Stabilizacija mitohondrijalne membrane od polisaharida Angelica Sinensis u mišjoj aplastičnoj anemiji
Mar 16, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Abstract
Kako bi se istražio mehanizam stabilizacije mitohondrijalne membrane polisaharidom Angelica Sinensis (ASP) kod mišje aplastične anemije (AA) ICR miševi su nasumično podijeljeni u kontrolu. Grupe tretirane AA i ASP Miševi iz AA grupe su tretirani sa 60Co Y i intraperitonealnim injekcijama ciklofosfamida i hloramfenikola. Kontrolne životinje su tretirane olovnim zaštitnim zračenjem i injekcijom slane otopine. Tretirani AA miševi su hranjeni sa ASP 2 tjedna. Mitohondrijalna ultrastruktura koštane srži uočena je transmisijskom elektronskom mikroskopijom, a transmembranski potencijal ćelija sa jezgrom koštane srži (BMNC) ispitan je fluorescentnom spektrofotometrijom. Sadržaj Cox i MDH podloge je također proučavan u tri grupe. Mitohondrijski broj i transmembranski potencijal BMNC u koštanoj srži smanjen je u AA grupi u odnosu na kontrolnu grupu, ali se poboljšao u grupi tretiranoj ASP u odnosu na AA grupa. Potpuno cijepanje mitohondrija u grupi liječenoj ASP značajno je odgođeno (P< 0.05)="" as="" compared="" to="" the="" aa="" group.="" we="" conclude="" that="" asp="" might="" improve="" mitochondrial="" membrane="" stabilization,="" and="" suppress="" the="" downregulation="" of="" transmembrane="" potential="" and="" apoptosis="" of="" bmnc="" in="">
Ključne riječi: aplastična anemija, polisaharid Angelica Sinensis, mitohondrije, membranski potencijal, ICR miševi
ekstrakt cistanche: podstiče formiranje kostiju i povećava gustinu kostiju
Pozadina
Aplastična anemija (AA) je poremećaj krvi u kojem su koštana srž i povezane krvne matične stanice oštećene što uzrokuje nedostatak crvenih krvnih stanica, bijelih krvnih stanica i trombocita. Ovi nedostaci su pojedinačno poznati kao anemija, leukopenija i trombocitopenija, odnosno, i zajednički poznati kao pancitopenija. Izloženost hemikalijama, lekovima, zračenju, radioaktivnim materijalima, uređajima koji proizvode zračenje, infekcijama. imunološka bolest, naslijeđe (u 50 posto slučajeva) i nepoznata etiologija također mogu dovesti do razvoja AA.
Smatra se da su mitohondrije "elektrane ćelije" jer proizvode adenozin trifosfat (ATP) sistematskim izdvajanjem energije iz nutrijenata (supstrata)[1]. Štaviše, mtDNK se replicira sa velikom stopom mutacija jer joj nedostaju zaštitni histoni i efikasan sistem za popravku DNK. Mutacije u mtDNK su povezane sa hematološkim oboljenjima kao što su stečena sideroblastna anemija, mijelodisplastični sindromi i stečeni AA [2-4]. Naša prethodna studija 5] pokazala je da funkcionalno oštećenje mitohondrijalnog respiratornog lanca izazvano mutacijama može biti uključeno u hematopoetski zatajenje kod pacijenata sa AA. Bez obzira na morfološke karakteristike završne stanične smrti (apoptotične, nekrotične, autofagične ili mitotičke), permeabilizacija mitohondrijske membrane (MMP) često je odlučujući događaj između preživljavanja i smrti [6]
Prema tradicionalnoj kineskoj medicini, Angelica Sinensis pomaže u ujedinjavanju krvi i promicanju njene cirkulacije [7]. Nedavna istraživanja su pokazala da ekstrakti Angelica Sinensis imaju antioksidativno i neuroprotektivno djelovanje [8,9]. Međutim, antioksidativna funkcija ASP ostaje nejasna. Ova studija je ispitivala rano oštećenje ćelija koristeći vremensku krivu lize mitohondrija i efekat stabilizacije mitohondrijalne membrane ASP u AA.
