MiR-214 Ameliorates Sepsis-induced Akutna ozljeda bubrega Via PTEN/AKT/mTOR-regulisana Autofagija
Feb 28, 2022
Apstraktno. Prethodne studije su sugerirale da oksidativni stres i autofagija rezultiraju akutnimpovreda bubrega (AKI) tokom sepse i mikroRNA (miR)-214 služi vitalnoj ulozi u zaštitibubrezipodvrgnut oksidativnom stresu. Sadašnja studija ima za cilj testiranje da li je renoprotekcija miR-214 povezana sa autofagijom u sepsi. Uloga autofagije je istražena u modelu miša cekalne ligacije i punkcije (CLP). Reverzno transkripciono-kvantitativno polimerazno lančana reakcija(RT-qPCR) je korištena za analizu izraza miR-214. Struktura i funkcijabubreziizvađeni iz miševa su bili evaluirani.Bubregnivoi autofagije su otkriveni sa imunohistohemijskim, imunofluorescentnim i zapadnim blottingom. Pronađeno je da miR-214 može ublažiti AKI kod septičkih miševa inhibirajući nivobubregautofagija. Nadalje, miR-214 je inhibirao autofagiju utišajući PTEN izraz ububregtkivima septičkih miša. Ovi fifinfini ukazuju da je miR-214 ameliorirao AKI izazvan CLP smanjenjem oksidativnog stresa i inhibirajući autofagiju kroz regulaciju puta PTEN/AKT/mTOR.
Ključne reci:mikroRNA-214, sepsa, akutna povreda bubrega, autofagija, bubreg
Uvođenje Akutnapovreda bubrega(AKI) je jedna od uobičajenih komplikacija sepse i javlja se kod 40-50% septičkih bolesnika, sa stopom smrtnosti do 60% (1). Međutim, patogeneza AKI izazvana sepsom ostaje nejasna. Prijavljeno je da autofagija služi ključnoj ulozi u AKI izazvanoj sepsom i inhibiciji autofagije rezultata u razvoju AKI tokom sepse (2,3). Prethodne studije (4,5) potvrdile su da sepsa pokreće autofagiju u više organa, uključujući ibubreg(6) i autofagički procesi su uključeni u uklanjanje oštećenog mitohondrija i oksidativnog stresa (7). Međutim, pretjerana autofagija može izazvati neželjenu i brisanje ćelijske smrti (8). Stoga, umjereni nivo autofagije je ključ za smanjenje AKI izazvane sepsom. Prethodne studije su izvijestile da miR-214 ameliorates ischemia-reperfusion-induced AKI inhibirajući apoptozu (9) i miR-214 potiskuje oksidativni stres u dijabetičke nefropatije putem reaktivne vrste kisika (ROS)/AKT/mTOR signalnog puta (10). Sadašnja studija je otkrila da miR-214 može umanjiti disfunkciju miokarda izazvanu sepsom kod mišova inhibicijom autofagije (11). Međutim, da li miR-214 može ameliotrirati AKI izazvan sepsom, ostaje da se elucidira. U sadašnjoj studiji, bilo je hipoteza da miR-214 atenuira CLP-inducirani AKI smanjenjem oksidativnog stresa i inhibirajući autofagiju kroz regulaciju puta PTEN/AKT/mTOR.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLEST BUBREGA/BUBREGA
Materijali i metode
Životinje.Ukupno 100 Kunming muških miševa (težina, 20,40±2,92 g; dob, 6-8 sedmica) koje je isporučio Medicinski laboratorijski životinjski centar Medicinskog univerziteta Hebei (Shijiazhuang, Kina) su korišteni u sadašnjem istraživanju. Svi miševi su bili aklimirani na 12-h svjetlosni/tamni ciklus na 24°C sa 50% vlažnosti i dobili su slobodan pristup hrani i vodi na ≥1 tjedan prije eksperimenata. Sve eksperimentalne procedure su izvedene u strogoj skladu sa Nacionalnim zavodom za zdravstvo (NIH Publikacija broj 85-23, revidirana 1996) i odobrenje od strane Institucionalnih odbora za njegu i upotrebu životinja Centralne bolnice Cangzhou (odobrenje broj 2017-020-01). Sve operacije su izvedene pod anesteziom i uložio se svaki napor da se patnja svede na minimum.
