće pozitivno as pre-  diktira nasumična šuma je prosjek probabilities gotovo sve 1000 drveće. Konačno, uzorak je definiranned as pozitivno ako its vjerovatnoća of biće pozitivno je gore a threshold c, koji je defined as to dobiti a specifigrad of at najmanje 0.99 i a maksimalan osetljivost u vozuing skup podataka. U sažetak, bilo koji novo uzorak je defined asseropozitivna ako its vjerovatnoća of biće seropozitivan as procijenjeno by the nasumičnošuma je iznad threshold c. Mi sprovedeno a serije of nasumično šuma analize koji su uzeti u obzir ili samo SARS-CoV-2 odgovore ili SARS-CoV-2 i HCV   odgovore in ABCORA 2.0 i ABCORA 5.0: ABCORA 2.2 i ABCORA 2.3 su biliobučeni i korišteno za predviđanje on ABCORA 2.0 podaci i uključeno samo SARS-  CoV-2 odgovore ili SARS-Odgovori CoV-2 i HKU1. ANCORA 5.4 (samo odgovori SARS-CoV-2) i ABCORA 5.5 (SARS-CoV-2 i HCVodgovore) bili obučeni on ABCORA 5.0 podaci. Detalji o uključivanju podataka za odnosno modeli su na listi in Dopunski Table 3 i Dopunski Table 10. Analize su obavljene u R verziji 3.6.3 korištenjem paketaes randomForest i     ranger58–61.

Kako bismo osigurali robusnost naših nalaza, izvršili smo seosjetljivost analiza randomizacijom skupove podataka za obuku i validaciju koristeći 5-preklopnu unakrsnu validacijumetoda. Oba setaof pozitivno i negativi uzorci bili podijeljeno into five jednakadijelovi i mi defined to način five validacija setovi (koji se sastoji of the i-th set ofpozitivne ithe i-th set of negativi, i = 1.5). The odmor of the podaci bio korišteno zaobuku the ABCORA 2.3 slučajna šuma. Za svaki set za validaciju, specifičnost iosjetljivost of the nasumično šuma bili izračunati on the obuku, validacija, i obukuplusvalidacija setovi (Dopunski Tabela 6).

Validacija i verifikacija koristeći vanjski kontrole. Mi korišteno the Anti-SARS-  CoV-2 Panel za verifikaciju za serološke testove (NIBSC kod: 20/B770, NIBSC) toprovjerite performanse ABCORA 2.0 i ABCORA 2.3 testa. Serumsobiljeof the verifikation panel izmjereno by ABCORA 2.0/2.3 kako je opisano i rezultatiu poređenju sa rezultatima komercijalno dostupnih testova koje je objavio NIBSC (32 i Dodatna tabela 7). We furtona verified the osjetljivost of the ABCORA 2 test in detektovanje SARS-CoV-2 infekcija in direktno poređenje sa komercijalnimtestovi. Antibody status of plazma od SARS-CoV-2 pozitivno pojedinci (N = 171) bio analizirand sa the prateći test sistema: Uključeno test sistema ciljano the N proteina (Elecsys® Anti-SARS-CoV-2 (Roche Diagnostics GmbH)), region RBD of the S proteina (Elecsys® Anti-SARS-CoV-2 S test (Roche Diagnostics GmbH)),i the S1 podjedinica (EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG)) (DopunskiTabela 8). Svi testovi su obavljeni premathe proizvođač's uputstva in the dijagnostika jedinica of the institut of Medicinski Virology, University of Zurich, Switzerland.