Cistanche dodatak povećava gustinu kostiju i podstiče formiranje kostiju
Materijali i metode
Grupisanje životinja
Zdrave ICR mužjake miševa, težine 18-22 g, starosti 6-8 sedmica, obezbijedio je Centar za eksperimentalne životinje Univerziteta Shandong (Kina). Životinje su bile smještene u toplom, tihom okruženju sa slobodnim pristupom hrani i vodi. i aklimatiziran jednu sedmicu prije početka eksperimenata.
Miševi su nasumično podijeljeni u tri grupe: normalnu grupu, AA grupu i tretiranu grupu. Model aplastične anemije generiran je kako je prethodno opisano [10].
Ukratko, miševi su zračeni sa 2.0Gy 60Coy, a zatim tretirani dnevnim intraperitonealnim injekcijama od 40 mg/kg/dan ciklofosfamida i 50 mg/kg/dan hloramfenikola u naredna tri dana. Tretirana grupa je intragastrično hranjena sa ASP (200 mg/kg/d, prema Kineskom medicinskom rječniku). Kontrolna grupa i miševi grupe AA su intragastrično hranjeni ishranom sa fiziološkim rastvorom (10 ml/kg/d). Nadalje, svi miševi su tokom studije dobili standardnu ishranu. Nakon tretmana sa ASP ili fiziološkom otopinom u trajanju od 2 tjedna, miševi su žrtvovani dislokacijom grlića materice.
Hematološki pregled
Uzorci repne krvi iz tri grupe prikupljeni su prvog, odnosno četrnaestog dana. WBC i trombociti su izbrojani u uzorcima periferne krvi, a određivani su nivoi Hb. Po završetku eksperimenata, miševi su žrtvovani i pripremljeni su razmazi femura za diferencijalno brojanje ćelija sa jezgrom koštane srži (BMNC) (Slika 1).
Transmisiona elektronska mikroskopija
Femoralna srž je razmazana i isečena na ultratanke delove. Mitohondrije hematopoetskih ćelija u femoralnoj srži analizirane su i izbrojane transmisijskom elektronskom mikroskopijom (JEM-2000EX, Japan) u 50 vidnih polja.
Kriva vremena lize mitohondrija
Mitohondrije su ekstrahovane iz mišjih BMNC u skladu sa protokolom proizvođača kompleta za izolaciju mitohondrija (Pierce Biotechnology Inc., SAD). Koncentracija monoamin oksidaze(MAO) ukazuje na koncentraciju mitohondrija i određena je korištenjem suspenzije mitohondrija od 200U/ml iz 20 serumskih kultura, unutar 12 sati u različitim vremenskim točkama (intervali od 30 minuta). Određen je i sadržaj citokrom oksidaze (Cox) i malat dehidrogenaze (MDH) u podlozi. Analiza vremena vršnog opterećenja mitohondrijalne membrane i krivulje koncentracija-vrijeme specifičnih enzima za matriks pokazala je stepen lize mitohondrijske membrane.
Potencijal mitohondrijske membrane
Nakon pre-inkubacije s MAO ili ASP, izolovani mitohondriji iz tri grupe su resuspendirani u 0.5 ml fiziološke otopine puferirane fosfatom (Wuhan Boster Biotechnology, Ltd., Kina) i 10 ul radne otopine rodamina 123 ( Sigma-Aldrich, USA) je dodana i inkubirana na 37 stepeni C u 5% CO2 tokom 15 min. Potencijal mitohondrijalne membrane je analiziran protočnom citometrijom koristeći talasnu dužinu ekscitacije od 490 nm i talasnu dužinu emisije od 520 nm.
