Molekularni putevi povezani s promocijom dugovječnosti i kognitivnim poboljšanjem Cistanche Tubulosa u Drosophila

za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Wei-Yong Lin et al

sažetak:

Pozadina:Smatra se da je proces starenja, uključujući fizičku disfunkciju i oštećenje pamćenja vezano za starenje (AMI), u korelaciji s kumulativnim oksidativnim oštećenjima i signalnim putevima inzulina/IGF-1. Svrha: Ova studija je bila razjasniti in vivo efekte na odlaganje starenja i poboljšanje AMI i temeljnih molekularnih mehanizamaCistanche tubulosa(CT), biljka koja se koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini za poboljšanje seksualne funkcije i liječenje disfunkcije bubrega

Metode:Muve, liječene i neliječene CT-om(Cistanche Tubulosa), uočeni su za životni vijek, otpornost na oksidativni stres s H2O2 ili parakvatom, test gladovanja, kognitivno ponašanje s T-mazeom i nivoi transkripta ciljnih gena s kvantitativnim RT-PCR.

Rezultati:Administriranje CT(Cistanche Tubulosa)produžio srednji i maksimalni životni vijek i povećao otpornost na oksidativni stres kod muva. CT(Cistanche Tubulosa)suplementacija je također poboljšala formiranje pamćenja kod mladih mušica i potisnula AMI nakon starenja. Nekoliko gena i signalnih puteva, uključujući mehaničku metu rapamicina (mTOR) i Notch mreže, identificirano je kao uzrok ovih farmakoloških efekata i promjena u ekspresiji gena glutamatnih receptora.

zaključak:Naši rezultati ukazuju da CT(Cistanche Tubulosa)suplementacija može doprinijeti usporavanju fenotipova starenja i ublažavanju kognitivno-bihejvioralnog opadanja kod muha, što ukazuje na potencijalnu primjenu za poboljšanje ljudskog zdravlja i smanjenje osjetljivosti na poremećaje povezane sa starenjem.

Ključne riječi:starenje,Cistanche tubulosa,Kognitivno ponašanje, Herb

Click to Cistanche proizvodi od stabljike

Uvod

Kako starija populacija raste širom svijeta, omogućavanje zdravog starenja i dugovječnosti postaje sve važnija briga za javno zdravlje za nauku, društvo i oblast medicinske zaštite. Predloženo je da proces starenja kontrolišu složeni mehanizmi, vođeni širokom interakcijom genetskih faktora i faktora okoline. Zbog postepenih oštećenja na ćelijskom i tkivnom nivou, starost je faktor rizika i u velikoj je korelaciji sa podložnošću hroničnim bolestima kao što su rak, kao i kardiovaskularnim i neurodegenerativnim bolestima (Kenyon, 2005). Starenje također smanjuje sinaptičku aktivnost, sintezu novih proteina i kognitivne funkcije. Ove funkcionalne promjene doprinose oštećenju pamćenja (AMI) povezanom sa starenjem (Burke i Barnes, 2010; Schimanski i Barnes, 2010). Stoga bi razvoj lijekova za odgađanje patologije povezane sa starenjem i kognitivnog starenja mogao biti od koristi za kvalitet ljudskog života. U ovoj studiji koristili smo Drosophila melanogaster, koja je idealan organizam za in vivo studije starenja zbog svog kratkog vijeka trajanja, kako bismo procijenili efikasnost lijeka i istražili molekularne mehanizme koji su u osnovi ublažavanja starenja i AMI.

Herbacistanche, također poznat po kineskom nazivu Rou CongRong, je parazitska biljka koja je uglavnom rasprostranjena u pustinjama sjeverozapadne Kine. Dvije vrste Cistanche, Cistanche deserticolaY. C. Ma iCistanchetubulosa(Schrenk) Wight su uključeni u Kinesku farmakopeju (izdanje 2005.) zbog sličnih hemijskih sastojaka i farmakoloških aktivnosti. Njihov ekstrakt stabljike se naširoko koristi hiljadama godina kao tonik, uglavnom za liječenje različitih simptoma, uključujući nedostatak funkcije bubrega, impotenciju, neplodnost i za olakšavanje katarze, kako je opisano u drevnim kineskim medicinskim knjigama. Brojni hemijski sastojci, uključujući eterična ulja, feniletanoidne glikozide (PhG), iridoide, lignane i saharide, izolovani su izCistanchevrste, i dvije glavne komponente PhG, akteozid i andehinakozid, obično se biraju kao markeri za procjenu kvaliteta Herba cistanche zbog njihovog značajnog farmakološkog djelovanja (Wang et al., 2012).

Cistanche tubulosa(CT) ekstrakti posjeduju različite biološke funkcije koje uključuju moduliranje imunološke aktivnosti, poboljšanje seksualne funkcije, promicanje rasta kose i druge prednosti u pogledu antioksidacije, hepatoprotekcije, antiosteoporotskog djelovanja i antitumora (Li et al., 2016.; Seok et al., 2015. Wang et al., 2012.). Dodatno, in vitro studija je otkrila da Herbacistancheekstrakt može zaštititi neurone slične dopaminu od H2O2-indukovanog oksidativnog oštećenja i značajno povećati nivoe nervnog faktora rasta i neurotrofnog faktora iz mozga (Lin et al., 2013). Ehinakozid je spriječio smrt dopaminskog neurona u modelu Parkinsonove bolesti na mišu sa MPTP lezijom (Zhao et al., 2010). Štaviše, CT(Cistanche Tubulosa)Ekstrakt je poboljšao kognitivnu disfunkciju kroz smanjenje taloženja amiloida i povećanje nivoa acetilholina i dopamina u pacovskom modelu Alchajmerove bolesti (AD) (Wu et al., 2014). Iako terapijski učinak Herbacistanchejoš uvijek je potrebno potvrditi, male veličine, ne-placebo kontrolirano kliničko ispitivanje na CT-u(Cistanche Tubulosa)Ekstrakti glikozida pokazali su da lijek ima potencijal za liječenje pacijenata sa blagim do umjerenim AD i da ima relativno blage nuspojave, čak i nakon dugotrajne primjene (Guo et al., 2013). Ovi podaci sugeriraju da ekstrakti glikozida u Herbicistancheimaju neuroprotektivno i antidemencijsko djelovanje. Uprkos raznim prednostima CT-a(Cistanche Tubulosa)Njegovi molekularni mehanizmi i efekti na odlaganje starenja i ublažavanje AMI nisu razjašnjeni. U ovoj studiji učinci CT(Cistanche Tubulosa)o značajnom produženju životnog vijeka ispitana je poboljšana otpornost na stres iz okoline i potisnuta kognitivna disfunkcija povezana sa starenjem kako bi se utvrdila moguća klinička korisnost CT-a(Cistanche Tubulosa)u usporavanju procesa starenja.