Cekal ligacija i punkcija (CLP).CLP je izveden na miševe kako bi se stvorio model sepse murina, kao što je prethodno opisano (12). Nakon anestezije udisajem izoflurana (induciran na 3% i održavan na 0,5%), rez srednje linije od 1 cm je presečen. Izloženi cecum (udaljenost od kraja od 1 cm) je ligatiran s dvije ubodne ubode pomoću iglice od 23 m. Cecum je nježno ektrudirao malu količinu izmeta i bio je ponovo smeštan u svoj anatomski položaj. Trbušni zid je bio zašit u sloj sa svilenom pletenom od 3-0. Nakon postupka, 1 ml od 0,9% otopine je ubrizgano supkutano. Miševi su imali besplatan pristup samo vodi. Sham model miševi su upravljani na isti način kao i CLP model bez CLP-a.
Eksperimentalni dizajn.Miševi (n=6 za sham kirurgiju i CLP) su nasumično dodijeljeni sedam grupa: Sham group, CLP grupa, adenovirus (Ad)-zeleni fluorescentni protein (GFP) + CLP grupa, Ad-miR-214 + CLP grupa, anti-miR-214 + CLP grupa, inhibitor PTEN + CLP grupa i Ad-miR-214 + PTEN inhibitor + CLP grupa. Miševi grupe Sham bili su izloženi istom postupku ali bez ligacije i punkcije cecuma. Miševi u drugim grupama su dobili cekalnu ligaciju i perforaciju. Svi miševi su brzo anestezisani inhalacijom izoflurana kako bi se prikupila krv, urin ibubreguzoraka 24 h nakon zadnjeg tretmana.
Ad-miR-214, anti-miR-214, ili Ad-GFP posrediran adenovirusomtransfer gena in vivo i inhibitor PTEN injekcije. Ad-miR-214,anti-miR-214, ili Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) isporučuje se u trbušnu šupljinu miša 4 dana prije CLP-a. Ukratko, miševi su anestezisani izofluranom udisaja. Kateter koji sadrži 200 μl adenovirusa (2x1011 pfu, izražavajući miR-214, anti-miR-214 ili Ad-GFP) je primjenjivan normalnim mišem putem intraperitonealne injekcije. The PTEN inhibitor (VO‑OHpic, intraperitoneal, Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) je dat CLP miševima koji su dobili anti-miR-214 putem intraperitonealne injekcije u jednoj dozi od 10 μg/kg 30 min prije davanja adenovirusa.
Procjena funkcije bubrega. Uzorci krvi su ubrani iz mišjeg srca, a slijedi centrifugacija (na sobnoj temperaturi 15 min na 3.000 x g) za prikupljanje seruma. Nivo seruma dušika ureje u krvi (BUN) i kreatinina u serumu (Cr) određen je pomoću Hitachi 7600 automatskog analizator (Hitachi, Ltd.). ELISA je korištena za analizu nivoapovreda bubregamolekula-1 (KIM-1; mačka. ne. RKM100; R&D Systems,Inc.) i lipokalin povezan s neutrofilom želatinom (NGAL; mačka. ne. DY3508; R&D Systems, Inc.) u uzorcima urina.
Ispitivanje seruma za upalu citokina.Serum TNF-α (mačka. ne. H052) i IL-6 (cat. no. H007) su ispitani koristeći komercijalne ELISA kits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) prema uputama proizvođača.Mjerenje oksidativnih markera stresa. Odgovarajući assay kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina) je korišten za mjerenje nivoa malondialdehida (MDA) i testiranje aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) u skladu sa uputstvima proizvođača.
