Mehanizmi aktivacije melanocita i racionalni terapijski tretmani solarnih lentiga

sažetak:Da bi se okarakterisala patobiologija solarnog lentigosa (SL), analize semikvantitativnim RT-PCR, Western blottingom i imunohistohemijom otkrile su povećanu ekspresiju endotelina (EDN)-1/endotelin B receptora (EDNBRs), faktora matičnih ćelija (SCF). )/c-KIT, i faktor nekroze tumora (TNF) u epidermisu lezije, što je u suprotnosti sa smanjenom ekspresijom interleukina (IL) 1 . Ovi nalazi snažno podržavaju hipotezu da prethodna ponovljena izloženost UVB-u pokreće keratinocite da kontinuirano proizvode TNF. TNF zatim stimulira lučenje EDN-a i proizvodnju SCF-a na autokrini način, što dovodi do kontinuirane melanogene aktivacije susjednih melanocita, što uzrokuje SL-ove. Klinička studija na 36 pacijenata sa SL-om tokom šest mjeseci liječenih ekstraktom M. Chamomilla sa snažnom sposobnošću da poništi povećanje sinteze DNK i melanizacije ljudskih melanocita u kulturi izazvano EDN1-, pokazalo je značajno poboljšanje rezultata pigmentacije i razlike u boji izražene kao L vrijednosti. Druga klinička studija koja koristi atirozinazainhibitor L-askorbat-2-fosfat 3 Na (ASP) pokazao je da su L vrijednosti testirane kože tretirane losionom (6 posto APS) značajno porasle u SL-ima iu koži bez lezija sa značajno višom vrijednošću ∆L u SL-ima kada u poređenju sa kožom bez lezija. Zbir ovih nalaza snažno sugerira da je kombinirano lokalno liječenje blokatorima EDN signala itirozinazainhibitori su poželjan terapijski izbor za SL.

Ključne riječi: solarni lentigo; endotelin; faktor matičnih ćelija; faktor rasta keratinocita; interleukin-1; faktor nekroze tumora; intracelularna signalizacija; mobilizacija kalcija; blokator signalizacije; M. chamomilla; askorbat-fosfat Na; sredstvo za izbjeljivanje; inhibitor tirozinaze

Cistanche je inhibitor tirozinaze.

Click to cistanche efekte za inhibiciju tirozinaze

1. Uvod

Najčešći epidermalni hiperpigmentarni poremećaj u azijskoj koži je solarni lentigos (SL), koji se uglavnom javlja na licu i na donjem dijelu šaka. Za razliku od UVB-indukovane hiperpigmentacije (UVB melanoza), koja, ovisno o dobi ispitanika, nestaje u roku od dvije sedmice do nekoliko mjeseci nakon prestanka izlaganja UVB-u, SL se razvijaju na koži izloženoj suncu, posebno na licu i nikada ne nestanu zbog mogućeg oštećenja DNK u keratinocitima izazvanog ponovljenim UVB zračenjem epiderme lezije. Općenito, hiperpigmentarni poremećaji su općenito ciljani agensima protiv pigmentacije i uključuju UVB-melanozu, SL i melazmu. Na osnovu učestalosti konačne dijagnoze za pacijente s različitim pigmentnim poremećajima u Japanu, SL ima najveću incidenciju, javlja se u približno 60 posto svih pacijenata s hiperpigmentarnim poremećajima, dok se melazma i postinflamatorna hiperpigmentacija (uključujući UVB-melanozu) javljaju u čak 5,2 posto i 3,3 posto pacijenata, respektivno [1]. Ovo sugerira da su SL-ovi dominantna meta agenasa protiv pigmentacije za azijsku kožu. Međutim, bilo je nekoliko objavljenih radova o kliničkim efektima sredstava protiv pigmentacije na SL-ove jer mnoga sredstva protiv pigmentacije služe kaotirozinazainhibitori i nije predviđeno datirozinazainhibicija bi bila dovoljna da ublaži hiperpigmentaciju SL-a. Pored toga, čini se da je teško racionalno osmisliti efikasan terapijski lokalni tretman za SL-ove jer se malo zna o mehanizmima aktivacije melanocita u epidermisu lezije. U ovom preglednom članku karakteriziramo patobiologiju SL prema topikalnom liječenju SL, jer se malo zna o mehanizmima aktivacije melanocita u epidermisu lezije. U ovom preglednom članku karakteriziramo patobiologiju SL-a prema poznatim melanogenim mrežama parakrinih citokina, a na osnovu otkrivenih mehanizama aktivacije melanocita u lezijskoj epidermi SL-a, uvodimo racionalne kliničke pristupe lokalnom liječenju SL-a za ublažavanje hiperpigmentacije. nivo.

