Mitohondrijski proteini otkrivaju mehanizam pomoću kojeg fizičke vježbe poboljšavaju pamćenje, učenje i motoričku aktivnost kod hipoksične ishemijske encefalopatije Model pacova 3. dio

4. Materijali i metode

4.1. Životinje i eksperimentalne grupe

Za ovu studiju korišteno je 36 Sprague-Dawley pacova. Životinje su održavane na 22 ± 1◦C sa ciklusima svjetlo/mrak od 12 h i imale su slobodan pristup hrani i vodi. Eksperimentalne procedure su sprovedene uz odobrenje Etičkog institucionalnog komiteta za brigu o životinjama i istraživanje Univerziteta Zhengzhou.

Tamni ciklus se odnosi na period kada ljudi spavaju noću i usko je povezan sa pamćenjem. Za većinu ljudi dobar san poboljšava fizičko zdravlje i funkciju mozga. U isto vrijeme, san je također povezan s procesom pamćenja mozga.

Kada spavamo, naša tijela ulaze u različite faze spavanja, uključujući spavanje s brzim pokretima očiju (REM) i spavanje bez brzih pokreta očiju (NREM). Ove faze igraju važnu ulogu u regulaciji integracije informacija u mozgu i konsolidacije memorije.

Većina ljudi doživljava pozitivne učinke sna na koncentraciju i pamćenje. Istraživanja pokazuju da nam san može pomoći da konsolidiramo i ojačamo naša sjećanja, pa čak i poboljšamo našu sposobnost učenja. Tokom spavanja, mozak integriše nove informacije sa postojećim znanjem, čime se povećava sposobnost skladištenja i korišćenja memorije.

S druge strane, nedostatak adekvatnog sna može dovesti do gubitka pamćenja i poteškoća u učenju. Dugotrajna nesanica može uzrokovati razne probleme u tijelu i mozgu, utječući na svakodnevni život i rad. Stoga su ispravna strategija spavanja i razuman način života ključni za održavanje dobrog pamćenja.

Sve u svemu, postoji veza između mračnih ciklusa i memorije. Adekvatan san može promovirati integraciju informacija o mozgu i konsolidaciju pamćenja, dok dugotrajni poremećaji spavanja mogu utjecati na funkciju mozga i pamćenje. Stoga u svakodnevnom životu trebamo obratiti pažnju na kvalitet sna i održavati zdrav način života, kako bismo efikasno podržali i poboljšali svoje pamćenje i sposobnost učenja. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje, jer i Cistanche deserticola može regulisati ravnotežu neurotransmitera, kao što je povećanje nivoa acetilholina i faktora rasta. Ove supstance su veoma važne za pamćenje i učenje. Osim toga, Cistanche deserticola također može poboljšati protok krvi i promovirati isporuku kisika, što može osigurati da mozak dobije dovoljno hranjivih tvari i energije, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite na saznajte 10 načina za poboljšanje memorije

Uloženi su svi napori da se smanji broj životinja i minimizira patnja životinja tokom eksperimenata. Životinje su nasumično podijeljene u četiri grupe (slika 8). (1) HIE, NT (grupa hipoksično-ishemijske encefalopatije bez vježbanja) sastojala se od životinja koje su modelirane za hipoksično-ishemičnu encefalopatiju 7. dana nakon porođaja anesteziranjem mladunaca izofluranom (5% indukcije, 1,5% održavanja).

Lijeva zajednička karotidna arterija je zatim trajno podvezana, a mladunci su stavljeni na topli kauč za oporavak na 30 minuta prije nego što su prebačeni u hipoksičnu komoru uz kontinuiran protok hipoksične mješavine plina od 92% N2 i 8% O2 u trajanju od 90 minuta, a zatim vraćeni u kaveze do 10. sedmice bez izlaganja plivanju. (2) HIE, T (grupa hipoksično-ishemijske encefalopatije sa vježbanjem) se sastojala od životinja koje su modelirane za hipoksično-ishemijsku encefalopatiju kao u (1) i vraćene u kaveze do 6. sedmice života, a zatim podvrgnute 90 min. vježba plivanja dnevno pet dana sa 2 dana odmora sedmično tokom 4 sedmice, (3) SHAM, NT (kontrolna grupa) uključivale su životinje koje nisu bile podvrgnute nikakvom tretmanu, ali su živjele normalnim životom u kavezima od 1. postnatalnog dana do 10. sedmice bez trening vježbanja, i (4) SHAM, T se sastojao od životinja koje nisu bile podvrgnute nikakvom tretmanu, ali su živjele normalnim životom u kavezima od 1. postnatalnog dana do 6 sedmica, nakon čega su bile podvrgnute plivanju 4 sedmice.