Histologija i tubularne povrede rezultat. Svi miševi su bili podvrgnutibubregperfuziju pod anestezijom 24 h nakon CLP-a. Ububregprimjerci su fiksirani u 4% paraformaldehida za 72 h na 4 °C. Uzorci tkiva su potom dehidrirani u razredenoj seriji rastvora etanola, ugrađenih u parafin i rezina na 4-μm sekcije. Sekcije (4 μm) su izrezane pomoću mikrotoma, a dijelovi u tkivu su bili zatamnjeni hematoksilinom (5 min) i eozinom (1 min) na sobnoj temperaturi za histološki pregled. Slajdovi su ocjenjivani i ocjenjivani pomoću mikroskopa (BX51, Olympus Corporation).Bubregpovrijeđena su tkiva sa sljedećim histopatološkim promjenama: Gubitak granice četkom, vakuolizacija, formiranje ljeva, cjevasta dilacija i poremećaj, liza ćelija i ćelijska nekroza. Oštećenje tkiva je provjereno na zaslijepljen način i zabilješeno postotkom oštećenih tubula: 0, bez oštećenja; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75% (13).
Transmission electron microscopy (TEM).Svježbubrezioprani su u fosfatnom baferiranom slanom otopini, i izrezani na kocke od 1 mm i sekvencalno fiksirani u 2,5% glutaraldehida za 24 h na 4°C. Sekcije su uronjene u 1% osmijum tetroksida za 2 h na 4°C, dehidrirani u razreden etanol i ugrađeni u epoksiresin. Konačno, ultratinski odjeci (60 nm) su udvostručeni zamazani uranil acetatom i olovnim citratom na 20°C 60 min. Posmatranje je izvršeno na transmisijskom elektronskom mikroskopu (Tecnai; Hitachi, Ltd.) na 80 kV pomoću Elektron Microscopy Film 4489 (ESTAR debela baza; Kodak).
Immunohistochemistry (IHC).Svježbubregtkivo je fiksirano u 4% paraformaldehida (za 72 h na 4°C) i ugrađeno u parafin. Primjerci su izrezani na 4 sekcije debljine μm i deparaffinizirani u ksilenu. Nakon što su odjeljci za tkivo oprani PBS-om, kuhani su u 10 mM citratnog bafera (pH 6,0) 4 min za dohvaćanje antigena, a zatim blokirani sa 10% kozjeg seruma u PBS-u na sobnoj temperaturi 1 h. Primarno antitijelo (anti-LC3B; 1:400; cat. no. 4412; Cell Signaling Technology, Inc.) dodat je u skladu sa uputama i inkubiran na 4°C za 12 h. Sekundarno protutijelo (kozji antirabbit HRP; 1:2,000; mačka. ne. BS13278; Bioworld Technology, Inc.) dodana je i inkubiran na sobnoj temperaturi 10 min. DAB (100 μl) je dodan i kontraodbojan 5 min sa uočavanim mrljama pod svjetlosnim mikroskopom (Model CX31-P; Olympus Corporation). Intenzivnost pozitivnog bojenja, koje se pojavilo smeđe, određena je pomoću image-Pro Plus 6.0 softvera za analizu slika (Media Cybernetics, Inc.). Integral optička denziteta (IOD) je izračunata tako da predstavlja intenzivitet. IOD vrijednosti su se povećavale kako se ekspresija proteina povećavala.