Materijali i metoda

Biljna medicina

Identifikacija porijeklaCistanche tubulosa(Schrenk) Wight(Orobanchaceae) (CT) je verifikovan u Ko Da PharmaceuticalCo. Ltd. (Taoyuan, Tajvan), gdje su čuvani uzorci vaučera (10.603.205) i gdje se proizvodi CT koncentrirani biljni lijek. Ukratko, osušena mesnata stabljika CT ekstrahirana je u 12- puta prokuhanoj vodi 1 h nakon čega je uslijedila filtracija. Filtrati su sakupljeni i podvrgnuti vakuumu i koncentraciji sniženog pritiska tokom 1 h da bi se dobili ekstrakti. CT ekstrakti su pomiješani sa škrobom u omjeru 1:1 (w/w) i podvrgnuti granulaciji sprejom za dobijanje CT praha.

Održavanje zaliha mušica i mjerenje životnog vijeka

Linija divljeg tipa korišćena u ovoj studiji bila je CantonS, dobijena od Bloomington Drosophila Stock Centra. Muhe su uzgajane i održavane u standardnoj podlozi od kukuruznog brašna na 25 stepeni u 50-60 posto relativne vlažnosti pod ciklusom od 12- h svjetlo-mrak. Odrasle muhe koje su se pojavile sakupljene su u roku od 24 h i razdvojene po spolu. Od ranog odraslog doba, muhe su dopunjene CT-om. CT(Cistanche Tubulosa)prašak je rastvoren u vodi i dodan u medijum od kukuruznog brašna u koncentracijama od 5,4, 10,8 i 21,6 mg/ml, koje su bile proporcionalne efektivnoj dnevnoj dozi za oralnu primenu kod ljudi. U analizi životnog vijeka, dvadeset do trideset muha je uzgojeno u bočici s hranom sa ili bez CT-a(Cistanche Tubulosa); najmanje 250 muha je provedeno za svaki tretman. Bočice s hranom su se mijenjale svaka 3 do 4 dana i tada su se brojale mrtve muhe

Testovi otpornosti na stres

Odrasle muhe su sakupljene, a zatim prethodno tretirane kontrolnom ishranom bez CT(Cistanche Tubulosa)i eksperimentalne dijete sa dodatkom 5,4, 10.8 i 21,6 mg/ml CT tokom 20 dana na 25 stepeni. Za analizu gladovanja, muhe su držane u bočicama samo s mokrim papirima i procijenjene su njihove izdržljivosti u odnosu na oksidativni stres izazvan gladovanjem. Za testove oksidativnog stresa, muhe su prebačene u bočice bez hrane koje su sadržavale filter papir s vodikovim peroksidom (H2O2) (Sigma Aldrich) u 5 posto otopini glukoze kako bi se procijenila otpornost muha na H2O{14}}induciran hidroksilni radikal (OH −) stres. Slično, muhe su prebačene u bočice koje sadrže filter papir zasićen sa 10 mM parakvata (Sigma-Aldrich), koji stvara superoksidne anjone (O2 −) koji uzrokuju oksidativna oštećenja životinja. Muhe su ocjenjivane za mortalitet najmanje tri puta dnevno dok sve nisu bile mrtve. Obavljeno je najmanje 250 muha po tretmanu. Za penjanje, recimo, muhe koje su bile izložene parakvatu 0 i 16 h stavljale su se u plastičnu bočicu i lagano udarale o dno. Broj muha na vrhu bočice izbrojan je nakon 18 sekundi penjanja.

Procjena plodnosti

I nevini muškarci i ženke hranjene su 5,4 i 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)20 dana služili kao eksperimentalne grupe. Deset eksperimentalnih ženki je spareno sa jednakim brojem nevinih mužjaka, koji su bili stari 9-dan i nisu bili podvrgnuti CT. Slično, eksperimentalni mužjaci su spareni sa nevinim ženkama u istom stanju. Sparene ženke su zatim prebačene u novu bočicu za polaganje jaja na 24 h, a ukupna jaja položena u bočice su ručno prebrojana. Indeks plodnosti izračunat je kao srednja dnevna proizvodnja jaja po ženki. Obavljeno je najmanje pet bočica po tretmanu, a ukupno muha n=50–80.

Olfaktorno asocijativno učenje i pamćenje

Muhe su sakupljene nakon eklozije i prethodno tretirane sa 5,4, 10,8 i 21,6 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)služile su kao eksperimentalne grupe, a kontrolne muhe nisu primile CT(Cistanche Tubulosa)5 i 20 dana na 25 stepeni. U skladu sa prethodnom studijom (Dubnau et al., 2001.) izveden je jedan trening trening. Ukratko, otprilike 100 muva je bilo izloženo uzastopno dvama mirisima, ili 3-oktanolu (OCT, Sigma-Aldrich) ili 4-metil cikloheksanolu (MCH, Sigma-Aldrich). Muhe izložene prvom mirisu (uslovljeni stimulus, CS plus) su uparene sa 80 V električnim šokovima, a zatim su dobile drugi miris (CS-) bez šokova. Sposobnost učenja je određena odmah nakon treninga i sposobnosti 3- i {{ 12}}h memorija je provodila testove nakon treninga 3 odnosno 24 h. Za izvođenje testa, dresirane muhe su zarobljene u izbornoj tački T-labirinta u kojem su istovremeno bile izložene OCT i MCH. Indeks učinka (PI) izračunat je da predstavlja uvjetovano izbjegavanje mirisa. PI od nula označava distribuciju 50:50, a API od 100 pokazuje distribuciju 0:100 dalje od CS plus mirisa.