Životinjski mozgovi iz različitih grupa su zatim sakupljeni i pripremljeni za western blot (hipokampus i cerebralni korteks) i imunofluorescenciju (motorni korteks).

4.2. Paradigma vježbe

Životinje su bile smještene s hranom i vodom ad libitum i održavane u ciklusu 12-svjetlo/mrak. Podijeljene su u dvije grupe: sedeće životinje (HIE, NT i SHAM, NT) i životinje koje vježbaju (HIE, T i SHAM, T). Životinje koje su vježbale bile su podvrgnute vježbanju plivanja nakon 6. postnatalne sedmice tokom 4 sedmice; podvrgnuti su plivanju 5 dana u sedmici sa 2 dana odmora. Svako plivanje je trajalo 90 min. Bazen je napunjen do dubine od 50 cm kako bi se spriječilo da životinje dodiruju dno rezervoara.

Životinjama je bilo dozvoljeno da slobodno plivaju, bez dodatnog opterećenja, i lagano su stimulisani tokom plivanja. Pacovi su nakon vježbe pažljivo osušeni i vraćeni u kaveze.

4.3. Vertica! Pole Motor Test

Životinje u svakoj grupi su jedna po jedna stavljene licem prema gore na motku obloženu platnenom trakom (3.0 cm prečnika i 150 cm dužine), koja je držana u horizontalnom položaju, a zatim je postepeno podizana na vertikalnom položaju, a vrijeme boravka štakora na stubu zabilježeno je maksimalno 2 min (120 s). U ovom testu životinja sa nedostatkom motoričke koordinacije i ravnoteže pada sa motke.

4.4. Morrisov test vodenog lavirinta (MWM)

Pacovi (stari 10 sedmica) su podvrgnuti MWM nakon 4 sedmice protokola vježbanja (SHAM, 'T i HlE, T). Svi podaci o vodenom lavirintu snimljeni su pomoću Panjab SMART video sistema za praćenje (Panlab Howo Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.) (Šangaj, Kina). MWM je korišten kako je opisano u 132]. Ukratko, pacovi su koristili vizualne znakove postavljene na ivice bazena kako bi došli do skrivene platforme i pobjegli iz vode. Učenje je procjenjivano tokom 7 dana. Prije provjere učenja, pacovi su uvedeni u bazen koji je sadržavao čistu vodu i vidljivu platformu. Tokom treninga, pacovi su dobili probne vježbe plivanja kako bi se upoznali sa zadatkom.

Tokom faze učenja, pacovi su premazani crnom bojom radi lakšeg praćenja videa i platforma je potopljena. Svaki pacov je podvrgnut četiri pokusa sa različitih polaznih tačaka (kvadranata). Latencija ili vrijeme potrebno za dolazak do platforme svakodnevno je sniman Panlab SMART Video Tracking System. Posljednjeg dana eksperimenta, platforma je uklonjena, a svaki štakor je ponovo uveden u vodu zabilježen je broj puta kada su životinje prešle mjesto skrivene platforme u kvadrantu koji je prethodno sadržavao platformu (ciljni kvadrant).

4.5. Western blotting

Šest štakora je nasumično odabrano iz svake grupe za eksperiment na nivou proteina. Proteini su ekstrahovani iz hipokampusa i korteksa i homogenizovani u RIPA reagensu (CW2333S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, USA) i razdvojeni u citoplazmu i nuklearne proteine. Koncentracije proteina su određene pomoću bicinhoninske kiseline (BCA) (CW0014S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, USA), a ukupno 20 g proteina je odvojeno elektroforezom na univerzalnim SDS-PAGE gelovima (CFAS AnyKD PAGE) # PE008, Zhonghui Hecai Bio-pharmaceutical Technology Co., Ltd., Shaanxi, Kina.

