Melatonin sprečava infiltraciju T limfocita u bubrege hipertenzivnih štakora, izazvanu ishranom sa visokim sadržajem soli, sprečavanjem ekspresije hemokina CXCR3 liganda
Mar 14, 2022
Za više informacija:ali.ma@wecistanche.com
Ariel Bier1, Rawan Khashab2, Yehonatan Sharabi1,2,3, Ehud Grossman1,2,3i Avshalom Leibowitz1,2,3,*
1Medicine D, Medicinski centar Chaim Sheba, Tel-Hashomer 5262000, Izrael; arielbier@gmail.com (AB);Yehonatan.Sharabi@sheba.health.gov.il (YS); Ehud.Grossman@sheba.health.gov.il (EG)2 Hypertension Unit, the Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israel;rawankhasbab@gmail.com3Sackler Medicinski fakultet, Univerzitet Tel-Aviv, Tel-Aviv 6997801, Izrael*
Sažetak: U prethodnoj studiji smo to pokazalimelatoninsprečavabubregoštećenja u modelu hipertenzije izazvane soli smanjenjem oksidativnog stresa. Pretpostavili smo da ovaj efekat uključuje imunomodulatorna svojstva melatonina. In vivo Study-Dahl pacovi osjetljivi na sol (DSS) hranjeni su normalnom hranom, dijetom s visokim udjelom soli (HSD) ili HSD imelatonin(30 mg/kg/dan) u njihovoj vodi tokom osam sedmica.Bubrezisakupljeni su za trenutnu izolaciju limfocita i karakterizaciju protočnom citometrijom (CD3 plus CD4 plus i CD3 plus CD8 plus) i za hemoatraktant limfocita (uglavnom CXCLhemokini) studije genske ekspresije. In vitro studija - štakor, mezangijalne ćelije (RMC) su uzgajane u medijumu sa visokim sadržajem soli bez i samelatonin. HSD je bio povezan sa značajnom renalfiltracijom CD4 plus i CD8 plus T limfocita u poređenju sa kontrolom. Melatonin značajno smanjuje infiltraciju bubrežnih limfocita. HSD značajno povećava ekspresiju mRNA CXCLhemokini.Dodavanje melatonina u HSD ukinulo je ovaj efekat. Tretiranje RMC ćelija soli povećalo je ekspresiju CXCL10 i CXCL11, ali ne i CXCL9. Dodavanjemelatoninmedijima kulture spriječili su ovo povećanje. Liječenje pacova hranjenih HSD melatoninom smanjilo je ekspresiju hemoatraktantne mRNA bubrežnih limfocita i povezano je sa značajnim smanjenjem infiltracije bubrežnih T limfocita. Sol može imati direktan učinak na bubrežne stanice koje proizvode hemokine, a koje se prigušuju liječenjem melatoninom.
Ključne riječi:melatonin; sol; T-limfociti; hipertenzija;bubreg; CXCL 9; CXCL 10; CXCL 11
1. Uvod
Hipertenzija (HTN) je vodeći faktor kardiovaskularnog rizika koji se može promijeniti. Zbog starenja stanovništva, prevalencija HTN-a u stalnom je porastu, dostižući i do 30 posto u naprednoj dobi [1]. Uprkos raznim medicinskim terapijskim opcijama, kontrola HTN-a u svijetu je loša. Posljedice nekontrolirane HTN su razorne, stvarajući ogroman negativan utjecaj na javno zdravlje [2].
Različiti bihevioralni, okolišni i genetski faktori uključeni su u patogenezu HTN. Visok sadržaj soli u zapadnjačkoj ishrani je impliciran kao glavni faktor koji doprinosi HTN i povezan je s povećanim morbiditetom i mortalitetom. Smjernice i javne inicijative preporučuju smanjenje unosa soli za opću populaciju. Međutim, ne može svaki pojedinac imati koristi od ovog ograničenja, jer patofiziologija koja povezuje osjetljivost na sol s HTN nije u potpunosti shvaćena i potrebno je poboljšano mehaničko razumijevanje [3]. Stoga su nove strategije ključne za bolje razumijevanje i kontrolu HTN-a, čineći nove istraživačke paradigme hitnom potrebom.
Utvrđeno je da su upala i oksidativni stres uključeni u patogenezu esencijalne HTN. Dok se istražuju okidači koji pokreću i nastavljaju ove procese, mnogi eksperimentalni HTN modeli sugeriraju uključivanje adaptivnog imunološkog odgovora [4].
Kliknite zaPrednosti i nuspojave Cistanchea za funkciju bubrega
Tragovi koji povezuju adaptivni imunitet sa HTN-om postoje već od 1960-ih godina. Međutim, tek u posljednje vrijeme, uz bolje razumijevanje imunološkog sistema, mogao se postići napredak u tom pravcu. Pionirska studija Guzika et al. pokazali su da je angiotenzin (Ang) II ili so deoksikortikosterona (DOC) HTN otupljena kod rag1−/− miševa, koji imaju manjak T i B limfocita, i adaptivni transfer T, ali ne i B ćelija, može obnoviti BP odgovor [5]. Od ovog rada, utvrđeno je da su različite komponente usvojenog imuniteta relevantne za patogenezu HTN u većini modela običnih životinja. Uloga T ćelija u modelu HTN izazvanog solima je također opširno proučavana. In vitro studije pokazuju da sol može potisnuti naivnu diferencijaciju T ćelija u TH17 ćelije [6]. Brojni in vivo rad na HTN modelima izazvanim dijetom s visokim udjelom soli (HSD), kao što su Dhal pacovi osjetljivi na sol (DSS), pokazuju ekstenzivnu infiltraciju T stanica bubrega [7-9].