2. Kliničke karakteristike

SL-ovi se klinički razvijaju kao plosnate, dobro ograničene mrlje na koži različitih boja i veličina, koje se često pojavljuju na licu i na leđnom dijelu šaka (Slika 1a) [2]. Histohemija SL lezija obojenih hemoksilinom i eozinom otkrila je blagu akantozu i pigmentaciju duž sloja bazalnih ćelija (slika 1b) [2]. Postoje dva uzorka u pogledu histopatoloških karakteristika SL-a na licu: jedan uzorak je pokazao spljoštenu epidermu sa bazalnom melanozom, a drugi uzorak je pokazao epidermalnu hiperplaziju sa izduženim reterijem sastavljenim od duboko pigmentiranih bazaloidnih ćelija [3].

3. Mehanizmi aktivacije melanocita u solarnom lentigu na osnovu melanogene parakrine citokinske mreže

3.1. Broj melanocita i ekspresija tirozinaze

Iako su postojali neki argumenti o povećanom broju melanocita u SL-ovima, imunohistohemijska analiza upotrebom markera specifičnog za melanocite MART-1 otkrila je povećan broj melanocita u solarnom lentigu [5–7]. Međutim, stvarna gustina melanocita duž granice između dermisa i epidermisa u SL je slična onoj u perilezijskoj kontrolnoj koži zbog povećane proliferacije keratinocita [7]. Imunohistohemija upotrebom anti-tirozinazaotkrio totirozinaza-pozitivni melanociti su značajno povećani 2-putu u lezijskoj epidermi SL-a [4]. Analiza gena semikvantitativnom RT-PCR otkrila je da je nivo ekspresije mRNA tirozinaze značajno povećan za 23-puta u epidermisu lezije [4]. Gore navedeni nalazi podržavaju mogućnost da postoji stimulacija i proliferacije i melanizacije u SL lezijskim melanocitima. Stoga smo pretpostavili da blago proliferirajući keratinociti u SL-ima pokreću aktivaciju susjednih melanocita lučenjem citokina koji stimuliraju melanocite.

3.2. Melanogene mreže parakrinih citokina

Mi i druge grupe smo razjasnili da postoji nekoliko važnih melanogenih parakrinih citokinskih mreža između ćelija kože (slika 2). Uglavnom, ovo uključuje endotelin (EDN)-1 [8–15], faktor matičnih ćelija vezanih na membranu (mSCF) [16], proopiomelanokortin (POMC) [17–20], prostaglandin E2 [21], granulocitni makrofag faktor stimulacije kolonije (GM-CSF) [22], osnovni faktor rasta fibroblasta [23], onkogen vezan za rast [24] i faktor rasta keratinocita (KGF) [25,26] koji su uključeni u interakcije keratinocita/melanocita i rastvorljivi SCF [27 ], faktor rasta hepatocita (HGF) [8,10,27–29] i KGF [30] uključeni u interakcije fibroblasta/melanocita. Na osnovu razjašnjenih melanogenih parakrinocitokinskih mreža uključujući njihove odgovarajuće receptore, važno je odrediti koje su melanogene mreže parakrinih citokina uključene i specifično aktivirane in vivo u mehanizmima hiperpigmentacije u lezijskoj epidermi SL-a.

3.3. Glavni parakrini citokini i receptori odgovorni za aktivaciju melanocita u SL

Među gore navedenim melanogenim citokinima i njihovim odgovarajućim receptorima, prvo smo odredili ulogu osnovnog faktora rasta fibroblasta (bFGF) i onkogena povezanog sa rastom (GRO) u epidermisu SL. Utvrđeno je da je osnovni FGF prekomjerno eksprimiran u ljudskim keratinocitima izloženim UVB-u, čiji su homogenati imali izraziti potencijal da stimuliraju melanogenezu i proliferaciju ljudskih melanocita u kulturi, iako su kofaktori sa sposobnošću povećanja nivoa cikličkog AMP u suštini potrebni za melanogenu stimulaciju [23]. ]. Naša istraživačka grupa je identificirala GRO kao melanogeni citokin koji igra bitnu ulogu u hiperpigmentaciji izazvanoj fenilazo-naftolom nakon alergijske reakcije na smeđe žutoj koži zamorca [24,31]. Semikvantitativni RT-PCR je otkrio da nije bilo promjene u nivoima ekspresije gena bFGF i GRO u epidermisu SL lezije u poređenju sa epidermom bez lezija [2]. U skladu sa nivoom ekspresije mRNA za bFGF i GRO, imunohistohemija je otkrila da nema razlike u intenzitetu imunološkog bojenja sa anti-bFGF (Slika 1c,d) i anti-GRO (Slika 1e,f) između SL lezije i nelezije epidermis [2]. Ovi nalazi su pokazali da nema uključenosti bFGF ili GRO kao intrinzičnih melanogenih citokina za mehanizam aktivacije melanocita u SL.