Mjerenja nivoa transkripta putem kvantitativne PCR (qPCR) u realnom vremenu

Muhe su sakupljene nakon eklozije i prethodno tretirane sa 5,4 i 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)20 dana na 25 stepeni služile su kao eksperimentalne grupe, a kontrolne mušice nisu primile CT. Ukupna RNK je ekstrahirana korištenjem RNeasy Mini kita (Qiagen), a cDNK je sintetizirana iz ukupne RNK reakcijom reverzne transkripcije korištenjem reverzne transkripcije cDNK visokog kapaciteta (Thermo Fisher Scientific). Nivoi transkripta ciljnih gena su kvantifikovani putem kvantitativne lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu (Applied Biosystems ViiATM 7 Real-Time PCR System) korišćenjem FastStart SYBR Green Master (Roche) prema uputstvima proizvođača. Relativna zastupljenost transkripata je normalizovana korišćenjem komparativne metode praga ciklusa sa genom za domaćinstvo, RpLP0, kao internim standardom. Razlike relativne ekspresije u ciljnim genima eksperimentalnih grupa su normalizovane na one u kontrolnoj grupi i predstavljene kao kratka promena. Prajmeri za ciljne gene su navedeni u Dodatnoj tabeli 1.

Izgradnja i analiza mreže

Za analizu funkcionalne interpretacije i bioloških procesa posredovanih različito eksprimiranim genima koje smo identificirali, korišćena je Baza podataka za anotaciju, vizualizaciju i integrirano otkriće (DAVID) za označavanje i analizu obogaćivanja Kjoto enciklopedije gena i genoma (KEGG) puta i gena Ontologija za ove gene (Jiao et al., 2012). Da bi se analizirale direktne i indirektne interakcije različito eksprimiranih gena, lista gena je također učitana u alat za pretraživanje za pronalaženje interakcijskih gena/proteina (STRING) kako bi se dohvatile informacije o interakciji i generirale mreže interakcija proteina (Franceschini et al., 2013).

Statistička analiza

Svi eksperimenti su sprovedeni sa najmanje tri nezavisne replike, a statističke analize su obavljene sa softverom SigmaStat v3.5 (Systat Software, Inc., IL). Podaci za produženje životnog vijeka i izazove oksidativnog stresa izvedeni su sa ukupnim brojem muha u rasponu od 250-350, a test log ranga je procijenjen za različite analize. Grupna poređenja za procjenu plodnosti i kognitivni test evaluirana su jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA), nakon čega je uslijedio Dunnett-ov post-hoc test. Ostala eksperimentalna poređenja su napravljena izvođenjem Studentovog t-testa u poređenju sa kontrolnom grupom. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM, a p-vrijednost od < 0,05="" smatrana="" je="">

Rezultati

Dodatak CT (Cistanche Tubulosa) produžava životni vijek muva

Da se ispita da li je CT(Cistanche Tubulosa)suplementacija može produžiti životni vijek mušica, mušicama su dodavane 5,4, 10,8 i 21,6 mg/ml CT odmah nakon eklozije na 25 stepeni tokom eksperimentalnih procedura. Naši podaci su ukazivali da je CT(Cistanche Tubulosa)suplementacija može produžiti životni vijek i mužjaka i ženki muha. Kao što je prikazano na sl. 1A, životni vijek mužjaka je produžen svim dozama CT-a(Cistanche Tubulosa). Prosječni životni vijek grupa koje su uzimale 5,4, 10,8 i 21,6 mg/ml CT značajno se povećao za 18,9 posto, 10,3 posto, odnosno 9,9 posto. CT(Cistanche Tubulosa)takođe značajno povećao maksimalni životni vek svih CT grupa u poređenju sa kontrolnom grupom sa 88 na 102, 98 i 102 dana nakon tretmana sa 5,4, 10,8 i 21,6 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa), odnosno. Kod žena, CT(Cistanche Tubulosa)značajno povećao srednji životni vek CT grupa u poređenju sa kontrolnom grupom (slika 1B). Prosječni životni vijek se povećao na 18,8 posto sa 5,4 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)i 5,5 posto i 6,7 posto sa 10,8 i 21,6 mg/mlof CT, respektivno. Također smo primijetili da je maksimalni životni vijek značajno produžen sa 91 dana (kontrola) na 109, 98 i 102 dana nakon tretmana sa 5,4, 10,8 i 21,6 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa), odnosno; maksimalna magnituda povećanja maksimalnog životnog vijeka bila je 19,8 posto pri 5,4 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa). Naši rezultati sugeriraju da CT(Cistanche Tubulosa)dodatak ishrani značajno produžava životni vijek i mužjaka i ženki muha. Kurkumin (10 μM) je korišten kao pozitivna kontrola i efikasan u produženju životnog vijeka, kao što je prikazano na Dodatnoj slici 1.