Statistička analiza
Statistička analiza je izvršena korištenjem softvera SPSS 19.0. Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti i standardne devijacije. Studentov t-test je korišten za poređenje različitih grupa. P < 0.05="" se="" smatra="" statistički="">
cistanche biljka: za bolji kvalitet kostiju
Rezultati
Broj periferne krvi i BMC
Korištenjem potpuno automatskog analizatora krvnih stanica, utvrđeno je da je broj stanica periferne krvi i BMC kod AA miševa značajno smanjen (P<0.05), indicating="" that="" the="" aa="" mouse="" model="" was="" successfully="" established="" (table="">
Ultrastruktura mitohondrija kod miševa s aplastičnom anemijom
Transmisiona elektronska mikroskopija koštane srži AA miševa pokazala je da se ultrastruktura mitohondrija značajno poboljšala sa ASP u tretiranoj grupi (tabela 2 i slika 1), što ukazuje da ASP stabilizuje mitohondrije kod AA miševa. Veličina i oblik mitohondrija kontrolne grupe bili su normalni. U kontrastu. mitohondrije AA grupe su imale uvećane globularne strukture, zajedno sa prekidom ili nestankom krista (Slika 1A-C).
Potencijal mitohondrijske membrane (MMP) kod miševa s aplastičnom anemijom
Kako je transmisiona elektronska mikroskopija otkrila oštećenje mitohondrija, odredili smo učinak ASP na MMP kod AA miševa mjerenjem relativnih razlika u fluorescenciji Rh 123 između tri grupe pomoću fluorescentnog spektrofotometra.
Rezultati su pokazali da je Rh 123 fluorescencija ćelija koštane srži u AA grupi (19,6±3,03) bila niža od one u kontrolnoj grupi (31,7±2,59, P<0.0). however,="" the="" rh="" 123="" fluorescence="" of="" the="" asp-treated="" aa="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" aa="" group=""><0.0i)(table 2="" and="" figure="" 2),="" indicating="" that="" asp="" facilitated="" the="" recovery="" of="" the="" mmp="" in="" aa="">
Kriva vremena mitohondrijske lize ranog oštećenja ćelija
U kontrolnoj grupi, sadržaju mitohondrijske in vitro kulture Coxa i MDH trebalo je 3,5 sata da dostigne maksimum. Sadržaj MAO u kulturi nije se značajno mijenjao tokom vremena, ali se sadržaj COX i MDH postepeno povećavao s vremenom, dostižući vrhunac, a zatim postepeno opadajući. Dakle, kompletnom mitohondrijskom sadržaju koji su oslobodile ćelije trebalo je oko 3,5 sata da dostigne vrhunac cijepanja.
Pikovi COX i MDH u AA grupi su se pojavili na 1,5 sati, 1,375U/, 36,732U/l, respektivno. Pikovi COX i MDH u tretiranoj grupi pojavili su se nakon 5,5 sati, 6,5 sati, 1,341U/l, 33,994U/, respektivno. Za statističku analizu korištena su dva skupa podataka u svakoj vremenskoj tački. Nakon 1,5 sata, nivoi COX i MDH u AA grupi su bili značajno viši nego u liječenoj grupi (P < 0.05).="" stoga="" je="" potpuno="" mitohondrijalno="" cijepanje="" u="" serumu="" značajno="" odgođeno="" nakon="" dodavanja="" asp="" (p="">< 0,05),="" uz="" blagi="" pad="" pika="" (slika="">
Diskusija
Aplastična anemija (AA) je sindrom zatajenja koštane srži koji karakterizira periferna pancitopenija i hipoplazija srži. Mutacije i nestabilnost mtDNK dokazane su kod nekoliko bolesti. Disfunkcija mitohondrija i smanjenje broja mitohondrija mogu rezultirati smanjenjem mtDNA. Utvrđeno je da se stečene delecije mtDNA u hematopoetskom kompartmentu javljaju kod teške pancitopenije i retikulocitopenije [11]. Na osnovu našeg prethodnog istraživanja [5], ispitali smo može li ASP stabilizirati mitohondrijalnu membranu AA miševa.