U biološkom mehanizmu hiperpigmentacije izazvane UVB-om, ekspresija EDN1, vazokonstriktorskog peptida koji je izvorno izolovan iz endotelnih ćelija svinja [32], i mSCF [16] se pojačava na autokrini način djelovanjem oslobađanja interleukina stimuliranog UVB-om ( IL)-1 putem stvaranja reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) [15]. Ti citokini uzrokuju da susjedni melanociti povećaju ekspresiju kritičnih enzima za sintezu melanina tirozinaze [14,33], EDNBR [34] i matriksnog proteina melanosoma PMEL17 [34], kao i enzima povezanih s proliferacijom, kao što je ciklična CDK zavisna kinaza2 [34], što dovodi do hiperpigmentacije na koži izloženoj UVB zračenju. Na osnovu glavnih melanogenih citokina koji su suštinski uključeni u UVB-melanozu, zatim smo odredili ulogu EDN1 u mehanizmu aktivacije melanocita u epidermu SL-a. Karakterizacija nivoa ekspresije mRNA EDN1 u epidermisu semikvantitativnom RT-PCR analizom pokazala je da je došlo do značajnog povećanja ekspresije u prosjeku 3.2-puta u epidermisu SL lezije u poređenju sa epidermom bez lezija [4]. U skladu sa povećanim nivoom ekspresije gena EDN1, došlo je do pojačanog imunobojenja sa anti-EDN1 kroz epidermu SL lezije (Slika 1g,h) [4].

Pored EDN1, zatim smo utvrdili ulogu EDN receptora u mehanizmu aktivacije melanocita koji leži u osnovi SL-a. Vezivanje EDN-a za njegov receptor je prvi korak u glavnoj parakrinoj liniji između keratinocita i melanocita koji povećava pigmentaciju kože [11,14,35,36]. EDN receptori su receptori vezani za sedam transmembranskih G-proteina sa dvije izoforme (A i B) koji su u interakciji sa EDN1 i sa svim oblicima EDN-a (EDN1, EDN2 i EDN3), respektivno [37]. Što se tiče inhibitornih efekata antagonista EDN receptora na EDN-stimulisanu proliferaciju ljudskih melanocita u kulturi, značajan inhibitorni efekat se desio samo u prisustvu BQ 788, antagonista anendotelin B receptora (EDNBR), ali ne i BQ123 ili BQ610, endotelina. Antagonist receptora (EDNAR) [9], koji ukazuje da je signalizacija EDN1/EDN receptora posredovana putem EDNBR. Semikvantitativna RT-PCR analiza ekspresije EDNBR mRNA otkrila je da su među različitim tipovima ćelija kože melanociti jedini značajni tip ćelija koji eksprimiraju EDNBR. Pošto smo već pokazali da EDN1 koji luče keratinociti pokreće aktivaciju intracelularne protein kinaze C (PKC) preko EDNBR-a [35], utvrdili smo da li je nivo ekspresije EDNBR-a takođe naglašen u melanocitima u lezijskoj SL epidermi. Semikvantitativna RT-PCR analiza EDNBRmRNA u epidermisu SL-a pokazala je značajno povećanu ekspresiju u prosjeku 68-puta u lezijskoj SL epidermi [4]. U skladu sa povećanom ekspresijom EDNBR mRNA, došlo je do pojačanog imunobojenja sa anti-EDNBR lokalizovanim u melanocitima u lezijskoj SL epidermi (Slika 1i,j) [4]. Zbir ovih nalaza snažno sugerira koordinirano povećanje ekspresije EDN1 i njegove receptorske veze u lezijskoj epidermi SL-a.

Na osnovu glavnih melanogenih citokina uključenih u UVB-melanozu, zatim smo odredili ulogu SCF-a u mehanizmu aktivacije melanocita u lezijskoj SL epidermi. Već smo izvijestili da UVB izlaganje kultiviranih ljudskih keratinocita, kao i ljudske epiderme, značajno stimulira ekspresiju SCF na nivou gena i proteina [15,16]. Semikvantitativna RT-PCR analiza SCF mRNA u epidermisu SL-a pokazala je značajno povećanu ekspresiju u prosjeku 39-puta u lezijskoj SL epidermi u poređenju sa epidermom bez lezija [2]. Western bloting za SCF na koži šest pacijenata sa SL je pokazao da je došlo do značajnog povećanja u prosjeku 1.6- puta u SCF proteinu u lezijskoj SL epidermi u poređenju sa epidermom bez lezija [2].