Među brojnim fiziološkim procesima,melatoninauključenost u regulaciju krvnog pritiska je donekle intuitivna. Cirkadijalni obrazac krvnog pritiska podstiče opsežna istraživanja o melatoninu i HTN. Mnogi radovi u prošlosti, na ljudima iu eksperimentalnim modelima, povezivali su niske nivoe melatonina sa HTN [10]. Postoje neki klinički podaci koji ukazuju na to da suplementacija melatoninom može liječiti HTN, uglavnom kod pacijenata s noćnom HTN [11]. Nedosljednost ovih podataka, međutim, postavlja pitanje jesu li necirkadijalna svojstva melatonina također uključena u regulaciju krvnog tlaka.
Protuupalna i antioksidativna svojstva melatonina sugeriraju da melatonin stupa u interakciju s imunološkim sistemom. Podaci koji se pojavljuju su implicirali ulogu signalizacije melatonina u razvoju, aktivaciji, diferencijaciji i pamćenju T ćelija. Postoje dokazi damelatoninmembranski i nuklearni receptori su prisutni na T ćelijama [12,13].Melatoninutiče na proizvodnju mnogih citokina uključenih u imunološki odgovor, kao što je interferon (IFN)— koji je centralni regulator Th1 odgovora [14].
Oksidativni stres i T-ćelijski odgovor, prema nekim istraživačima, djeluju u zajedničkom promicanju razvoja HTN-a i hipertenzivnog oštećenja organa [15]. U prethodnom radu smo to i pokazalimelatoninsmanjuje lokalni (renalni) oksidativni stres i sprječava solju induciranu renalnu fibrozu i proteinuriju u modelu HTN štakora osjetljivog na sol (DSS model) [16]. Budući da oksidativni stres ima ključnu ulogu u adaptivnom imunološkom odgovoru povezanom s HTN-om, pretpostavili smo da su imunomodulatorna svojstva melatonina odgovorna za njegovu zaštitnu ulogu u HTN-induciranom HSD-om.
Cilj ove studije je da se proceni da limelatoninsmanjuje odgovor T ćelija izazvan solju i razjašnjava mehanizme odgovorne za ovaj efekat.
2. Materijali i metode
2.1. Životinje i protokol studija
Protokol studije odobrio je institucionalni komitet za etiku životinja u medicinskom centru Sheba u Izraelu. Njihovo zdravstveno stanje je praćeno mjerenjem tjelesne težine i dnevnim općim praćenjem kretanja i zdravstvenog stanja za svaku životinju. Mužjaci Dahl pacova osjetljivih na sol, stari četiri sedmice (RGD Cat# 1582190, RRID: RGD_1582190), su smješteni u objektu za životinje u redovnim kavezima (dva pacova po kavezu) na 22 ◦C sa ciklusom od 14 svjetla/10 h tame. Štakori su držani na normalnoj ishrani sa soli i davana im je voda iz slavine da piju ad libitum tokom perioda aklimatizacije od pet dana. Pacovi su zatim podijeljeni u tri grupe (n=8), prema ishrani, u periodu od 8 sedmica. Prema etičkom komitetu, životinje koje su pokazivale znakove bolesti i patnje trebale su biti žrtvovane.
Kontrolna grupa je hranjena standardnom hranom za pacove (2018 SC; Teklad Envigo, Madison, WI, SAD) i vodom iz slavine; grupa dijeta s visokim udjelom soli (HSD) hranjena je odgovarajućom obogaćenom slanom dijetom (4 posto) (TD.120485; Teklad Envigo, Madison, WI, SAD) i vodom iz slavine, amelatoningrupa je hranjena istom dijetom obogaćenom soli (4 posto) sa melatoninom (M5250; Sigma, Rehovot, Izrael) (30 mg/kg/dan) u vodi za piće. Tjelesna težina i potrošnja vode mjereni su periodično. Tačna količina melatonina je otopljena u odgovarajućoj količini vode za svaki kavez kako bi se isporučila tačna doza za svaku životinju. Nulti dan je definiran kao dan početka potrošnje HSD-a i melatonina. Na kraju studije, štakori su žrtvovani dubokom anestezijom sa 3 posto izoflurana (dubina anestezije potvrđena stezanjem stražnjeg stopala) ibubrezisu ubrane. Oba bubrega su uklonjena i hemisecirana. Bubrezi su uzeti za analizu protočnom citometrijom osim nekoliko porcija koji su brzo uklonjeni i brzo zamrznuti u tečnom N2 i pohranjeni na -80 ◦C. Za ekstrakciju RNK korištena su smrznuta tkiva.
Cistanche - simptomi bolesti bubrega
2.2. PCR kvantitativne reverzne transkripcije u realnom vremenu
nivoi ekspresije mRNA gena su utvrđeni ububregtkiva pomoću kvantitativne reverzne transkriptaze-PCR u realnom vremenu (qRT-PCR). Ukupna RNK je ekstrahirana iz tkiva bubrega pomoću NucleoSpin RNA kompleta (MACHERY-NAGEL, Düren, Njemačka). Reverzna transkripcija je izvedena korištenjem Applied Biosystems High-Capacity cDNAReverse Transkripcionog kompleta (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, SAD). qRT-PCR reakcije su izvedene korištenjem Power SYBR Green PCR Master Mixa (Applied Biosystems, Warrington, UK) i Applied Biosystems 7500 PCR sistema u realnom vremenu. Uslovi ciklusa su bili: prvi pojedinačni korak od 95 ◦C tokom 0.20 min, a zatim 40 ciklusa faze topljenja u trajanju od 3 s na 95 ◦C i produženi stupanj od 30 s na 60 ◦C. Na kraju 40 ciklusa, izvršena je kriva taljenja. Podjedinica P0 (Rplp0) mRNA lateralne stabljike ribosomalnog proteina korištena je kao interna kontrola. Prajmeri su navedeni u tabeli 1.
Tabela 1. Lista prajmera za pacove korištenih u ovoj studiji.