Obrnuti transkripcija-kvantitativni(RT-q) PCR. Totalna RNK je izvađena iztkivo bubreganakon indukcije modela koristeći TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Prema uputama TaqMan reverzno transkripcije (cat. no. N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), RNK je bila obrnuta transkribed u cDNA. Korišteni su sljedeći termociklička stanja (miR-214): Početna denaturacija na 95°C 5 min; slijedi 40 ciklusa denaturacije na 95°C za 30 sek, Annealing na 60°C za 30 sekundi i izduljenje na 72°C za 30 sek. RT-qPCR je izveden pomoću ABI Prism 7500 Sequence Detection System (PerkinElmer, Inc.) i standardni SYBR Green PCR kit (Toyobo Life Science). U6 je korišten kao interna kontrola za miR-214. Primer sekvence su bile slijedeće: miR-214, naprijed, 5'-AGCATAATACAGCAGGCAGAC-3' i reverse, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCAC-3'; U6, naprijed, 5'-ATTGGAACGATACAGAGAGAATT-3' i reverse, 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'. Ovi iskusi- menti su replicirani šest puta. Rezultati su analizirani metodom 2-ΔΔCq (14). Nivoi mRNA izraza LC3, p62, PTEN, AKT i mTOR su evaluirani putem RT-qPCR. Sa β-aktinom kao internom referencom ovih gena, 2-ΔΔCq je korišten za mjerenje relativnog izraza ciljnih gena. Prajm sekvence prikazane u Tabeli I sintetizovane su od strane Sangon Biotech Co., Ltd.
Zapadno blotting. Bubregtkivo je pomiješano sa RIPA lisatom (Beyotime Institute of Biotechnology) kako bi homogenat i liza bila zaustavljena kada nije uočen vidljivo tkivo. Uzorci su centrifugiran na 13.000 x g 10 min na -4°C i supernatant je pronađen za analizu zapadnog blot-a. Ukratko, koncentracije proteina su utvrđene pomoću mikro BCA proteina assay kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Uzorci proteina (80 μg po uzorku) bili su podvrgnuti odvajanju smanjenjem 12% natrijevih dodecil sulfata-poliaklidegel elektroforeze, a zatim preneseni na polivinilidenske difluoridne membrane na 4°C preko noći. Odvojeni proteini su preneseni na PVDF membrane. Nakon blokiranja u 5% obranog mlijeka na 2 h, membrane su inkubirali preko noći (na 4°C) sa primarnim antitijela. Korištena su sljedeća primarna antitijela (all Cell Signaling Technology, Inc.) : Light chain 3B (1:1,000; cat. no. 4412), p62 (1:1.000; mačka. broj 4412), Anti-PTEN (1:1.000; mačka. broj 9188), anti-fosforilated (p)-AKT (Ser473) (1:1.000; mačka. no. 4060), anti-AKT (1:1,000; cat. no. 9272), anti-p-mTOR (Ser 2448) (1:1.000; cat. no. no. 5536), anti-mTOR (1:1.000; mačka. broj 2972) i β-aktin (1:2.000; mačka. broj 4970). Nakon opranja, membrane su inkubirali (na sobnoj temperaturi za 2 h) s HRP-konjugiranim anti-zečjim sekundarnim antitijelama (1:3.000; mačka. ne. A0208; Beyotime Institute of Biotechnology). Proteinski bendovi su otkriveni sa Immobilon Western (MilliporeSigma) i analizirani koristeći Total-Lab TL120 soft- ware (Nonlinear Dynamics, 2.01). Izraz proteina je normaliziran β-aktin.
Statistička analiza. Statistička analiza je izvršena pomoću GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). Svi podaci su predstavljeni kao ± standardne devijacije ili medijana (međukvartilni rasponi) za kontinuirane varijable, u zavisnosti od njihovih distribucija. Osnovnim karakteristikama i ishodima su upoređeni pomoću jednosmjernog ANOVA praćenog Tukeyjevim posthoc testom, ili Kruskal-Wallis testom praćenim Dunnovim testom kako je to prikladno. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Rezultate
Tačka vremena 24 h nakon CLP-a. Prethodne studije su izvijestile (6,15,16) da biohemijski (i.e., LC3 i p62) analiza otkriva da se fluks autofagije potiskuje sa progresijom sepse nakon 6-8 h CLP-a. U sadašnjoj studiji, broj autolysosoma ububregCLP-liječe miševi povećana unutar 24 h nakon operacije. Osim toga, analiza markerapovreda bubregapokazao dafunkcija bubregaje najozbiljnije oštećena 24 h nakon CLP-a. Stoga je vrijeme 24 h nakon CLP-a bilo birati za sljedeće eksperimente.