U skladu sa povećanim nivoom ekspresije gena i proteina SCF-a, došlo je do pojačanog imunološkog bojenja anti-SCF u cijeloj leziji SL epiderme (Slika 1k,l) [2]. Postojao je argument o tome da li je SCF koji je povećan na nivou proteina u lesionalepidermisu topiv ili vezan za membranu. Ako se SCF-topivi propusni kroz bazalnu membranu pojačano reguliraju u epidermisu, mastociti prisutni u dermisu trebaju se aktivirati da proliferiraju i povećaju broj. Budući da bojenje toluidin plavim u SL-ima nije pokazalo nikakvo povećanje broja mastocita u lezijskom SL dermisu [2], vjerovatno je da je tip SCF-a koji je pojačano reguliran u SL-ima tip vezan za membranu.

Pored SCF-a, zatim smo odredili ulogu SCF receptora c-KIT u mehanizmu aktivacije melanocita koji leži u osnovi SL-a. Već smo izvijestili da UVB izlaganje kultiviranih ljudskih melanocita, kao i ljudske epiderme, značajno stimuliše ekspresiju c-KIT na nivou gena i proteina [15,38]. Nadalje, u UVB-stimuliranoj pigmentaciji smeđe žute kože zamorca, blokirajuće antitijelo na c-KIT značajno je poništilo povećani broj dopa pozitivnih melanocita, kao i hiperpigmentaciju u ranoj fazi procesa pigmentacije izazvanog UVB-om [16]. , što snažno ukazuje da vezivanje SCF-a za c-KIT igra važnu ulogu u UVB-induciranoj aktivaciji melanocita, što dovodi do hiperpigmentacije. Uporedo sa povećanom ekspresijom SCF na nivou gena i proteina, nivo ekspresije gena njegovog c-KIT receptora je također povećan u prosjeku 2.14-puta u lezijskoj SL epidermi [2]. U skladu sa povećanom ekspresijom c-KIT mRNK, došlo je do pojačanog imunološkog bojenja sa c-KIT antitelom lokalizovanim u melanocitima u lezijskoj SL epidermi (slika 1m,n) [2]. Ovo sugerira da postoji koordinirano povećanje ekspresije SCF-a i njegovog receptora c-KIT u lezijskoj SL epidermi.

S druge strane, druge grupe su pretpostavile da faktor rasta keratinocita (KGF)/KGF receptor (KGFR) igra važnu ulogu u pokretanju formiranja SL i povećanju pigmentacije samo u epidermi ranijih faza SL [25]. U lezijskoj epidermi [30] i/ili dermisu [25] SL-a, ekspresija KGF-a je pojačana samo na nivou imunološkog bojenja iako su potrebna daljnja istraživanja o ekspresiji njegovih gena i proteina za bilo kakve konačne zaključke o njemu kao o intrinzičnom citokinu koji uzrokuje SLs. Iako je poznato da IL-1 uzrokuje keratinocite da stimulišu proizvodnju KGF-a, ostaje nejasno kako se ekspresija KGF-a povećava u epidermisu lezije gdje je ekspresija IL-1 prilično smanjena [2]. Naravno, treba utvrditi da li TNF (koji je povećan u epidermisu lezije) ima sposobnost da stimuliše proizvodnju KGF-a. Budući da je ekspresija KGF-a u koži prvenstveno ograničena na dermalne fibroblaste, moguće je da je povećana ekspresija KGF-a od strane dermalnih fibroblasta u lezijskom dermisu SL-a [25] povezana i sa povećanom proliferacijom keratinocita i sa stimuliranom melanogenezom. Stoga je vjerovatno da se dermalni fibroblasti uporno aktiviraju UV izlaganjem kako bi se oslobodio KGF, koji djeluje direktno ili indirektno na keratinocite da modulira ekspresiju SCF, doprinoseći hiperpigmentaciji SL [25].