2.3. Izolacija T ćelija iz bubrega
Nakon uklanjanja bubrežne kapsule, dvabubrezimljeveni su i probijani klipom šprica od 2 mL kroz 100 µm ćelijsko cjedilo u RPMI 1640 koji sadrži 2 mML-glutamina, 10 posto FBS, 10 ug/mL DNase 1 (Tehnologije matičnih ćelija, Cambridge, MA , SAD) i 0,1 posto kolagenaze tipa IV (CLS 4, Worthington Decatur, AL, SAD). Rastvor je inkubiran 25 min na 37 ◦C. Rastvor za ispiranje (DPBS/2 procenta FBS/2 mM EDTA) je zatim dodan homogenatu bubrega da bi se postigla 45 mL i filtriran je kroz sito za ćelije od 70 µm. Rastvor je centrifugiran na 400× g/7 min. a pelet je suspendiran u 5 mL otopine za ispiranje i filtriran kroz 40 µm ćelijsko cjedilo i centrifugiran 400× g/7 min. Peleta je resuspendovana u 3 ml FBS (10 mM EDTA) i slojevita preko Histopaque-1083 (Sigma, Rehovot, Izrael) i centrifugirana na 20 ◦C pri 400× g/30 min sa isključenom kočnicom. Sloj mononuklearnih ćelija koji leži iznad Histopaque-a je uklonjen, dva puta ispran rastvorom za ispiranje i suspendovan u rastvoru za ispiranje od 5 mL za protočnu citometrijsku analizu.
2.4. Protočna citometrija
iz svake grupe,bubrezianalizirano je 5-7 pacova. Za svaki uzorak uzeto je 1 × 106 ćelija. Izolovane mononuklearne ćelije su inkubirane sa ekstracelularnim markerima: anti-CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-0030-82, RRID:AB_465493) i kontrola izotipa (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-4742-41, RRID :AB_10753770), anti-CD4 (Thermo FisherScientific Cat# 17-0040-80, RRID:AB_1210581) i njegova kontrola izotipa (Thermo Fisher Scientific Cat# 17-4724-81, RRID: AB_470188), anti-CD8 (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0084-82, RRID:AB_10548361) i njegova kontrola izotipa (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-4714-80,RRID: AB_657914). Sve ćelije su analizirane protočnom citometrijom (BD FACSCalibur Flow Cytometry System, RRID: SCR_000401) korišćenjem softvera FlowJo (FlowJo, RRID: SCR-008520).
Cistanche-funkcija bubrega
2.5. Cell Culture
Mezangijalna ćelijska linija štakora, RMC (ATCC Cat# CRL{{0}}, RRID: CVCL_0506), dobijena je od ATCC®. Ćelija je kultivisana u Dulbecco-ovom modifikovanom mediju Eagle (01-055-1A, biološka industrija, Beit HaEmek, Izrael) sa 4 mM L-glutamina prilagođenim da sadrži 1,5 g/L natrijum bikarbonata i 4,5 g/L glukoze i dopunjen sa 0,4 mg/mLG418 i 15 posto fetalnog goveđeg seruma. Melatonin je dobijen od Sigme (M5250 Rehovot, Izrael). A 250 mMmelatoninzaliha je napravljena u etanolu. Ćelije su uzgajane u normalnim ili visokim sadržajem soli (dodavanje 80 mM NaCl u mediju) bez ili sa melatoninom (0,5 mM). Tretman melatoninom je vremenski određen 45 minuta prije dodavanja NaCl u mediju. Svi eksperimenti su bili na pločama sa 6 jažica sa 3 × 105 ćelija po jažici i izvedeni su u 6 nezavisnih ispitivanja.
2.6. Statistička analiza
Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM Statističke analize su obavljene korištenjem IBMSPSS Statistics, RRID: SCR_019096. Jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) i posthoc Tukey metodom ispitane su razlike između grupa. qPCR podaci u realnom vremenu analizirani su pomoću DataAssista, RRID: SCR_014969.
3. Rezultati
3.1. Melatonin štiti pacove koji konzumiraju HSD
Starost pacova tokom ove studije bila je 4-13 sedmica. U ovoj dobi, dobrobit pacova je indikovano povećanjem tjelesne težine koje je pokazala kontrolna grupa [17]. Međutim, HSD grupa je dostigla plato 30. dana i dodavanjamelatoninda je HSD poboljšao ovaj fenomen (slika 1A). Grupa HSD pokazala je visoku stopu mortaliteta, gdje je 50 posto pacova uginulo ili je imalo kliničko stanje koje je zahtijevalo eutanaziju prema pravilima životinjskog etičkog komiteta tokom eksperimentalnog perioda. Suplementi melatonina su značajno spriječili smrtnost pacova, gdje je samo jedan od osam pacova uginuo 58. dana, na kraju eksperimentalnog perioda (Slika 1B).
Slika 1.Melatoninpoboljšan krvni pritisak i preživljavanje kod HSD-a. DSS pacovi su tretirani 9 nedelja sa HSD sa i bez melatonina. Dijeta s visokim udjelom soli smanjila je tjelesnu težinu od 36. dana, a melatonin je ublažio ovaj efekat (A). HSD je povećao stopu mortaliteta od 4. dana0. Liječenje HSD-fedrata melatoninom poboljšava njihovo preživljavanje. (B). (n=8) *-p Manje ili jednako 0.05 sol i sol plus melatonin u odnosu na kontrolu. #-p Manje ili jednako 0,05 soli u odnosu na kontrolu i sol plus melatonin. HSD—dijeta sa visokim sadržajem soli.
3.2. Melatonin sprečava infiltraciju T ćelija bubrega izazvanu HSD
Izolirali smo ćelije izbubregi doveo ih do markera T ćelija, CD3. CD3 plus ćelije su zatvorene za CD4 i CD8. I CD3 plus CD4 plus i CD3 plus CD8 plus bili su značajno veći u HSD (5,18 ± 1,62 i 4,6 ± 0,75 posto, respektivno) u poređenju sa kontrolnom (0,16 ± {{18} }.{{20}}2 i 0,95 ± 0,15 posto, respektivno) imelatonindodatak na HSD smanjio je i CD3 plus CD4 plus i CD3 plus CD8 plus ćelije nazad na kontrolne nivoe (0.68 ± 0.21 i 1.37 ± 0.45, respektivno) (Slika 2A–D).