Dodatak CT povećava otpornost na gladovanje i oksidativni stres

Produženje životnog vijeka često je povezano s povećanom otpornošću na oksidativni stres tokom procesa starenja. Procijenili smo da li je CT(Cistanche Tubulosa)suplementacija povećava otpornost na oksidativni stres. Mužjaci i ženke muha prethodno su tretirane različitim dozama CT-a(Cistanche Tubulosa)tokom 20 dana i procijenjeno za njihovo preživljavanje nakon gladovanja (slika 2A). Srednje vrijeme preživljavanja i maksimalni životni vijek oba spola, u poređenju sa onima u kontrolnoj grupi, pokazali su značajno povećanje u CT grupama od 5,4 i 10,8 mg/ml, ali ne i u21 .6 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)grupa. Prethodno tretirane mušice su također procijenjene u pogledu njihovog preživljavanja nakon izazova s ​​H2O2 i parakvatom, koji proizvode reaktivne vrste kisika (ROS) da pokreću ćelijsko starenje i ćelijsku smrt. Našli smo taj CT(Cistanche Tubulosa)zaštitili i mužjake i ženke od toksičnosti H2O2 i produžili njihov srednji i maksimalni životni vijek (slika 2B, p < 0.01 i 0,001, pri 5,4 i 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa), odnosno). Uočen je i sličan trend koji pokazuje povećanu otpornost na izazov parakvata. Mužjaci hranjeni muhama sa svim dozama CT, a ženke, posebno one sa dodatkom 5,4 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa) (Cistanche Tubulosa), preživjeli su duže od kontrolnih (slika 3A, p < 0.001).="" što="" se="" tiče="" sposobnosti="" penjanja,="" i="" mužjaci="" i="" ženke="" muhe="" su="" primile="" 10,8="" mg/ml="">(Cistanche Tubulosa)pokazao oslabljenu lokomotornu disfunkciju izazvanu parakvatom 16 h nakon paraquatchallengea (slika 3B, svi p < 0.05).="" ovi="" rezultati="" otkrivaju="" da="" suplementacija="" ct-om="" poboljšava="" otpornost="" na="" neki="" oksidativni="" stres,="" što="" sugerira="" da="">(Cistanche Tubulosa)-indukovano produženje životnog veka povezano je sa povećanom antioksidativnom odbranom.

Efekti CT (Cistanche Tubulosa) na reproduktivni kapacitet

Budući da teorija starenja ukazuje da proces starenja negativno utječe na reprodukciju, ispitali smo da li CT(Cistanche Tubulosa)utječe na reproduktivnu sposobnost analizirajući sposobnost polaganja jaja odraslih muha. Odrasle muhe su sakupljene nakon eklozije, razdvojene po spolu, i primijenjene su 5,4 i 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)za 20 dana. Djevičanskim mužjacima ili ženkama muha primijenjena je CT(Cistanche Tubulosa)bili su spareni sa 9-dan starim muhama bez CT(Cistanche Tubulosa). Primijetili smo povećanje dnevnog broja položenih jaja po ženki ovisno o dozi, odnosno 30,3 posto i 57,2 posto starih muha tretiranih s 5,4 i 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa), u poređenju sa kontrolama (slika 4, p < 0.05).="" ovi="" podaci="" sugeriraju="" da="">(Cistanche Tubulosa)suplementacija bi mogla olakšati reproduktivnu sposobnost starijih žena, ali vjerovatno ne i kod starijih muškaraca.

CT (Cistanche Tubulosa) suplementacija poboljšava kognitivne sposobnosti

Utvrdili smo da li je CT(Cistanche Tubulosa)suplementacija blagotvorno utiče na sposobnost učenja i pamćenja, sproveden je jedan ciklus olfaktorno-asocijativnog treninga. Procjenjujemo performanse učenja kao i 3- i 24-h memoriju, koja se smatra srednjoročnom i dugotrajnom memorijom, respektivno. Prvo, muhe su dopunjene različitim dozama CT-a(Cistanche Tubulosa)za 5 dana. Sposobnost učenja bila je slična i u CT iu kontrolnoj grupi (slika 5A). Što se tiče 3-h memorije, CT od 10,8 mg/ml(Cistanche Tubulosa)grupa je imala veći indeks učinka (PI) od kontrolne grupe (slika 5B, 51,5 ± 3,2 naspram 42,6 ± 2,1), iako nema značajne razlike. Štaviše, 5,4 i 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)značajno poboljšao {{0}}h memoriju muva u poređenju sa kontrolama (slika 5C, PI=41.6 ± 3.6 i 45.9 ± 3.0 u odnosu na 29.6 ± 2.9, respektivno , p < 0.05="" i="" 0.01).="" ovi="" rezultati="" su="" pokazali="" da="" ct="" suplementacija="" poboljšava="" formiranje="" pamćenja="" kod="" mladih="" mušica.="" drugo,="" dok="" je="">(Cistanche Tubulosa)suplementacija je povećala dugovječnost i oksidativnu otpornost muha, dalje smo utvrdili može li suplementacija također poboljšati kognitivno ponašanje kod ostarjelih muha. Muhama je davana standardna hrana sa ili bez 5,4, 10,8 i 21,6 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)20 dana za oponašanje starenja; muhe su dopunjene ovim dozama CT(Cistanche Tubulosa)imale značajno veće PI učenja (67,6 ± 1,9, 72,5 ± 0.5, i 75,2 ± 1,3, respektivno) od kontrolne grupe (58.0 ± 2.0; slika 5D , p < 0.001), sugerirajući da CT(Cistanche Tubulosa)ima blagotvoran učinak na odlaganje opadanja učenja povezanog sa starenjem. Slični rezultati su također otkrili da 5,4 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)grupa je imala efikasnije zadržavanje memorije u {{0}}h (slika 5E, 47,5 ± 1,9 u odnosu na kontrolu37.{{10}} ± 2,9, p < 0,05)="" i="" 24-="" h="" memorijski="" testovi="" (slika="" 5f,="" 31,8="" ±="" 3,8="" u="" odnosu="" na="" kontrolu="" 19,3="" ±="" 2,4,="" p="">< 0,01).="" ovi="" rezultati="" ukazuju="" da="">(Cistanche Tubulosa)suplementacija ne samo da poboljšava formiranje pamćenja kod mladih mušica, već i odgađa oštećenje kognitivnog ponašanja i održava efikasnije učenje i sposobnost pamćenja s godinama.