Proteini su zatim prebačeni na membrane od poliviniliden fluorida (PVDF) (R1CB12934, Merck Millipore Ltd., Burlington, MA, SAD). Membrane su blokirane 2 h sa 5% goveđeg serumskog albumina (BSA) (#A8020, Solarbio Life Sciences , Peking, Kina) na sobnoj temperaturi i inkubirano sa sljedećim primarnim antitijelima iz Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SAD): AIF (D39D2, 1:1000), citokrom C (136F3, 1:1000), odcijepljena kaspaza{{ 13}} (Asp175, 1:1000), Smac/Diablo (D553R, 1:1000) i OPA1 (D7C1A, 1:1000).

GAPDH iz Servicebio, Wuhan, Kina (GB11002, 1:2000) i H3 iz Proteintech-a (17168-1-AP, 1:1000) na 4 ◦C preko noći nakon čega slijedi HRP-konjugirano sekundarno antitijelo SA00001-2 iz Proteintect-a (1:5000) inkubacija tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Proteinske trake su vizualizovane sa poboljšanim hemiluminiscencijskim kompletom #KF005 od Affinity Biosciences i snimljene pomoću sistema za analizu bio-slike (Univerzitet Džengdžou, Džengdžou, Kina). Omjeri intenziteta proteinskih traka prema GAPDH (citoplazmatski proteini) i H3 (nuklearni proteini) kao interne reference su određeni korištenjem ImageJ.

4.6. Imunofluorescencija

Koronalne kriške moždanog tkiva {{0}}}µm dobijene su upotrebom mikrotoma za zamrzavanje (Leica, Njemačka) za imunofluorescenciju. Stakalca su blokirana 2 h sa PBS sa 10% fetalnog goveđeg seruma, (#A8020, Solarbio Life Sciences, Peking, Kina) i 0,3% Triton ×-100, Amresco 0694, Biosharp, Estonija na sobnoj temperaturi, a zatim inkubirano s primarnim antitijelima iz Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SAD): anti-AIF, D39D2 (razrjeđenje 1:400), anti-citokrom C, 136F3 (razrjeđenje 1:200), kaspaza protiv cijepanja-3 , Asp175 (razrjeđenje 1:400), anti-Smac/Diablo, D553R (razrjeđenje 1:200) i anti-OPA1, D7C1A (razrjeđenje 1:400) preko noći na 4 ◦C.

Zatim su predmeti isprani 3 puta u trajanju od 10 minuta u PBS-u, a zatim inkubirani sa sekundarnim antitelima (ab150077 iz Abcam, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, UK) 2 h na sobnoj temperaturi u mraku. DAPI, #C0065 iz Solarbio Life Sciences, Peking, Kina (1:100PBS) je dodan 5 minuta i izliven, ispran u PBS-u 3 puta u trajanju od 5 minuta, osušen, dodat je agens protiv gašenja (#P0126, Beyotime Biotechnology, Šangaj, Kina), staklo listići su fiksirani na stakalcima, a uzorci su čuvani na -20 ◦C 2 h i uzeti za mikroskopsko snimanje. Slike tkiva su snimljene konfokalnim fluorescentnim mikroskopom (Ni-U942877, Nikon, Tokio, Japan), a slike koje predstavljaju proteini u motornom korteksu su zatim kvantifikovani korišćenjem FIJI-ImageJ kao što je opisano u [33].

4.7. Statistička analiza

Za sve analize korištena je verzija GraphPad Prism 8.0.0 za Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Jednosmjerna ANOVA praćena Dunnettovim post hoc testovima, respektivno, korištena je za mjerenje statističke značajnosti. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM, a p < 0.05 se smatra statistički značajnim.

5. Zaključci

Ova studija pokazuje da je vježbanje plivanja poboljšalo motoričku aktivnost, pamćenje i učenje povezano s HIE supresijom mitohondrijalne apoptoze putem Cyto.C/cijepljene kaspaze-3 i AIF signalnih puteva. Dodatno, pokazalo se da intervencija vježbanja plivanja stabilizira mitohondrijalne kriste i membranski potencijal kao što je prikazano preokretom Smac/Diablo i OPA1 kod pacova sa HIE. Kao rezultat toga, ovo je atraktivna i održiva osnova za dodatna istraživanja kako bi se dešifrirali više molekularnih puteva kojima bi se moglo manipulirati kako bi se efikasno upravljalo HIE i rezultirajućim deficitima. Dok je ova studija uspješno pokazala ulogu vježbe u preokretu strukturnih i funkcionalnih deficita u mitohondrijama uzrokovanim od strane HIE-a, nije iscrpio sve moguće metode za utvrđivanje kako su mitohondrijske kriste stabilizirane; ovo je kritično za buduća istraživanja na ovu temu.