Kompleks polisaharida i željeza Angelica Sinensis (APIC) ne samo da ima superiorni terapeutski učinak na IDA, već i na dopunu krvi i promicanje cirkulacije krvi [12]. ASP može biti koristan za liječenje bolesti izazvanih prekomjernom ekspresijom hepcidina sprječavanjem Janus-kinaze (JAK), sina majki, protiv ekstracelularnih dekapentaplegičnih (SMAD) i 1 signalno reguliranih kinaznih (ERK) puteva za smanjenje ekspresije hepcidina kod IDA štakora [13 ]. Qin J je otkrio da ASP može poboljšati sintezu proteoglikana (PG) hondrocita u modelu OA štakora in vivo i IL-1B-stimuliranim hondrocitima in vitro promovirajući ekspresiju agrekana i GT uključenih u sintezu PG [14].
U našem istraživanju, AA mišji model induciran je kombinacijom acetil fenilhidrazina, rendgenskih zraka i ciklofosfamida. AA miševi su pokazali statistički značajno smanjenje leukocita u perifernoj krvi, Hb i trombocita (Tablica 1), te ozbiljno smanjenje ćelija srži humeralne srži i progenitornih stanica koje se nalaze u srži, što su kliničke karakteristike AA. AA miševi tretirani ASP pokazali su progresivno povećanje BM ćelija u poređenju sa AA grupom. Osim toga, utjecao je i broj mitohondrija u hematopoetskim stanicama. ASP je rezultirao značajno većim brojem mitohondrija u tretiranoj grupi u poređenju sa AA grupom (Slika 1). Ovi rezultati su pokazali da ASP može promovirati proliferaciju stanica s jezgrom srži, povećati broj mitohondrija i stabilizirati mitohondrijalnu membranu kod AA miševa.
Povreda mitohondrija se odražava oštećenjem mtDNK i padom nivoa transkripata mtRNA, sinteze proteina i funkcije mitohondrija, što može rezultirati smanjenom ćelijskom energijom, poremećajem ćelijske signalizacije i interferencijom sa ćelijskom diferencijacijom i apoptozom. Nadalje, deficitarna mitohondrijska proizvodnja ATP-a može promicati hromozomsku nestabilnost[15]. Budući da mtDNA kodira komponente četiri od pet mitohondrijalnih respiratornih kompleksa, promjene u mtDNK rezultiraju mitohondrijskom bolešću [16-18]. Osim mitohondrijske bolesti, mutacije u mtDNK povezane su s rakom, dijabetesom. kardiovaskularne bolesti. neurodegenerativnih poremećaja, hematoloških bolesti poput leukemije kao i normalnog procesa starenja [19]. Važno je da mutacije mtDNK, kao i smanjenje broja kopija mtDNK, mogu biti patogene [20, 21]. Razumijevanje ćelijskih mehanizama za održavanje integriteta mtDNK i broja kopija je od najveće važnosti jer može pružiti mete za kliničke intervencije usmjerene na prevenciju i liječenje hematoloških bolesti kao što je AA. Ovi faktori takođe mogu dovesti do smanjenog metabolizma energije, što će uticati na samoobnavljanje i diferencijaciju hematopoetskih matičnih ćelija.
Nalazi ove studije pokazuju da ASP može poboljšati ultrastrukturu mitohondrija i potisnuti smanjenje transmembranskog potencijala i apoptozu mijeloidnih elemenata kako bi izliječio zatajenje koštane srži.
Cistanche & Cistanche ekstrakt: dobro za kosti
Reference
1 Chinnery PF, Schon EA. Mitohondrije. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2003, 74: 1188-1199.
2. Gattermann N. Mitohondrijalne DNK mutacije u hematopoetskom sistemu. Leukemia 2004,18:18-22.
3. Gattermann N, Retzlaff S, Wang YL, et al. Heteroplazmatske tačkaste mutacije mitohondrijske DNK koje utječu na podjedinicu I citohrom c oksidaze kod dva pacijenta sa stečenom idiopatskom sideroblastičnom anemijom. Blood 1997,90:4961-4972.