Molekularni putevi koji se odnose na promociju dugovječnosti i kognitivno poboljšanje suplementacije CT-om

CT(Cistanche Tubulosa)suplementacija istovremeno potiskuje AMI i produžava životni vijek. Stoga smo zaključili da se geni povezani sa AMI i dugovječnosti mogu odrediti procjenom diferencijalne ekspresije između kontrolnih i 5,4 i 10,8 mg/ml CT grupa putem qPCR. Promjene u ekspresiji gena muva tretiranih CT-om su upoređene sa onima u kontrolnoj grupi prikazane su na slici 6A. Povećana ekspresija nekoliko ciljnih gena, uključujući Sirt6, Sir2, Sod,p38b i Sirt2, mogla bi biti uključena u proces starenja. Nivoi transkripta S6k, raptora, Psn, Rpd3 i N također su porasli, što sugerira da CT(Cistanche Tubulosa)suplementacija mijenja signalnu transdukciju njihovih TOR i Notch puteva. Osim toga, dodatak CT značajno je utjecao na ekspresiju mRNA Nmdar1, Nmdar2 i SkpA. Da bi se istakle interakcije proteina relevantne za CT koje produžavaju životni vijek i poboljšavaju učenje i pamćenje, stvorena je mreža za interakciju proteina zasnovana na literaturi gena qPCR pregledanih (slika 6B). Svaki čvor predstavlja jedan protein, dok svaki rub označava jednu interakciju zasnovanu na literaturi. Čvorovi su grupirani prema KEGG putu i biološkom procesu genske ontologije (GOBP). Kao što je prikazano na slici 6B, GOBP neuroaktivna interakcija ligand-receptor, koja utiče na učenje i pamćenje, i drugo GOBPof starenje, koje je u korelaciji sa životnim vekom, oboje su povezani sa Notch signalnim putem. Osim toga, GOBP starenja je pod utjecajem mTOR signalnog puta. Značaj prekomjerne ekspresije gena izazvane CT-om na ovim GOBP-ovima i putevima opisan je u odjeljku Diskusija.

Slika 6. Mrežna analiza diferencijalno eksprimiranih gena. Muhe prethodno tretirane sa 5,4 i 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)i kontrolne dijete na 25 stepeni tokom 20 dana su prikupljene za kvantifikaciju diferencijalne ekspresije gena. (A) Relativni nivoi transkripta ciljnih gena u odnosu na kontrole su kvantifikovani putem qPCR. n=4 za svaku grupu. (B) Povećani geni uključeni u transdukciju ćelijskog signala i njihovu mrežu interakcija. Čvorovi predstavljaju gene. Geni sa prekomernom ekspresijom zaokruženi su zelenom bojom. Rubovi predstavljaju interakcije između genskih proizvoda. Tipovi interakcija su označeni različitim bojama na slici. (Za tumačenje referenci na boju u legendi ove slike, čitalac se upućuje na web verziju ovog članka.)

Diskusija

Neravnoteža između stvaranja i eliminacije slobodnih radikala od strane endogenih antioksidativnih odbrambenih sistema može uzrokovati oksidativno oštećenje tkiva s godinama; stoga se spekuliše da slobodni radikali igraju ključnu ulogu u starenju (Dato et al., 2013). Evo, pokazali smo taj CT(Cistanche Tubulosa)suplementacija muhama produžava životni vijek i rezultira visokom tolerancijom na oksidativna oštećenja uzrokovana H2O2 i parakvatom kod oba spola. Studije su u korelaciji sa CT(Cistanche Tubulosa)i antiaging, manje su istraženi, ali ekstrakti iz C. deserticola, mogu produžiti životni vijek kod miševa sklone starenju 8 (SAM-P8) miševa (Zhang et al., 2014) i ehinakozida, jednog od glavnih spojeva koji postoje u CT , ima blagotvorne učinke na produženje životnog vijeka i toleranciju na stres kod C. elegans (Wang et al., 2015).

Nedavne studije na životinjama pokazale su da ehinakozid ima zaštitne efekte protiv toksičnosti testisa izazvane bisfenolom A i pojačava biosintezu testosterona indukcijom enzima testisoidnih steroida, uključujući CYP11A1, 3 -HSD i CYP17A1 (Jiang et al., 2). CT(Cistanche Tubulosa)Ekstrakt etanola također pospješuje održivost i kvalitetu sperme kod pacova (Wang et al., 2016). Iako je korelacija između CT(Cistanche Tubulosa)a estrogen još treba istražiti, jedna studija je objavila da ehinakozid značajno povećava ekspresiju estrogenskih receptora, slično grupi koja je tretirana estradiolom kod pacova sa ovariektomijom (Li et al., 2013). Budući da se reproduktivni kapacitet javlja u negativnoj korelaciji sa godinama (Kenyon, 2005), ispitali smo da li CT ima koristi kod starijih muva. Reproduktivna sposobnost pod utjecajem CT-a(Cistanche Tubulosa)primećen je samo kod ženki, što sugeriše da bi ženke mogle bolje reagovati na CT(Cistanche Tubulosa)suplementacija. Ovi rezultati otkrivaju da CT može imati učinak sličan polnim hormonima i odgoditi reproduktivnu senescenciju, u skladu s kliničkom upotrebom CT-a.(Cistanche Tubulosa)za liječenje seksualne disfunkcije kod ljudi.

Acteoside može razjasniti zaštitne efekte za smanjenje apoptoze neurona i gubitka pamćenja kod modela starijih miševa izazvanih kombinacijom D-galaktoze i AlCl3, sugerirajući da CT može imati potencijal da ima neuroprotektivna svojstva i svojstva poboljšanja pamćenja (Gao et al., 2015.; Peng et al., 2015.). Naši podaci su pokazali da se formiranje pamćenja poboljšalo kod mladih muva s CT-om. Stoga smo procijenili da li je CT(Cistanche Tubulosa)suplementacija je korisna za zadržavanje pamćenja nakon starenja jer je poznato da kognitivne funkcije opadaju u normalnom starenju. Naši rezultati su otkrili da se nekoliko tipova AMI, uključujući učenje, 3- i 24-hmemoriju, može poboljšati CT(Cistanche Tubulosa)suplementacija 20 dana. Prema gore navedenim rezultatima, CT(Cistanche Tubulosa)suplementacija može imati blagotvorne efekte na dugovječnost i poboljšanje formiranja pamćenja, kao i dovoljno odgoditi AMI.