Zatim smo utvrdili biološke mehanizme pomoću kojih se sekrecija EDN1 povećava u epidermisu lezija SL-a. Dobro je poznato da biološki faktori povezani sa stimulacijom lučenja EDN od strane ljudskih keratinocita uključuju IL-1, faktor tumorske nekroze (TNF) i enzim koji konvertuje endotelin (ECE)-1. Naši nalazi o stimulaciji autokrinih citokina povezanih sa UVB melanozom pokazali su da je regulacija IL-1 uglavnom odgovorna za stimulaciju proizvodnje EDN1 i SCF u ljudskim keratinocitima izloženim UVB-u [12,16]. Stoga je otkriveno da su IL-1 i moćni stimulatori sekrecije EDN-a sa odgođenim vrhom u ljudskim keratinocitima u kulturi koji liči na obrazac lučenja EDN-a izazvanog UVB-om [11]. Također je dobro poznato da UVB zračenje značajno stimulira oslobađanje IL-1 ali ne i IL-1 u kultiviranim ljudskim keratinocitima i da blokirajuće antitijelo na IL-1 značajno poništava povećano lučenje EDN1 [11], što ukazuje da je UVB-indukovana hiperpigmentacija posredovana aktivacijom epidermalnih melanocita koja je rezultat povećanog lučenja EDN1 od strane keratinocita izloženih UVB-u. Dodatno, otkriveno je da je ekspresija mSCF proteina značajno stimulirana tretmanom s IL-1 u ljudskim keratinocitima u kulturi [16]. Stoga smo zatim utvrdili da li je IL-1 također povećan da bi stimulirao ekspresiju EDN1 i/ili SCF u lezijskoj epidermi SL-a. Zanimljivo je da je semikvantitativna RT-PCR analiza otkrila da je ekspresija IL-1 mRNA prilično smanjena u epidermisu lezije [16]. U skladu sa tom RT-PCR analizom, imunohistohemija sa IL-1 antitijelom otkrila je slabije imuno-bojenje u epidermisu lezije nego u epidermi bez lezija (Slika 1o,p) [2], što sugerira da IL{ {33}} nije odgovoran za povećanu ekspresiju EDN1 i SCF u lezijskoj epidermi SL-a.

Što se tiče mehanizama koji su u osnovi povećane ekspresije EDN1 u SL-ima, pored IL-1, TNF od 10 ng/mL je izvijestio Tsuboiet al. da bude moćan stimulator (10-} puta) sekrecije EDN od strane kultiviranih ljudskih keratinocita [39]. Što se tiče mehanizma koji leži u osnovi povećane ekspresije SCF u SL-ima, zatim smo ispitali efekte TNF-a na ekspresiju SCF-a u kultivisanim ljudskim keratinocitima. Western blotting korištenjem anti-SCF antitijela je pokazao da TNF značajno stimulira proizvodnju mSCF [15]. Stoga smo zatim utvrdili da li je TNF pojačan ili ne da bi stimulirao ekspresiju EDN1 i/ili SCF u lezijskoj epidermi SL-a. Zanimljivo je da je semikvantitativna RT-PCRanaliza otkrila da je ekspresija TNF mRNA značajno povećana u lezijskoj SL epidermi [2]. U skladu sa RT-PCR analizom, imunohistohemija sa anti-TNF antitijelom otkrila je jače imunobojenje u lezijskoj SL epidermi nego u epidermi bez lezije (Slika 1q,r) [2]. Stoga se moglo zamisliti da je pojačana ekspresija TNF-a uglavnom odgovorna za povećanu ekspresiju EDN1 i SCF u lezijskoj epidermi SL-a.

Što se tiče mehanizma uključenog u povećanu ekspresiju EDN1, zatim smo utvrdili da li je ECE-1 pojačano reguliran u lezijskoj SL epidermi. Kako nijedna studija nije opisala ekspresiju ECE-1 u ljudskim keratinocitima u ovom trenutku, okarakterizirali smo ECE-1 u kultiviranim ljudskim keratinocitima u poređenju sa endotelnim ćelijama. Analiza ECE-1 aktivnosti u različitim tipovima ćelija kože otkrila je da ljudski keratinociti, a ne melanociti, posjeduju ECE-1 aktivnost, koja se javlja u manjoj mjeri nego u endotelnim ćelijama [40]. Western blotting, korištenjem antitijela koja smo pripremili na ECE-1, pokazao je da protein ECE-1 postoji u ljudskim endotelnim ćelijama, ljudskim fibroblastima i ljudskim keratinocitima, ali ne i u ljudskim melanocitima [40]. Testiranje aktivnosti ECE-1 u supernatantima nakon imunoprecipitacije sa ECE{11}} antitijelom pokazalo je da endotelne ćelije i humani keratinociti imaju detektabilne aktivnosti ECE-1 na pH 6,8, što dobro korelira sa ECE{ {15}} imunoprecipitirano sa našim antitelom na ECE-1 [40]. Semikvantitativna RT-PCR analiza nivoa ECE-1 mRNA otkrila je da IL-1, ali ne i TNF, ima blagi stimulativni efekat na ekspresiju ECE-1 gena u kultivisanim ljudskim keratinocitima [40]. U skladu sa RT-PCR analizom, Western blotting je otkrio da IL-1, ali ne i TNF, stimuliše ekspresiju ECE-1 proteina u kultivisanim ljudskim keratinocitima [40]. Konačno, utvrdili smo da li je ECE-1 također reguliran kako bi stimulirao ekspresiju EDN1 u lezijskoj epidermi SL-a. U skladu s nedostatkom stimulativnog efekta TNF-a, koji je pojačan u SL-ovima, nije bilo razlike u nivou ekspresije mRNA ECE-1 između lezije i epiderme SL-a bez lezija [2], što sugerira da ECE-1 nije odgovoran za povećano lučenje EDN1 u SL-ovima.