Regulatorni efekat na MIR-214 u tkivima bubrega. RT-qPCR analiza je korištena za otkrivanje izraza miR-214 kod miša liječenim CLP-om. Pronađeno je da je miR-214 izraz malo neugušen ububregtkivima nakon operacije CLP-a 24 h, u usporedbi s grupom sham (1,47-fold, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">bubregtkivo, u usporedbi s grupom sham (oba P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI ZATAJENJE BUBREGA/BUBREGA
Efekat miR-214 na disfunkciju bubrega kod septičkih mišova.Svi miševi su žrtvovani da bi se prikupila krv, urin ibubreguzoraka 24 h nakon operacije CLP. BUN i Cr su važni pokazatelji ozbiljnostibubreg(17). Nadalje, NGAL i KIM-1 identificirani su kao specifični biomarkeripovreda bubregai njihovo povećano izražavanje je povezano s ranimbubregtubularne povrede u AKI (17). Kao što je prikazano na fig. 2A-D, nivoi BUN, Cr, KIM-1 i NGAL su značajno povećani nakon operacije CLP u odnosu na grupu sham. Međutim, Ad-miR-214 je značajno snizio nivo BUN, Cr, KIM-1 i NGAL u usporedbi s CLP grupom (svi P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">funkcija bubregaParametri. Međutim, nakon pretreatmenta sa PTEN inhibitorom, efekti zaštite Ad-miR-214 su poboljšani. Rezultati pokazuju da MIR-214 umanjuje disfunkciju bubrega kod septičkih miševa.
Efekat miR-214 na upalu bubrega i oksidativni stres.Kao što je prikazano na fig. 3A i B, CLP je značajno povisio nivoe TNF-α i IL-6, dok je Ad-miR-214 značajno snizio nivoe ovih markera. U usporedbi s
Efekat miR-214 na autofagiju bubrega u septičkim miševe.U sadašnjoj studiji ispitane su promjene u LC3 ububregtkivima preko IHC mrlja. Kao što je prikazano na fig. 6, LC3 intenzivitet pozitivnog mrlja se značajno povećao u CLP grupi u odnosu na grupu sham (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR-214 aktivira AKT/mTOR put da inhibiraautofagija utišavanju PTEN-a u tkivima bubrega.Učinak CLP-a na autofagiju ububregtkivima je istraženo tako što su se procijenile razine LC3-II/I i p62. PTEN/AKT/mTOR signalni put služi važnoj ulozi u autofagiji (18). Da bi se istražilo dejstvo miR-214 na put PTEN-AKT/mTOR, nivoi proteina LC3-II/I, p62, AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR i PTEN analizirani su putem zapadnog blottinga i RT-qPCR anal- ysis. Kao što je prikazano na fig. 7A-C, brzo se javlja modifikacija u tim proteinima, sa povećanjem stope LC3-II/LC3-I, i smanjenjem nivoa p62 (oba P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">bubregtkivima (oba P>0,05). Dva pokazatelja LC3-II/LC3-I i p62 nisu imala značajnu razliku među Ad-miR-214 grupom, PTEN inhibitorom i Ad-miR-214 + PTEN inhibitorom grupe (svi P>0.05). Ovi rezultati su pokazali da je autofagija izazvana CLP-om, a preekspresija miR-214 je mogla djelomično inhibirati.