Slika 2. Melatonin sprečava infiltraciju T ćelija ububreg. T ćelije su izolovane iz bubrega pacova i zatvorene za CD3. CD3-pozitivne ćelije su zatvorene za CD4 i CD8. Melatonin (C) je smanjio i CD3 plus CD4 plus i CD3 plus CD8 plus u poređenju sa HSD bez melatonina (B) bez razlike u odnosu na kontrolnu grupu (A). Analiza za sve pacove prikazana je u (D) (n=7–8). HSD—dijeta sa visokim sadržajem soli. *-p Manje ili jednako 0.05 u odnosu na kontrolu. #-p Manje ili jednako 0,05 u odnosu na sol plus melatonin.
3.3. Melatonin smanjuje određene hemokine u bubrezima koji su povećani u HSD-u
Regrutiranje T ćelija u upalna tkiva regulirano je lokalnom ekspresijom hemokina. Stoga smo izmjerili ekspresiju dvije porodice hemokina u pacovimabubrezi: porodica hemokina (CXC motiv) liganda (CXCL) i porodica hemokina (C-Cmotif) liganda (CCL).
Za porodicu CXCL, CXCL 9, 10 i 11 koji privlače T ćelije u svoje ciljno tkivo koristeći CXCR3 receptor na T ćelijama, bili su značajno povećani kod HSD pacova. Thesupplementation ofmelatoninna HSD je smanjio njihovu ekspresiju nazad na kontrolne nivoe. Isti obrazac je detektovan za CXCL 1 i 16. Međutim, za CXCL12, nije otkrivena regulacija u HSD (Slika 3A).
Za porodicu CCL, CCL 2, 4, 12, 17, 19 i CX3CL1 nisu pokazali povećanje regulacije u HSD. CCL3 je povećan u HSD, ali nije otkrivena značajna promjena sa dodatkom melatonina u ishranu. Za CCL7, značajno povećanje u HSD-u i značajno smanjenje regulacije uz dodatakmelatoninna HSD je otkriven (slika 3B).
Slika 3. Upregulation ofbubregahemokiniu HSD sa i bez melatonina. Ekspresija porodice hemokina (CXC motiv) liganda (CXCL) (A), hemokinske (CC motiv) porodice liganda i CX3CL1 (B) je određena kod pacova. (n=7–8) *-p Manje ili jednako 0.05 u odnosu na kontrolu. #-p Manje ili jednako 0,05 u odnosu na sol plus melatonaciju. HSD—dijeta sa visokim sadržajem soli.
3.4. Direktan efekat melatonina na RMC mezangijalnu ćelijsku liniju
Zatim smo se fokusirali na CXCL9, 10 i 11 koji privlače T ćelije vezivanjem za receptor CXCR3. Odredili smo njihov izrazhemokiniu RMC ćelijama koje su mezangijalna ćelijska linija štakora.
Tretirali smo ćelije sa 80 mM NaCl bez i sa 0,5 mMmelatonin. Ova koncentracija NaCl značajno je povećala ekspresiju CXCR10 za 2,4 ± 0.26- puta u poređenju sa kontrolom, a dodatak 0,5 mM melatonina značajno je smanjen ovaj izraz na 1,4 ± 0.{{10}} puta u poređenju sa kontrolom (Slika 4A). Za CXCL11, 80 mM NaCl značajno je povećao ekspresiju za 3 ± 0.48-puta u poređenju sa kontrolom, a dodatak 0,5 mM melatonina je značajno smanjio ovu ekspresiju na 1,8 ± 0.{22 }} puta u odnosu na kontrolu (slika 4B). CXCL9 nije otkriven u RMC ćelijama.
Slika 4. Sol je povećala ekspresiju CXCL10 i CXCL11 u mezangijalnoj ćelijskoj liniji gdje je liječenje melatonom smanjilo njegovu ekspresiju. RMC (mezangijalna ćelijska linija pacova) tretirana je soli 80 mM sa i bez 0,5 mM melatonina. CXCL10 (A) i CXCL11 (B) su povećane obradom soli i dodatkommelatoninsmanjiti ovu regulaciju naviše. Grafikoni predstavljaju 6 nezavisnih ispitivanja. *-p Manje ili jednako 0.001 u odnosu na kontrolu #-p Manje ili jednako 0.005 naspram soli 80 mM i melatonin 0,5 mM. $-p Manje ili jednako 0,05 naspram soli 80 mM i melatonina 0,5 mM.
4. Diskusija
Blagotvorno dejstvo odmelatoninna HTN je pokazano u prethodnim studijama i predloženo je kao mogući način djelovanja za HTN rezistentan na liječenje [18]. U našoj prvoj studiji, fokusirali smo se na oksidativni stres i otkrili da melatonin smanjuje oksidativni stres izazvan HSD. U ovoj studiji fokusirali smo se na adaptivni imunološki učinak i pokazali da melatonin poboljšava preživljavanje pacova hranjenih HSD-om. Ovaj efekat je povezan sa smanjenjem infiltriranja T ćelija u bubreg i smanjenjem regulacijebubregekspresija hemokina.
Istorijski podaci pokazuju da DSS štakori koji konzumiraju HSD razvijaju tešku HTN i pokazuju veću stopu mortaliteta [19]. Sam Dahl je prilikom uspostavljanja modela izvijestio da kada su DSS pacovi stavljeni na HSD (8 posto NaCl) pri odbijanju (21-23 dana starosti), oni su brzo razvili HTN i svi su umrli do 16. sedmice hranjenja soli [20]. Kasnije, nakon nekih modifikacija soja, Rapp i sar. izvijestili su da su svi pacovi bili mrtvi unutar osam sedmica nakon HSD-a (8 posto NaCl) [21]. Pacovi u našoj studiji imali su visoku stopu mortaliteta, ali nisu dostigli 100 posto, vjerovatno zbog nižeg procenta (4 posto) soli u njihovoj ishrani. Ipak, očigledno je damelatoninsuplementacija je značajno spriječila smrtnost pacova.