Slika 3 prikazuje sažetak autokrine stimulacije u ljudskim keratinocitima u kulturi. Što se tiče bioloških mehanizama koji dovode do aktivacije EDN i SCF signalnih kaskada [9], naše in vitro studije ukazuju na zanimljiv kontrast da je povećanje IL-1 uglavnom odgovorno za stimulaciju proizvodnje EDN1 i SCF u UVB- melanoze, povećanje TNF-a je uglavnom povezano sa stimuliranom proizvodnjom ta ista dva citokina u SL-ima.

3.4. Sinergistički stimulativni efekti kombinacije EDN1 i SCF

Već smo izvijestili da postoji sinergija u stimuliranoj sintezi DNK u kultiviranim ljudskim melanocitima mjereno inkorporacijom 14C-timidina u zajedničkoj prisutnosti SCF i EDN1 [41]. Postojala je i slična sinergija u stimulaciji sinteze melanina mjerena inkorporacijom 14C-tiouracila u kultivisane ljudske melanocite u zajedničkoj prisutnosti SCF i EDN1 [41]. Nasuprot tome, nije bilo takve sinergije između EDN1 i faktora stimulacije kolonije granulocitnih makrofaga (GM-CSF) ili HGF [13,42]. Što se tiče signalnih mehanizama uključenih u te sinergističke efekte, otkrili smo da je unakrsni razgovor između SCF i EDN1 signalizacije pokrenut kroz tirozinfosforilaciju c-KIT koja je indirektno stimulirana aktiviranim PKC, što pospješuje stvaranje Shc-Grb{ {18}}SOS kompleks koji zauzvrat vodi do sinergističke aktivacije Ras/Raf-1/MEK/MAP kinazne petlje [41].

3.5. Međusobne interakcije između EDN/EDNBR i SCF/c-KIT

Zatim smo utvrdili da li povećana proizvodnja SCF-a pokreće ekspresiju EDNBR ili njegov afinitet prema EDN ligandu u ljudskim melanocitima uz njegov stimulativni učinak na njihovu proliferaciju. Western blotting analiza je otkrila da SCF može stimulirati ekspresiju EDNBR proteina u kultiviranim ljudskim melanocitima [43]. Kada je afinitet EDNBR prema njegovom ligandu procijenjen u uzgojenim ljudskim melanocitima korištenjem testa vezivanja liganda, utvrđeno je da je vezivanje 125I-obilježenog EDN1 za EDNBR značajno povećano dva dana nakon inkubacije sa SCF [43]. Uzeti zajedno, ovi nalazi ukazuju da SCF eksprimiran u ranoj fazi može pojačati ekspresiju EDNBR, što uzrokuje da melanociti postanu osjetljiviji na kasniju sekreciju EDN1. S druge strane, kada su kultivisani humani melanociti tretirani 48 sati sa EDN1 na 10 nM, test vezivanja liganda pomoću 125I-SCF otkrio je da EDN1 izrazito pojačava afinitet vezivanja SCF-a za c-KITreceptor [43].

4. Sažetak patobiologije SL-a

Tabela 1 prikazuje sažetak parakrinih citokinskih mreža koje se javljaju kod različitih epidermalnih hiperpigmentarnih poremećaja. S obzirom na te mreže, SL-ovi su vrlo slični UVB-melanozi osim uzročnika citokina kao što je TNF za povećanu proizvodnju EDN1 i SCF.