Kao što je prikazano na fig. 7A i D-F, nivo izraza PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">bubregtkivima (sve P>0.05). Među ad-miR-214 grupom Ad-miR-214, PTEN inhibitorom i ad-miR-214 + PTEN inhibitorom grupe (svi P>0.05). Ovi nalazi ukazuju da CLP induciebubregtkivna autofagija inhibijući AKT/mTOR put. Ad-miR-214 je aktivirao AKT/mTOR put utišajući PTEN ububregtkivima. Međutim, u poređenju sa CLP grupom, anti-miR-214 nije značajno inhibirao izraz mTOR-a. Stoga je RT-qPCR dodatno korišten za određivanje izraza mRNA gena vezanih za signalni put PTEN/AKT/mTOR. Prema rezultatima RT-qPCR (fig. 8), u poređenju sa grupom Sham, nivoi mRNA izraza p62, LC3 i PTEN su bili označeno povećani, dok je mRNA izraz AKT-a i mTOR-a bio umanjen u CLP grupi. U usporedbi s CLP grupom, Ad-miR-214, PTEN
inhibitor i Ad-miR-214 + PTEN inhibitorske grupe su prikazivali snižen mRNA izraz LC3 i PTEN, ali je povećan mRNA izraz p62, AKT i mTOR (svi P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). Tako, učinak p62 na autofagiju može se pojaviti na transkripcionom nivou, a ne na post-transkripcionom nivou. Trenutni rezultati su demonstrirali da je miR-214 downreg- ulated izraz PTEN-a i aktivirao AKT/mTOR signalni put.
Rasprava
Sadašnja studija je otkrila da je pretjerana autofagija štetna zafunkcija bubregau septičkim miševe. Prethodne studije su pokazale da je miR-214 povezan sa povećanom proliferacijom, metastazom, invazijom i funkcijama kao onkogenom za ćelije i tkivo (19-22). Studije izvještavaju da miR-214 služi zaštitnu rupu protiv AKI putem umanjivanja apoptoze, oksidativnog stresa i snižavanja upalnih faktora (21,23). U ovoj studiji dalje su ispitani mehanizmi na kojima se podučava zaštitni efekat miR-214 na AKI izazvan sepsom fokusirajući se na potencijalno učešće miR-214 u modulaciji autofagije. Rezultati su pokazali da se oksidativni stres dogodio ububregnakon administracije CLP operacije. U međuvremenu, aktivacija autofagije se događa ububreg.PovišenI LC3 II/I i smanjenje p62 ububregprimjećivana je nakon liječenja operacijom CLP. Kao što se očekivalo, preispresija miR-214 značajno je umanjenabubregpatoloških povreda ibubregdisfunkcija uzrokovana sepsom. Međutim, inhibicija miR-214 je pokazivala suprotnu tendenciju renoprotekcije. Osim toga, efekt zaštite Ad-miR-214 je poboljšan PTEN inhibitorom.
U septikububreg, pretjerana upala je praćena masivnim povećanjem proizvodnje ROS i veliki broj ROS pokreće promjene u mitohondrijskoj strukturi i ometa mitohondrijsku funkciju, što uzrokuje da tijelo uđe u začarani ciklus koji otežavabubregoštećenja (24,25). Stoga, oksidativni stres može biti jedan od glavnih patoloških mehanizama AKI izazvane sepsom. Sadašnja studija pružila je daljnje dokaze koji pokazuju pretjeran oksidativni stres, što je ukazivalo na povećanu proizvodnju MDA i smanjenu aktivnost SOD-a ububregtkivima nakon operacije CLP- a. Štoviše, pronađeno je da preispresija miR-214 može zaštititibubregprotiv oksidativne ozljede izazvane CLP-om, koja je uključena u autofagsku inhibiciju. To je u skladu sa prethodnim studijama da miR-214 štiti razne ćelije i tkivo od oksidativnog stresa (26,27).