Dobivanje na težini je marker dobrobiti pacova u dobi od 4 do 13 sedmica. DSS pacovi potiču od Sprague Dawleya, koji je dobro okarakterisan soj. U dobi pacova koju smo koristili u našim eksperimentima, pacovi bi trebali stalno dobivati na težini [22]. U mnogim studijama na životinjama, smanjenje težine se smatra jednom od "krajnjih tačaka" eksperimenata [23]. Iz nekoliko studija, jasno je da HSD kod DSS štakora rezultira nižim stopama prirasta u poređenju sa kontrolama [24,25]. U skladu s ovim studijama, također smo uočili razlike u težini između grupa. Ovdje se pacovi nisu ugojili nakon četiri sedmice HSD-a. Melatonin je zaustavio i ovaj efekat HSD-a, jer su pacovi koji su bili tretirani melatoninom nastavili da dobijaju na težini, iako manje od kontrolne grupe.
Sposobnostmelatoninsmanjenje krvnog pritiska na životinjskim modelima otkriveno je kasnih sedamdesetih godina 20. stoljeća [26–28]. Od tada je zabilježeno u nekoliko drugih modela, kao što je da dijeta s visokim udjelom fruktoze izaziva metabolički sindrom kod spontano hipertenzivnih pacova [29,30]. Naše studije u ovoj oblasti su prve koje pokazuju da melatonin igra ulogu u HTN izazvanom solju tako što sprečava oštećenje organa i smanjuje smrtnost.
U ovoj studiji smo pokazali da HSD inducira infiltraciju T limfocita ububreg, proces koji je opisan kod DSS štakora uglavnom od strane Mattsonove grupe [31–33]. Ključna uloga ovog procesa infiltracije u DSS modelu je demonstrirana u arecentnim studijama koje su uočile da su DSS štakori s nedostatkom T-ćelija zaštićeni od HTN izazvan HSD i prijenosom splenocita pogoršava HTN osjetljiv na sol [34].
Melatonin može uticati na T ćelije u različitim aspektima (za pregled, vidi [35]). Ova studija je to prvi put pokazalamelatoninsmanjuje privlačnost i CD4 plus i CD8 plus T ćelija zabubregu HSD. Ovaj efekat melatonina može biti mehanizam koji naglašava njegovo blagotvorno dejstvo u ovom modelu.
Sposobnost melatonina da smanji infiltraciju T stanica opisana je u eksperimentalnom modelu miševa autoimunog encefalomijelitisa (EAE). U EAE je pokazano da melatonin smanjuje infiltraciju CD4 plus T ćelija i Th17 ćelija u CNS [36,37].
Privlačenje T ćelija prema specifičnom tkivu uglavnom je regulirano lokalnim visokim koncentracijamahemokinikoji su kemotaktički citokini koji kontroliraju migratorne obrasce i položaj imunih stanica. Dvije velike porodice hemokina koje indukuju infiltraciju T ćelija su porodice hemokina CXC motiv ligand (CXCL) i CC motiv ligand (CCL) [38].
Cistanche za poboljšanje disfunkcije bubrega
U našoj studiji nismo pronašli konstantan obrazac u odgovoru porodice CCL na HSD i namelatonin. Od devethemokiniu ovoj porodici primećeno je da samo CCL7 i CLL21 povećavaju svoju ekspresiju zbog HSD-a, a suplementacija melatoninom je smanjuje. HSD je povećao ekspresiju CCL3, ali nije otkriveno smanjenje kod štakora tretiranih melatoninom. Nedavna studija na istom modelu pokazala je da HSD povećava CCL2 u unutrašnjostibubregkorištenjem RNA-Seq metode [39]. Međutim, ova studija je testirala nivoe 3. i 21. dana nakon početka dijete. U našoj studiji, testirali smo nivoe nakon osam sedmica. Moguće je da se ekspresija hemokina promeni tokom HSD perioda.
Suprotno tome, nivoi većine CXCL porodice, uključujući CXCL 1, 9, 10, 11 i 16, povećani su kod pacova tretiranih HSD imelatoninsuplementacija je ukinula ovaj porast. Samo CXCL12 nije pokazao povećanje odgovora na HSD.
CXCL9, CXCL10 i CXCL11, nazvani "ligandi CXC hemokinskog receptora 3 koji induciraju interferon", inducirani su IFN-om i ligandi su CXC hemokinskog receptora 3 (CXCR3). In vivo studije su pokazale njihov značaj u aktivaciji i regrutaciji T limfocita u ciljni organ [40–42]. Youn et al. pokazao je, kod pacijenata sa hipertenzijom, i bubrežnu infiltraciju T ćelija i povišene razine u cirkulaciji sva tri CXCR3hemokini, što sugerira da su CXCR3 i njegovi ligandi relevantni za T ćelije uključene u humani HTN [43]. Druga studija je pokazala da je CXCL10 povišen kod hipertenzivnih pacijenata, a njegovi nivoi su u korelaciji sa njihovim vrednostima krvnog pritiska [44].
Zbog ovih studija fokusirali smo se na CXCL9, CXCL10 i CXCL11. Uzgajali smo mezangijalnu ćelijsku liniju štakora i tretirali ih sa 80 mM NaCl i 0,5 mM melatonina. Otkrili smo da su CXCL 10 i 11 pojačano regulirani u stanicama i melatonin ukida ovo povišenje. Naši rezultati pokazuju da je efekat soli na podizanje CXCL 10 i 11 i suprotan efekatmelatonin, oba su direktno otkrivena u mezangijalnim ćelijama. Nasuprot tome, CXCL9 nije otkriven u ovim ćelijama.