Što se tiče bioloških mehanizama koji dovode do povećane aktivnosti EDN i SCF signalnih kaskada, naše in vitro studije sugerirale su da, iako je regulacija IL-1 uglavnom odgovorna za stimulaciju proizvodnje EDN1 i SCF kod UVB-melanoze, povećanje regulacije TNF je povezan sa stimuliranom proizvodnjom ta ista dva citokina u SL-ima. Slika 4 prikazuje sažetak složenih odnosa između SCF i EDN1 veza u epidermisu SL-a. To uključuje sinergizam između SCF-a i EDN1, kao i aktivaciju EDNBR-a i c-KIT-a od strane SCF-a i EDN1-a, respektivno. Oslobađanje TNF-a od strane keratinocita simulira proizvodnju SCF i EDN na autokrini način, od kojih oba pokazuju sinergistički efekat na aktivaciju melanocita, kao i stimulativni efekat na ekspresiju njihovih odgovarajućih receptora, c-KIT i EDNBR. Ove sinergističke i međućelijske interakcije olakšavaju aktivaciju melanocita u većoj mjeri u lezijskoj epidermi SL nego u epidermisu izloženom UVB-u, što dovodi do intenzivnije hiperpigmentacije SL-a.

Naši rezultati zajedno sugeriraju da dvije signalne kaskade, EDN1/EDNBR i mSCF/c-KIT, igraju intrinzičnu i koordiniranu ulogu u naglašavanju mitogeneze i melanogeneze melanocita u hiperpigmentiranoj epidermi SL-a. Slika 5 prikazuje biološki slijed za mehanizme hiperpigmentacije uključene u SL, gdje nepoznati tumorigeni faktori zbog kumulativnog oštećenja DNK u dalekoj prošlosti uzrokuju da keratinociti proizvode i luče TNF. Dakle, TNF uzrokuje da keratinociti prekomjerno proizvode melanogene citokine kao što su SCF i EDN1 na autokrini način, pokrećući susjedne melanocite da stimuliraju sintezu melanina, što dovodi do epidermalne hiperpigmentacije.

5. Terapijski pristupi lokalnog liječenja

Zasnovano na koordinisanoj melanogenoj parakrinoj mreži i aktiviranim signalnim mehanizmima koji dovode do aktivacije melanocita u lesionalnoj SL epidermi, blokiranje esencijalne melanogene intracelularne signalizacije je poželjan terapijski pristup za postizanje antipigmentirajućih efekata na SL. Takav pristup može uzrokovati hipopigmentaciju, ali ne bi trebao biti efikasan u koži bez lezija gdje takve signalne kaskade nisu aktivirane u melanocitima. S druge strane, inhibicija aktivnosti tirozinaze je još jedan pristup za ublažavanje hiperpigmentacije kod SL-a, iako može uzrokovati hipopigmentaciju i također može biti efikasan kod kože bez lezija.

5.1. Blokiranje esencijalne melanogene intracelularne signalizacije

Budući da se gotovo sve mutacije koje dovode do genetskih hipopigmentarnih poremećaja javljaju u osi EDN1/EDNBR i SCF/c-KIT [44] i budući da postoji sinergistički stimulativni učinak EDN1/SCF na proliferaciju i melanizaciju stanica u uzgojenim ljudskim melanocitima, moguće je da blokiranje bilo EDN1/EDNBR ili SCF/c-KIT signalizacija bi mogla spriječiti hiperpigmentaciju zbog koordinirano povećane ekspresije EDN1 i SCF jer se sinergistički stimulativni efekat ne javlja. Stoga smo pokušali postići anti-pigmentacijske efekte na SL-ovima blokiranjem EDN/EDNBR signalne linije.

EDN-aktivirani intracelularni signalni put sastoji se od vezivanja za EDNBR, aktiviranja PKC, kaskade MAP kinaze i cAMP/PKA kaskade [34,35,41]. Dakle, ove ćelijske akcije se iniciraju vezivanjem EDN1 za G-protein spojen EDNBR, nakon čega slijede sekvencijalni procesi signalizacije koji se uglavnom sastoje od PKC i MAPK. Nakon vezivanja za svoj receptor, EDN1 pokreće hidrolizu polifosfoinozitida aktivacijom fosfolipaze C, koja stvara inozitol-trisfosfate (IP3) i diacilglicerol, mobilizirajući intracelularni Ca plus i aktivirajući PKC, respektivno. Aktivacija PKC se postiže njegovom translokacijom iz citosola u plazma membranu i aktivira Raf-1 kroz fosforilaciju. Stoga se čini da je Raf{11}} konvergentna tačka između PKC i MAPK puteva. Aktivacija Raf-1 dovodi do aktivacije niza intermedijara MAPK puta koji se sastoje od MEK, ERK i RSK. Fosforilirani Raf{13}} aktivira MEK fosforilacijom, a aktivirani MEK fosforilira ERK. Aktivirani ERK zatim fosforilira transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom (MITF) na serinu 75, što dovodi do regrutovanja koaktivatora za regulaciju ekspresije gena nekoliko melanogenih faktora [41]. Istovremeno, aktivirani MAPK dovodi do aktivacije RSK, koji fosforiliše CREB, što dovodi do transkripcije MITF. S druge strane, aktivirani PKC ima unakrsni razgovor sa kaskadom adenil ciklaze za proizvodnju cAMP[8], što dovodi do aktivacije PKA, koji također aktivira CREB fosforilacijom, što dovodi do povećane ekspresije MITF. Povećani nivo MITF proteina stimuliše ekspresiju gena specifičnih za melanocite uključujući tirozinazu, PMEL17, EDNBR, c-KIT i CDK2.