Korištenje životinjskih modela olakšava identifikaciju potencijalnih mehanizama i ovisnost o putu CT-a(Cistanche Tubulosa)za usporavanje starenja mozga i odlaganje AMI na ćelijskom nivou. Fokusirali smo se na molekularne mehanizme koji su u osnovi starenja, neuronske transmisije i oksidativnog stresa i zaključili da se geni povezani sa AMI i dugovječnosti mogu identificirati ispitivanjem diferencijalne ekspresije između kontrolnih i CT grupa putem qPCR-a. Notch signalni put je visoko očuvan među vrstama od Drosophila do ljudi; ekspresira se u centralnom nervnom sistemu odraslih za neuralnu plastičnost i reguliše neuralnu diferencijaciju zajedno sa svojim inhibitornim stanjem tokom razvoja (Presente et al., 2001). Miševi koji nose heterozigotnu mutaciju Notcha nemaju dovoljno prostornog učenja i pamćenja (Costa et al., 2003). Presenilin (Psn) je neophodan za aktiviranje cijepanja Notch-a u intracelularnu domenu Notch-a, a nokautiranje Psn-a uzrokuje oštećenje sinaptičke plastičnosti i formiranje memorije (Saura et al., 2004). Naši podaci su otkrili povećanje regulacije Notch i Psn u CT ovisno o dozi(Cistanche Tubulosa)suplementirane mušice, sa nepromijenjenim nivoom ekspresije numb, što implicira signalni put Notch kao moćan mehanizam poboljšanja pamćenja suplementacijom CT. Pored Notch signalizacije, N-metil-D-aspartat receptor (NMDAR), ionski kanal vođen glutamatom i D-serinom u neuronima, kontroliše sinaptičku plastičnost i memorijsku funkciju (Furukawa et al., 2005). Genom Drosophila sadrži dva NMDAR podjedinice, Nmdar1 i Nmdar2, i obje su ključne u funkciji pamćenja. Nokdaun Nmdar1 kod Drosophila narušava učenje i pamćenje (Xia et al., 2005.), dok prekomjerna ekspresija Nmdar2 kod miševa poboljšava učenje i pamćenje (Tang et al., 2001.). Naši podaci su pokazali povećanje regulacije Nmdar1 i Nmdar2 u zavisnosti od doze kod muha s CT-om, što sugerira još jedan potencijalni mehanizam poboljšanja pamćenja pomoću CT-a.(Cistanche Tubulosa)suplementacija.

Klasa O putanje transkripcionog faktora (FoxO) je očuvana među vrstama i kritična je za metabolizam, toleranciju na stres i produženje životnog vijeka (Lehtinen et al., 2006). Posttranslacijske modifikacije, uključujući fosforilaciju, acetilaciju i ubikvitilaciju, regulišu aktivnost FoxOs (van der Horst i Burgering, 2007). Regulator tihih informacija 2 (Sir2; homolog kod sisara je poznat kao SIRT1) reguliše aktivnost FoxO kroz deacetilaciju i utiče na životni vijek životinja vezan za put faktora rasta (IGF) sličnog inzulinu (Lemieux et al., 2005). Sirt6 defosforilira FoxO kako bi produžio životni vijek kod mužjaka miševa (Kanfi et al., 2012). Naši podaci su otkrili povećanje regulacije Sir2 i Sirt6 kod muva koje su dodale CT, što implicira da regulacija FoxO preko majica može biti moćan mehanizam za produženje životnog vijeka CT-om(Cistanche Tubulosa)suplementacija. Slobodni radikali koji nastaju tijekom metaboličkih procesa uzrokuju oštećenje DNK i proteina, što dovodi do skraćenog životnog vijeka. Sir2 je također gen za odgovor na oksidativni stres (Whitaker et al., 2013.), a zabilježeno je da prekomjerno eksprimirana superoksid dismutaza (SOD), koja pretvara O2− u H2O2 i konačno u H2O pomoću katalaze i glutation peroksidaze, produžava životni vijek muva ( Le Bourg, 2001). Naši podaci su otkrili dozu ovisnu regulaciju Sod i Sir2 kod muva koje su dodale CT, što sugerira da antioksidativni putevi mogu biti moćan mehanizam produženja životnog vijeka CT-om(Cistanche Tubulosa)suplementacija.

Još jedan ključni put u starenju reguliraju mTOR kompleksi mTORC1 i mTORC2, od kojih oba promoviraju stvaranje organizma na evolucijski konzervativan način. Signali s inzulinskog receptora aktiviraju mTORC1 putem fosfoinozitid3-kinaze-Akt puta kako bi promovirali sintezu proteina i upalu i inhibirali autofagiju i glikolizu korištenjem različitih proteina nizvodno (Johnson et al., 2013). Sintezu proteina aktivira ribosomalna protein S6 kinaza (S6K), koja formira negativnu povratnu petlju da inhibira signalizaciju inzulinskih receptora (Hands et al., 2009). Inhibiciona meta mTORC1 je sličan protein Drosophila (sima), čiji je homolog kod sisara poznat kao faktor 1 alfa koji izaziva hipoksiju (HIF1). HIF1 igra zaštitnu ulogu protiv oštećenja krvnih sudova i motornih neurona zavisnih od starosti (Oosthuyse et al., 2001; Rivard et al., 2000). Naši podaci su otkrili nepromenjen nivo ekspresije kompleksnih podjedinica mTOR, uključujući Tor, rictor i raptor, dok CT(Cistanche Tubulosa)suplementacija ovisno o dozi povećava S6K i sima, što implicira zaštitnu ulogu CT(Cistanche Tubulosa)protiv mTOR aktivnosti.

Zaključci

Uprkos identifikovanju nekih impliciranih puteva, dugovečnosti i visokoj inteligenciji doprinosi CT(Cistanche Tubulosa)intervencija može biti apoligenska osobina na koju utiče međuigra više gena, a drugi genetski faktori koje nismo razjasnili mogu također modulirati proces starenja. Za starije osobe, održavanje poželjne fizičke kondicije i kognitivnih sposobnosti kako bi se odgodila ili spriječila demencija i kronične bolesti trebalo bi biti ključno stečeno u studijama o starenju. Jer CT(Cistanche Tubulosa), poznat kao "pustinjski ginseng", ima izrazito ljekovito djelovanje na jačanje janga bubrega, koji hrani sve organe i obnavlja vitalnu suštinu tradicionalne kineske medicine, vjerujemo da naša studija pruža dokaze koji podržavaju kliničko liječenje CT-a(Cistanche Tubulosa)i mogao bi pružiti vrijedan uvid za razvoj novih lijekova ili dodataka hrani koji ne samo da odlažu starenje i bolesti povezane sa starenjem, već i da poboljšaju kvalitetu ljudskog života.