Kim HR, Shin MG, Kim MJ, et al. Mitohondrijski
4 . DNK aberacije ćelija koštane srži pacijenata sa aplastičnom anemijom. Korean Med Sci 2008, 23:1062-1067. X Cui, JO Wang, ZG Cai, et al. Kompletan niz
5. analiza mitohondrijalne DNK i dužine telomera kod aplastične anemije.Int J Mol Med 2014.34:1309-1314.
6. Chiu TL, Su CC. Tanshinone IA inducira apoptozu u ćelijama raka pluća A549 kod ljudi indukcijom reaktivnih vrsta kiseonika i smanjenjem potencijala mitohondrijske membrane. Int J Mol Med 2010,25:231-236.
7. Liu PJ. Hsieh WT. Huang SH, et al. Hematopoetski učinak polisaharida topivih u vodi iz Angelica Sinensis na miševe s akutnim gubitkom krvi. Exp Hematol 2010, 38: 437-445.
8. Kuang X, Yao Y, Du JR, et al. Neuroprotektivna uloga 8F Z-ligustilida protiv ishemijske povrede prednjeg mozga kod ICR miševa. Brain Res 2006,1102:145-153.
9. Xin J.Zhang J. Yang Y, et al. Radi Angelica Sinensis koja sadrži komponentu Z-ligustilid promovira neurogenezu odraslih kako bi posredovao u oporavku od kognitivnog oštećenja Curr Neurovasc Res 203, 10:304-315.
10. Chen YF, Wu ZM, Xie C, et al. Nivo ekspresije IL-6 koji luče stromalne ćelije koštane srži kod miševa sa aplastičnom anemijom.ISRN Hematol 2013:986219.
11. Hatfill SJ, LaCock CJ, Laubscher R, et al. Arole za mitohondrijsku DNK u patogenezi mijelodisplazije izazvane zračenjem i sekundarne leukemije. Leuk Res 1993,17:907-913.
12. Wang PP, Zhang Y, Dai LQ, et al. Efekat kompleksa polisaharida i željeza Angelica Sinensis na anemiju zbog nedostatka željeza kod pacova. Chin J Integr Med 2007, 13:297-300.
13. Zhang Y, Cheng Y, Wang N, et al. Djelovanje JAK, SMAD i ERK signalnih puteva na supresiju hepcidina polisaharidima iz Angelica Sinensis kod pacova s anemijom zbog nedostatka željeza. Funkcija hrane2014.5: 1381-1388.
14. Qin J, Liu YS, Liu J, et al. Utjecaj polisaharida Angelica Sinensis na osteoartritis in vivo i in vitro: mogući mehanizam za promicanje sinteze proteoglikana. Evid Based Complement Alternat Med 2013,79476.
15. Gattermann N. Mitohondrijalne DNK mutacije u hematopoetskom sistemu. Leukemia 2004,18:18-22.
16. Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA. Delecije mišićne mitohondrijalne DNK u bolesnika s mitohondrijalnim miopatijama. Nature 1988, 331:717-719.
17. Lestienne P, Ponsot G Kearns-Sayreov sindrom s delecijom mišićne mitohondrijske DNK. Lancet 1988, 1:885.
18. Wallace DC, Singh G, Lott MT, et al. Mitohondrijalna DNK mutacija povezana sa Leberovom nasljednom optičkom neuropatijom. Science 1988,242:1427-1430.
19. Wallace DC. Mitohondrijska paradigma metaboličkih i degenerativnih bolesti, starenja i raka: zora za evolucijsku medicinu. Annu Rev Genet 2005, 39: 359-407.
20. Clay Montier LL, Deng JJ, Bai Y. Broj je važan: kontrola broja kopija mitohondrijske DNK sisara. J Genet Genomics 2009,36:125-131.
21. Rötig A, Poulton J. Genetski uzroci iscrpljivanja mitohondrijske DNK kod ljudi. Biochim Biophys Acta 2009,1792:1103-1108.
ekstrakt cistanche: podstiče formiranje kostiju i povećava gustinu kostiju