Naša studija ima ograničenja. U našim FACS rezultatima, mnogi od CD3 plus su bili dvostruko negativni i za CD4 i za CD8. Isti rezultati su uočeni u Mattsonovoj studiji iz 2010. godine [31]. Međutim, u novijim studijama Mattsonove grupe, CD3 plus CD4-CD8-ćelija je bilo vrlo malo [32,33,45,46]. Značajno smanjenje dvostruko negativnih CD3 ćelija moglo bi biti rezultat dodavanja CD45 markera i samo analize ćelija koje su bile CD45 pozitivne, što je i sprovedeno u kasnijim Mattsonovim studijama. Moguće je da je velika populacija CD3 plus CD4-CD8- artefakt. Međutim, nije poznat nijedan artefakt za populaciju ćelija CD3 plus CD4 plus i CD3 plus CD8 plus.
5. Zaključci
U zaključku, dijeta s visokim udjelom soli povezana je s infiltracijom T stanica ububreziDSS pacova. Sol je takođe povećala ekspresiju specifičnih kemoatraktanata T ćelija u bubrezima. Tretman samelatonin(30 mg/kg/dan) ukinuo je ove efekte (melatoninsmanjuje HSD-indukovanu infiltraciju T ćelija u bubrege zajedno sa smanjenjem ekspresije hemokina liganda CXCL3).
Naša in vitro studija pokazuje da sol i melatonin mogu regulirati ekspresiju kemoatraktanta direktnim djelovanjembubregćelije.
Doprinosi autora: Konceptualizacija, AL; formalna analiza, AB i RK; istraživanje, RK;metodologija, AB i AL; pisanje—originalni nacrt, AB i AL; pisanje—recenzija i uređivanje, YSand EG Svi autori su pročitali i složili se sa objavljenom verzijom rukopisa.
Finansiranje: Ovo istraživanje nije dobilo vanjsko finansiranje.
Izjava institucionalnog odbora za reviziju: Protokol studije je odobrio institucionalni komitet za životinjsku etiku u medicinskom centru Sheba, protokol br. 1219/19/ANIM i protokol Ministarstva zdravlja br. 16418.
Izjava o informiranom pristanku: Nije primjenjivo.
Izjava o dostupnosti podataka: Podaci predstavljeni u ovoj studiji dostupni su na zahtjev autora koji odgovaraju.
Priznanja: Autori zahvaljuju Zehavi Shabtai na odličnoj tehničkoj podršci i Michaelu Kanovskyju za njegove uredničke usluge.
Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.
Reference
1. Olsen, MH; Angell, SY; Asma, S.; Boutouyrie, P.; Burger, D.; Chirinos, JA; Damasceno, A.; Delles, C.; Gimenez-Roqueplo, AP; Hering, D.; et al. Poziv na akciju i strategija životnog toka za rješavanje globalnog tereta povišenog krvnog tlaka za sadašnje i buduće generacije: Lancet komisija za hipertenziju. Lancet 2016, 388, 2665–2712. [CrossRef]
2. O'Brien, E. Lancet komisija za hipertenziju: Rješavanje globalnog tereta povišenog krvnog pritiska na sadašnje i buduće generacije. J. Clin. Hypertens 2017, 19, 564–568. [CrossRef]
3. O'Donnell, M.; Mente, A.; Yusuf, S. Unos natrijuma i kardiovaskularno zdravlje. Circ. Res. 2015, 116, 1046–1057. [CrossRef]
4. Schiffrin, EL Mehanizmi remodeliranja malih arterija, antihipertenzivna terapija i imuni sistem kod hipertenzije.Klin. Investig. Med. 2015, 38, E394–E402. [CrossRef]
5. Guzik, TJ; Hoch, NE; Brown, KA; McCann, LA; Rahman, A.; Dikalov, S.; Goronzy, J.; Weyand, C.; Harrison, DG Uloga T-ćelije u nastanku hipertenzije izazvane angiotenzinom II i vaskularne disfunkcije. J. Exp. Med. 2007, 204, 2449–2460. [CrossRef][PubMed]
6. Kleinewietfeld, M.; Manzel, A.; Titze, J.; Kvakan, H.; Yosef, N.; Linker, RA; Muller, DN; Hafler, DA Natrijum hlorid pokreće autoimunu bolest indukcijom patogenih ćelija TH17. Nature 2013, 496, 518–522. [CrossRef]
7. Mattson, DL; Lund, H.; Guo, C.; Rudemiller, N.; Geurts, AM; Jacob, H. Genetska mutacija gena 1 koji aktivira rekombinaciju kod Dahl pacova osjetljivih na sol smanjuje hipertenziju i oštećenje bubrega. Am. J. Physiol. Regular. Integer. Comp. Physiol. 2013, 304, 407–414.[CrossRef]
8. Mattson, DL Infiltriranje imunih ćelija ububregkod hipertenzije osjetljive na sol i oštećenja bubrega. Am. J. Physiol. Ren. Physiol.2014, 307. [CrossRef] [PubMed]
9. Lu, X.; Crowley, SD Upala kod hipertenzije osjetljive na sol i oštećenja bubrega. Curr. Hypertens Rep. 2018, 20. [CrossRef][PubMed]