Autofagija služi kao 'dvostruki mač' u razvoju sepse: Bazalna autofagija može da iznese zaštitne efekte uklanjanjem toksičnih oksidativnih proteina, ali pretjerana autofagija može dovesti do autofagije ćelijske smrti pod teškim stresom, kao što je ROS erupcija (28,29). Pokazalo se da se autofagija u početku aktivira u sepsi, nakon čega slijedi naknadno faza disfunkcije zbog autofagske ćelijske smrti (30), što otežava oksidativnu povredu izazvanu sepsom. U sadašnjoj studiji, PTEN inhibitor ili overexpression miR-214 je prikazao antioksidativnu renoprotekciju kod miša liječenih CLP-om. Međutim, inhibicija miR-214 je pokazivala suprotnu sklonost antioksidativnoj renoprotekciji. Tako da pretjerana ili neadekvatan autofagija može izazvatioštećenje bubrega; oba su maladaptivna i na kraju izazivaju smrt ćelija. Dakle, održavanje umjerenog nivoa autofagije je ključ za olabaviti oksidativnu ozljedu u septickom stanju.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOL U BUBREGU/BUBREGU
Akumulirajući dokazi ukazuju da miR-214 inhibira autofagiju u raznim ćelijama i tkivima (31-33). U sadašnjoj studiji, pronađeno je da preispresija miR-214 inhibira autofagiju izazvanu CLP-om utkivo bubrega,kao što je naznačeno promjenama proteinskih markera, kao što su LC3-II/I i p62. Nadalje, rezultati su demonstrirali da je pretjerana ekspresija miR-214 otežavala oksidativnu ozljedu izazvanu CLP inhibirajući pretjeranu autofagiju. Sadašnja studija također je istraživala molekularne mehanizme kojima miR-214 modulirabubregautofagija u AKI izazvanoj sepsom. PTEN/AKT/mTOR je važan signalni put koji regulirabubregautofagija (34,35) i koja služi keyrole u AKI izazvanoj sepsom, a PTEN je negativan inhibitor signalne putanje PI3K/AKT/mTOR. Prethodne studije su izvijestile da miR-214 može regulirati autofagiju putem signalne staze PI3K/AKT/mTOR u raznim modelima (36-38). Ma et al (39) je otkrio da miR-214 može dolje- regulirati autofagiju u dijabetički bubreg. Stoga se hipotetiziralo da efekti miR-214 na AKI izazvan cLP-om mogu biti uključeni u regulaciju puta PTEN/AKT/mTOR. Uočljivo, rezultati sadašnje studije pokazali su da je operacija CLP značajno povisila nivo PTEN-a, ali je snižen nivo p-AKT i p-mTOR, što ukazuje da je operacija CLP inaktivirala AKT/mTOR put. Osim toga, pretjerivanje miR-214 aktiviralo je AKT/mTOR put utišavanju PTEN-a u CLP-induciranoj autofagiji ububregtkivima. Međutim, anti-miR-214 nije značajno inhibirao izražavanje mTOR-a u zapadnim blot analizama. Tako je RT-qPCR dodatno korišten za određivanje izraza mRNA gena vezanih za signalni put PTEN/AKT/mTOR. Sadašnja studija je utvrdila da je miR-214 umanjio ekspresiju PTEN-a i aktivirao AKT/mTOR signalni put da inhibira autofagiju. Međutim, treba izvršiti daljnje iscrpne studije kako bi se dobili dodatni detalji vezani za mehanizambubregautofagija u septickom stanju.
Da zaključim, rezultati sadašnje studije su sugerirali da je MIR-214 služio zaštitnoj ulozi protiv sepse izazvanepovreda bubregasmanjenjem oksidativnog stresa i inhibicije autofagije kroz regulaciju puta PTEN/AKT/mTOR. Sadašnji fifinfinzi su sugerirali da je miR-214 možda potencijalna terapeutska meta za AKI izazvan sepsom. Međutim, sadašnja studija koristila je miševe stare 6-8 sedmica, pa su potrebna daljnja istraživanja mehanizma miR-214 kod odraslih miša.