Sukob interesa

Autori izjavljuju da nemaju sukoba interesa.

Priznanja

Ovaj rad je podržao Kineski medicinski univerzitet (CMU103-S-25); Kineska medicinska univerzitetska bolnica (DMR-101-065,DMR-103-099); Ministarstvo nauke i tehnologije na Tajvanu (NSC 102-2632-B-039-001-MY3, MOST 104-2632-B-039-002), a dijelom i od strane Tajvanskog Ministarstva zdravlja i socijalne zaštite Kliničko ispitivanje i istraživački centar izvrsnosti (MOHW105-TDU-B-212-133019).

Dopunski materijali

Dodatni materijal povezan s ovim člankom može se naći, u online verziji, na doi:10.1016/j.phymed.2017.01.006.

Od: 'Molekularni putevi povezani sa promocijom dugovječnosti i kognitivnim poboljšanjemCistanche tubulosau Drosophila' byWei-Yong Lin et al

--W.-Y. Lin et al. / Fitomedicina 26 (2017) 37–44

Reference

Burke, SN, Barnes, CA, 2010. Senescentne sinapse i dinamika kola hipokampusa. Trends Neurosci. 33, 153–161.

Costa, RM, Honjo, T., Silva, AJ, 2003. Deficiti učenja i pamćenja kod Notch mutantnih miševa. Curr. Biol. 13, 1348–1354.

Dato, S., Crocco, P., D'Aquila, P., de Rango, F., Bellizzi, D., Rose, G., Passarino, G., 2013. Istraživanje uloge genetske varijabilnosti i načina života u oksidativnom odgovor na stres za zdravo starenje i dugovječnost. Int. J. Mol. Sci. 14, 16443–16472.

Dubnau, J., Grady, L., Kitamoto, T., Tully, T., 2001. Poremećaj neurotransmisije u tijelu gljive Drosophila blokira pronalaženje, ali ne i stjecanje pamćenja. Nature 411, 476–480.

Franceschini, A., Szklarczyk, D., Frankild, S., Kuhn, M., Simonović, M., Roth, A., Lin, J., Minguez, P., Bork, P., von Mering, C. , Jensen, LJ, 2013. STRING v9.1: mreže interakcije protein-protein, sa povećanom pokrivenošću i integracijom. Nukleinske kiseline Res. 41, D808–D815.

Furukawa, H., Singh, SK, Mancusso, R., Gouaux, E., 2005. Raspored i funkcija podjedinica u NMDA receptorima. Nature 438, 185–192.
Gao, L., Peng, XM, Huo, SX, Liu, XM, Yan, M., 2015. Poboljšanje memorije akteozida (verbaskozida) u modelu starijih miševa izazvano kombinacijom D-gal i AlCl3. Phytother. Res. 29, 1131–1136.
Guo, Q., Zhou, Y., Wang, CJ, Huang, YM, Lee, YT, Su, MH, Lu, J., 2013. Otvorena, ne-placebo kontrolirana studija oCistanche tubulosaglikozidne kapsule (Memoregain((R))) za liječenje umjerene Alchajmerove bolesti. Am. J. Alchajmerova bolest. Other Demen. 28, 363–370.
Hands, SL, Proud, CG, Wyttenbach, A., 2009. Uloga mTOR-a u starenju: sinteza proteina ili autofagija? Starenje (Albany NY) 1, 586–597.
Jiang, Z., Wang, J., Li, X., Zhang, X., 2016. Echinacoside iCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight poboljšava oštećenje testisa i spermatozoida izazvano bisfenolom A kod pacova putem steroidogenih enzima reguliranih osovinom gonada. J. Ethnopharmacol 193, 321–328.
Jiao, X., Sherman, BT, Huang da, W., Stephens, R., Baseler, MW, Lane, HC, Lempicki, RA, 2012. DAVID-WS: web usluga sa stanjem za olakšavanje analize liste gena/proteina. Bioinformatika 28, 1805–1806.
Johnson, SC, Rabinovitch, PS, Kaeberlein, M., 2013. mTOR je ključni modulator starenja i bolesti povezanih sa starenjem. Nature 493, 338–345.
Kanfi, Y., Naiman, S., Amir, G., Peshti, V., Zinman, G., Nahum, L., Bar-Joseph, Z., Cohen, HY, 2012. Sirtuin SIRT6 regulira životni vijek muškaraca miševi. Nature 483, 218–221.
Kenyon, C., 2005. Plastičnost starenja: uvidi dugovječnih mutanata. Ćelija 120, 449–460.
Le Bourg, E., 2001. Oksidativni stres, starenje i dugovječnost kod Drosophila melanogaster. FEBS Lett. 498, 183–186.
Lehtinen, MK, Yuan, Z., Boag, PR, Yang, Y., Villen, J., Becker, EB, DiBacco, S., de la Iglesia, N., Gygi, S., Blackwell, TK, Bonni, A., 2006. Očuvani MST-FOXO signalni put posreduje u odgovorima na oksidativni stres i produžava životni vijek. Ćelija 125, 987–1001.
Lemieux, ME, Yang, X., Jardine, K., He, X., Jacobsen, KX, Staines, WA, Harper, ME, McBurney, MW, 2005. Sirt1 deacetilaza modulira signalni put faktora rasta sličan insulinu u sisari. Mech. Aging Dev. 126, 1097–1105.
Li, F., Yang, X., Yang, Y., Guo, C., Zhang, C., Yang, Z., Li, P., 2013. Antiosteoporotska aktivnost ehinakozida kod štakora sa ovariektomijom. Phytomedicine 20, 549–557.
Li, Z., Lin, H., Gu, L., Gao, J., Tzeng, CM, 2016. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): jedan od najboljih farmaceutskih darova tradicionalne kineske medicine. Front Pharmacol. 7, 41.
Lin, S., Ye, S., Huang, J., Tian, ​​Y., Xu, Y., Wu, M., Wang, J., Wu, S., Cai, J., 2013. Kako se kineski lijekovi koji toniziraju bubrege inhibiraju apoptozu dopaminergičkih neurona? Neural Regen. Res. 8, 2820–2826.