10. Baker, J.; Kempinski, K. Ulogamelatoninu regulaciji krvnog pritiska: pomoćni antihipertenzivni agens. Clin. Exp. Pharm.Physiol. 2018, 45, 755–766. [CrossRef] [PubMed]
11. Grossman, E.; Laudon, M.; Zisapel, N. Efekat melatonina na noćni krvni pritisak: Meta-analiza randomizovanih kontrolisanih studija. Vasc. Upravljanje zdravstvenim rizikom. 2011, 7, 577–584. [CrossRef] [PubMed]
12. Pozo, D.; Delgado, M.; Fernandez-Santos, JM; Calvo, JR; Gomariz, RP; Martin-Lacave, I.; Ortiz, GG; Guerrero, JM Ekspresija mRNA receptora Mel1a-melatonina u T i B podskupovima limfocita iz timusa i slezene pacova. Faseb J. Off. Publ. Fed.Am. Soc. Exp. Biol. 1997, 11, 466–473. [CrossRef]
13. Guerrero, JM; Pozo, D.; García-Mauriño, S.; Osuna, C.; Molinero, P.; Calvo, JR Učešće nuklearnih receptora u pojačanoj proizvodnji IL-2 melatoninom u Jurkat ćelijama. Ann. NY Acad. Sci. 2000, 917, 397–403. [CrossRef] [PubMed]
14. Farez, MF; Mascanfroni, ID; Méndez-Huergo, SP; Yeste, A.; Murugaiyan, G.; Garo, LP; Balbuena Aguirre, ME; Patel, B.; Ysraelit, MC; Zhu, C.; et al.MelatoninDoprinosi sezonalnosti recidiva multiple skleroze. Cell 2015, 162, 1338–1352.[CrossRef] [PubMed]
15. Kirabo, A.; Fontana, V.; de Faria, APC; Loperena, R.; Galindo, CL; Wu, J.; Bikineyeva, AT; Dikalov, S.; Xiao, L.; Chen, W.; et al. DC izoketalno modificirani proteini aktiviraju T stanice i potiču hipertenziju. J. Clin. Investig. 2014, 124, 4642–4656. [CrossRef][PubMed]
16. Leibowitz, A.; Volkov, A.; Voloshin, K.; Shemesh, C.; Barshack, I.; Grossman, E. Melatonin sprječavabubregozljeda u modelu hipertenzije izazvane visokom ishranom soli smanjenjem oksidativnog stresa. J. Pineal Res. 2016, 60, 48–54. [CrossRef] [PubMed]
17. Hawkins, P.; Morton, DB; Burman, O.; Dennison, N.; Honess, P.; Jennings, M.; Lane, S.; Middleton, V.; Roughan, JV; Wells, S.; et al. Vodič za definisanje i implementaciju protokola za procjenu dobrobiti laboratorijskih životinja: Jedanaesti izvještaj Zajedničke radne grupe za usavršavanje BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW. Lab. Anim. 2011, 45, 1–13. [CrossRef]
18. Simko, F.; Reiter, RJ; Paulis, L.Melatoninkao racionalna alternativa u konzervativnom liječenju rezistentne hipertenzije.Hypertens Res. 2019, 42, 1828–1831. [CrossRef] [PubMed]
19. Rapp, JP Dahl štakori osjetljivi na sol i otporni na sol. Hypertension 1982, 4, 753–763. [CrossRef]
20. Dahl, LK; Knudsen, KD; Heine, MA; Leitl, GJ Efekti hroničnog prekomjernog unosa soli. Modifikacija eksperimentalne hipertenzije kod pacova varijacijama u ishrani. Circ. Res. 1968, 22, 11–18. [CrossRef] [PubMed]
21. Rapp, JP; Dene, H. Razvoj i karakteristike inbred sojeva Dahl pacova osjetljivih na sol i rezistentnih na sol. Hypertens 1985, 7, 340–349. [CrossRef]
22. Brower, M.; Grace, M.; Kotz, CM; Koya, V. Komparativna analiza karakteristika rasta Sprague Dawley pacova dobijenih iz različitih izvora. Lab. Anim Res. 2015, 31, 166–173. [CrossRef]
23. Talbot, SR; Biernat, S.; Bleich, A.; van Dijk, RM; Ernst, L.; Häger, C.; Hilgers, SOA; Koegel, B.; Koska, I.; Kuhla, A.; et al. Definisanje smanjenja telesne težine kao humane krajnje tačke: kritička procena. Lab. Anim 2020, 54, 99–110. [CrossRef] [PubMed]
24. Geschka, S.; Kretschmer, A.; Šarkovska, Y.; Evgenov, OV; Lawrenz, B.; Hucke, A.; Hocher, B.; Stasch, J.-P. Stimulacija rastvorljivom gvanilatciklazom sprječava remodeliranje fibroznog tkiva i poboljšava preživljavanje Dahl pacova osjetljivih na sol. PLOS ONE 2011, 6,e21853. [CrossRef] [PubMed]
25. Wang, Y.; Mu, JJ; Liu, FQ; Ren, KY; Xiao, HY; Yang, Z.; Yuan, ZY Prelaz od epitela do mezenhima izazvan soli kod pacova osjetljivih na Dahlsalt ovisi o povišenom krvnom tlaku. Braz. J. Med. Biol. Res. Rev. Bras. Pesquisa Med. E Biol. 2014, 47, 223–230.[CrossRef]
26. Holmes, SW; Sugden, D. Proceedings: Efekat melatonina na hipertenziju izazvanu pinealektomijom kod pacova. Br. J. Pharm. 1976, 56, 360P–361P.