Doprinosi autora: Konceptualizacija, FG, FP, YW i CC; kuriranje podataka, FG, FP, YW,HL i JF; formalna analiza, FG, HL i CC; pribavljanje sredstava, CC; istraga, FG,FP, YW, HL i JF; metodologija, FG, FP, YW i CC; administracija projekta, FG, YW i CC; resursi, CC; softver, FG, FP, JF i CC; nadzor, CC; validacija, FG, FP,YW, HL i CC; vizualizacija, FG, FP, YW, HL i JF; pisanje – originalni nacrt, FG i YW; pisanje – recenzija i uređivanje FG i HL Svi autori su pročitali i složili se sa objavljenom verzijom rukopisa.

Finansiranje: Ova studija je podržana od strane Projekta naučnog i tehnološkog istraživanja Odeljenja za nauku i tehnologiju provincije Henan (grant br. 212102310217) i grant iz fondova Nacionalne fondacije za prirodne nauke Kine (grant br. 81401015).

Izjava institucionalnog odbora za reviziju: Studija je provedena u skladu sa smjernicama Komiteta za brigu o istraživačkim životinjama Univerziteta Zhengzhou; ZZUIRB2022-32.

Izjava o informiranom pristanku: Nije primjenjivo.

Izjava o dostupnosti podataka: Nije primjenjivo.

Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Reference

1. Li, B.; Concepcion, K.; Meng, X.; Zhang, L. Mozgano-imune interakcije u perinatalnim hipoksično-ishemijskim ozljedama mozga. Prog. Neurobiol.2017, 159, 50–68. [CrossRef]

2. Douglas-Escobar, M.; Weiss, MD Hipoksično-ishemijska encefalopatija: Pregled za kliničara. JAMA Pediatr. 2015, 169, 397–403.[CrossRef] [PubMed]

3. Black, RE; Cousens, S.; Johnson, HL; Lawn, J.; Rudan, I.; Bassani, D.; Jha, P.; Campbell, H.; Walker, CF; Cibulskis, R.; et al. Globalni, regionalni i nacionalni uzroci smrtnosti djece u 2008.: Sistematska analiza. Lancet 2010, 375, 1969–1987. [CrossRef]

4. Juul, SE; Ferriero, DM Pharmacologic Neuroprotektive Strategies in Neonatal Brain Injury. Clin. Perinatol. 2014, 41, 119–131.[CrossRef]

5. Zhu, C.; Rodriguez, JI; Li, T.; Xu, Y.; Sun, Y. Uloga faktora koji izaziva apoptozu u perinatalnoj hipoksično-ishemijskoj ozljedi mozga. NeuralRegen. Res. 2021, 16, 205–213. [CrossRef] [PubMed]

6. Song, S.-H.; Jee, Y.-S.; Ko, I.-G.; Lee, S.-W.; Sim, Y.-J.; Kim, D.-Y.; Lee, S.-J.; Cho, YS Vježbe na traci za trčanje i vježbe s kotačima poboljšavaju motoričku funkciju suzbijanjem apoptotičke smrti neuronskih stanica kod pacova s ​​upalom mozga. J. Exerc. Rehabil. 2018, 14, 911–919.[CrossRef]

7. Kelly, M.; Darrah, J. Vodene vježbe za djecu sa cerebralnom paralizom. Dev. Med. Dijete. Neurol. 2005, 47, 838–842. [CrossRef]

8. Müller, P.; Duderstadt, Y.; Lessmann, V.; Müller, NG Laktat i BDNF: Ključni posrednici neuroplastičnosti izazvane vježbanjem?J. Clin. Med. 2020, 9, 1136. [CrossRef]

9. Intlekofer, KA; Cotman, CW Vježbe suzbijaju opadanje hipokampalne funkcije kod starenja i Alchajmerove bolesti. Neurobiol.Dis. 2013; U štampi. [CrossRef]

10. Real, C.; Ferreira, A.; Chaves-Kirsten, G.; Torrão, A.; Pires, R.; Britto, L. BDNF blokada receptora ometa povoljne efekte vježbanja na modelu Parkinsonove bolesti kod pacova. Neuroscience 2013, 237, 118–129. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com