Oosthuyse, B., Moons, L., Storkebaum, E., Beck, H., Nuyens, D., Brusselmans, K., Van Dorpe, J., Hellings, P., Gorselink, M., Heymans, S. , Theilmeier, G., Dewerchin, M., Laudenbach, V., Vermylen, P., Raat, H., Acker, T., Vleminckx, V., Van Den Bosch, L., Cashman, N., Fujisawa, H., Drost, MR, Sciot, R., Bruyninckx, F., Hicklin, DJ, Ince, C., Gressens, P., Lupu, F., Plate, KH, Robberecht, W., Herbert, JM, Collen , D., Carmeliet, P., 2001. Brisanje elementa odgovora na hipoksiju u promotoru faktora rasta vaskularnog endotela uzrokuje degeneraciju motornih neurona. Nat. Genet. 28, 131–138.

Peng, XM, Gao, L., Huo, SX, Liu, XM, Yan, M., 2015. Mehanizam poboljšanja memorije Acteoside (Verbascoside) u Starećem modelu miša induciran kombinacijom D-gal i AlCl3. Phytother, Res. 29, 1137–1144.
Presente, A., Andres, A., Nye, JS, 2001. Potreba za Notchom u odrasloj dobi za neurološke funkcije i dugovječnost. Neuroreport 12, 3321–3325.
Rivard, A., Berthou-Soulie, L., Principe, N., Kearney, M., Curry, C., Branellec, D., Semenza, GL, Isner, JM, 2000. Defekt ovisan o starosti u rastu vaskularnog endotela ekspresija faktora je povezana sa smanjenom aktivnošću faktora 1 izazvanog hipoksijom. J. Biol. Chem. 275, 29643–29647.
Saura, CA, Choi, SY, Beglopoulos, V., Malkani, S., Zhang, D., Rao, Shankaranarayana, Chattarji, BS, Kelleher, S., 3., RJ, Kandel, ER, Duff, K., Kirkwood , A., Shen, J., 2004. Gubitak funkcije presenilina uzrokuje oštećenje pamćenja i sinaptičke plastičnosti praćeno neurodegeneracijom ovisnom o dobi. Neuron 42, 23–36.
Schimanski, LA, Barnes, CA, 2010. Neuralna sinteza proteina tokom starenja: efekti na plastičnost i pamćenje. Front Aging Neurosci. 2. Seok, J., Kim, TS, Kwon, HJ, Lee, SP, Kang, MH, Kim, BJ, Kim, MN, 2015. EfikasnostCistanche Tubulosai ekstrakti Laminaria Japonica (MK-R7) kao dodatak prevenciji opadanja kose i promicanju zdravlja vlasišta. Clin. Nutr. Res. 4, 124–131.
Tang, YP, Wang, H., Feng, R., Kyin, M., Tsien, JZ, 2001. Diferencijalni efekti obogaćivanja na učenje i funkciju pamćenja kod NR2B transgenih miševa. Neuropharmacology 41, 779–790.
van der Horst, A, Burgering, BM, 2007. Naglašavanje uloge FoxO proteina u životnom vijeku i bolesti. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 440–450.
Wang, T., Chen, C., Yang, M., Deng, B., Kirby, GM, Zhang, X., 2016.Cistanche tubulosaEkstrakt etanola posreduje nivoe polnih hormona pacova indukcijom steroidnih enzima testisa. Pharm. Biol. 54, 481–487.
Wang, T., Zhang, X., Xie, W., 2012.Cistanche deserticolaYC Ma, "Desert ginseng": recenzija. Am. J. Chin. Med. 40, 1123–1141.
Wang, X., Zhang, J., Lu, L., Zhou, L., 2015. Efekat dugovječnosti ehinakozida kod Caenorhabditis elegans posredovan putem daf-16. Biosci. Biotechnol. Biochem. 79, 1676–1683.
Whitaker, R., Faulkner, S., Miyokawa, R., Burhenn, L., Henriksen, M., Wood, JG, Helfand, SL, 2013. Povećana ekspresija Drosophila Sir2 produžava životni vijek na način koji ovisi o dozi. Starenje (Albany NY) 5, 682–691.
Wu, CR, Lin, HC, Su, MH, 2014. Preokret vodenim ekstraktimaCistanche tubulosaod deficita u ponašanju u modelu štakora nalik Alchajmerovoj bolesti: značaj za taloženje amiloida i funkciju centralnog neurotransmitera. BMC Complement. Altern. Med. 14, 202.
Xia, S., Miyashita, T., Fu, TF, Lin, WY, Wu, CL, Pyzocha, L., Lin, IR, Saitoe, M., Tully, T., Chiang, AS, 2005. NMDA receptori posreduju olfaktorno učenje i pamćenje kod Drosophile. Curr. Biol. 15, 603–615.
Zhang, K., Ma, X., He, W., Li, H., Han, S., Jiang, Y., Wu, H., Han, L., Ohno, T., Uotsu, N., Yamaguchi, K., Ma, Z., Tu, P., 2014. Ekstrakti Cistanche deserticola mogu antagonizirati imunosenescenciju i produžiti životni vijek kod miševa sa ubrzanim starenjem
Prone 8 (SAM-P8) miševi. Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2014, 601383.
Zhao, Q., Gao, J., Li, W., Cai, D., 2010. Neurotrofni i neurorescue efekti ehinakozida u subakutnom MPTP mišjem modelu Parkinsonove bolesti. Brain Res. 1346, 224–236.