27. Zanoboni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W. Eksperimentalna hipertenzija kod pinealektomiranih pacova. Life Sci. 1967, 6, 2327–2331. [CrossRef]
28. Zanoboni, A.; Forni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W.; Zanussi, C. Efekat pinealektomije na arterijski krvni pritisak i unos hrane i vode kod pacova. J. Endocrinol. Investig. 1978, 1, 125–130. [CrossRef] [PubMed]
30. Pechánová, O.; Zicha, J.; Paulis, L.; Zenebe, W.; Dobesová, Z.; Kojsová, S.; Jendeková, L.; Sládková, M.; Dovinová, I.; Simko, F. i dr. Učinak N-acetilcisteina i melatonina kod odraslih spontano hipertenzivnih pacova s utvrđenom hipertenzijom. EUR. J.Pharmcol. 2007, 561, 129–136. [CrossRef] [PubMed]
30. Leibowitz, A.; Peleg, E.; Sharabi, Y.; Shabtai, Z.; Shamiss, A.; Grossman, E. Ulogamelatoninu patogenezi hipertenzije kod štakora sa metaboličkim sindromom. Am. J. Hypertens 2008, 21. [CrossRef] [PubMed]
31. De Miguel, C.; Das, S.; Lund, H.; Mattson, DL T limfociti posreduju u hipertenziji ibubregoštećenja kod Dahl-ovih osjetljivih na sol. Am. J. Physiol. Regular. Integer. Comp. Physiol. 2010, 298, R1136–R1142. [CrossRef] [PubMed]
32. Evans, LC; Petrova, G.; Kurth, T.; Yang, C.; Bukowy, JD; Mattson, DL; Cowley, AW Povećan perfuzijski pritisak pokreće bubrežnu T-ćelijsku infiltraciju kod Dahl pacova osjetljivih na sol. Hipertenzija 2017, 70, 543–551. [CrossRef]
33. Abais-Battad, JM; Alsheikh, AJ; Pan, X.; Fehrenbach, DJ; Dasinger, JH; Lund, H.; Roberts, ML; Kriegel, AJ; Cowley, AWJ; Kidambi, S.; et al. Dijetetski efekti na Dahl hipertenziju osjetljivu na sol, oštećenje bubrega i transkriptom T limfocita.Hypertens 2019, 74, 854–863. [CrossRef] [PubMed]
34. Fehrenbach, DJ; Dasinger, JH; Lund, H.; Zmaj, J.; Mattson, DL Transfer splenocita pogoršava hipertenziju osjetljivu na sol kod pacova. Exp. Physiol. 2020, 105, 864–875. [CrossRef] [PubMed]
35. Ren, W.; Liu, G.; Chen, S.; Yin, J.; Wang, J.; Tan, B.; Wu, G.; Bazer, FW; Peng, Y.; Li, T.; et al. Signalizacija melatonina u T ćelijama: funkcije i primjene. J. Pineal Res. 2017, 62. [CrossRef]
36. Álvarez-Sánchez, N.; Cruz-Chamorro, I.; López-González, A.; Utrilla, JC; Fernández-Santos, JM; Martínez-López, A.; Lardone,PJ; Guerrero, JM; Carrillo-Vico, A. Melatonin kontrolira eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis mijenjajući T efektor/regulatornu ravnotežu. Brain Behav. Immun. 2015, 50, 101–114. [CrossRef]
37. Chen, S.-J.; Huang, S.-H.; Chen, J.-W.; Wang, K.-C.; Yang, Y.-R.; Liu, P.-F.; Lin, G.-J.; Sytwu, H.-K.Melatoninpojačava ekspresiju interleukina 10 i potiskuje hemotaksiju kako bi inhibirao upalu in situ i smanjio težinu eksperimentalnog autoimuneencefalomijelitisa. Int. Immunopharmacol. 2016, 31, 169–177. [CrossRef] [PubMed]
38. Griffith, JW; Sokol, CL; Luster, ADHemokinii hemokinski receptori: pozicioniranje ćelija za odbranu i imunitet domaćina. Annu. Rev. Immunol. 2014, 32, 659–702. [CrossRef] [PubMed]
39. Alsheikh, AJ; Dasinger, JH; Abais-Battad, JM; Fehrenbach, DJ; Yang, C.; Cowley, AWJ; Mattson, DL CCL2 posreduje u ranoj infiltraciji bubrežnih leukocita tokom hipertenzije osjetljive na sol. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2020, 318, F982–F993. [CrossRef][PubMed]
40. Liu, L.; Callahan, MK; Huang, D.; Ransohoff, RM Chemokine receptor CXCR3: Neočekivana enigma. Curr. Top. Dev. Biol.2005, 68, 149–181. [CrossRef] [PubMed]
41. Groom, JR; Luster, AD CXCR3 ligandi: redundantne, kolaborativne i antagonističke funkcije. Immunol. Cell Biol. 2011, 89,207–215. [CrossRef] [PubMed]
42. Van Raemdonck, K.; Van den Steen, PE; Liekens, S.; Van Damme, J.; Struyf, S. CXCR3 ligandi u bolesti i terapiji. Cytokine Growth Factor Rev. 2015, 26, 311–327. [CrossRef] [PubMed]
43. Youn, J.-C.; Yu, HT; Lim, BJ; Koh, MJ; Lee, J.; Chang, D.-Y.; Choi, YS; Lee, S.-H.; Kang, S.-M.; Jang, Y.; et al. Imunonescentni CD8 plus T ćelije i CXC hemokinski receptor tipa 3hemokinisu povećane kod hipertenzije kod ljudi. Hypertens 2013, 62, 126–133.[CrossRef] [PubMed]
44. Stumpf, C.; Auer, C.; Yilmaz, A.; Lewczuk, P.; Klinghammer, L.; Schneider, M.; Daniel, WG; Schmieder, RE; Garlichs, CDSerum Nivoi Th1 hemoatraktanta interferon-gama-inducibilnog proteina (IP) 10 su povišeni kod pacijenata sa esencijalnom hipertenzijom. Hypertens Res. 2011, 34, 484–488. [CrossRef] [PubMed]
45. Rudemiller, NP; Lund, H.; Priestley, JRC; Endres, BT; Prokop, JW; Jacob, HJ; Geurts, AM; Cohen, EP; Mattson, DL Mutacija SH2B3 (LNK), kandidata za studiju o hipertenziji u cijelom genomu, ublažava hipertenziju osjetljivu na Dahl preko inflamatorne modulacije. Hypertens 2015, 65, 1111–1117. [CrossRef] [PubMed]
46. Wade, B.; Petrova, G.; Mattson, DL Uloga imunoloških faktora u hipertenziji izazvanoj angiotenzinom II i oštećenju bubrega kod pacova osjetljivih na Dahlsalt. Am. J. Physiol. Regular. Integer. Comp. Physiol. 2018, 314, R323–R333. [CrossRef] [PubMed]