Budući da nekoliko intracelularnih signalnih puteva dovodi do stimulirane melanogeneze unutar melanocita, a EDN signalna kaskada je specifično povezana s PKC putem, koji uključuje mobilizaciju kalcija iz endoplazmatskog retikuluma [13], koristili smo test mobilizacije kalcija za skrining na različite antagoniste EDNBR. biljnih ekstrakata. Mobilizacija kalcijuma iz endoplazmatskog retikuluma događa se nakon stvaranja IP3 i diacilglicerola zbog hidrolize polifosfoinozitida preko aktivirane fosfolipaze C. Kada se ljudski melanociti tretiraju u kulturi sa EDN1, mobilizacija kalcija koji se može otkriti fura-2AM reagensom proizvodi fluorescenciju nakon vezivanja na oslobođeni kalcij, što se vidi po brzoj pojavi žute boje koja se može izmjeriti u realnom vremenu pomoću digitalna slikovna mikroskopija. Probirom mnogih biljnih ekstrakata otkrili smo da je pre-inkubacija s ekstraktom Matricaria chamomilla prekinula mobilizaciju kalcija izazvanu EDN1 [1], što sugerira da može poslužiti kao učinkovit antagonist protiv EDNBR. M. chamomilla, obično poznata kao kamilica, je jednogodišnja biljka iz složene porodice Asteraceae. M. chamomilla je najpopularniji izvor biljnog proizvoda kamilica, iako se i druge vrste koriste kao kamilica.

Na osnovu inhibitornog učinka uzoraka frakcioniranih iz ekstrakta M. chamomilla na EDN{0}}indukovanu mobilizaciju kalcija u melanocitima kulture ljudi, identificirali smo spiroeter kao njegovo aktivno jedinjenje sa snažnom sposobnošću da prekine mobilizaciju kalcija (Slika 6 ) [1]. Postoje dva izomera spiroetera (E i Z), a spiroeterski E-izomer može potpuno ukinuti mobilizaciju kalcija u koncentracijama većim od 1 µM. Tretman spiroeter E-izomerom u koncentracijama od 0.2 i 1,0 posto značajno je smanjio pigmentaciju uzrokovanu UVB-om na smeđe žutoj koži zamorca, što je procijenjeno vrijednošću ∆L, što ukazuje da blokiranje signalne kaskade posredovane EDN-om je efikasan u prevenciji hiperpigmentacije izazvane UVB zrakama. Ovo je važan in vivo dokaz koji pokazuje intrinzičnu uključenost EDN kaskade u UVB-melanozu. S druge strane, kao što se i očekivalo, kada je pre- ili ko-inkubiran u kulturi melanocita, ekstrakt M. chamomilla imao je moćnu sposobnost ukidanja EDN1-inducirao je povećanje sinteze DNK (mjereno ugradnjom 14C-timidina) kao i sintezu melanina (mjereno ugradnjom 14C-tiouracila) od strane kultiviranih ljudskih melanocita. U paralelnoj studiji korištenjem kultiviranih ljudskih keratinocita, potvrdili smo da ekstrakt M.chamomilla nema inhibitorni učinak na IL-1 -indukovanu sekreciju EDN1 [1]. Dodatno, koristeći tirozinaze dobijene iz humanih melanocita, potvrdili smo da ekstrakt M. chamomilla nema inhibitorni učinak na aktivnost tirozinaze in vitro za razliku od izraženih inhibitornih efekata dobro poznatih agenasa za izbjeljivanje, kojične kiseline i arbutina [1]. Kada se ekstrakt M. chamomilla svakodnevno nanosio na smeđe žutu kožu zamorca dvije sedmice neposredno nakon UVB zračenja, intenzitet pigmentacije izazvane UVB zrakama je značajno smanjen u poređenju sa tretmanom sa 10 posto arbutina ili samo nosačem [1].

U kliničkoj studiji na ljudima, utvrđeno je da lokalna primjena ekstrakta M. chamomilla na kožu podlaktice izloženu UVB-u tokom šest sedmica neposredno nakon zračenja značajno sprječava hiperpigmentaciju izazvanu UVB-om, mjerenu mjeračem razlike u boji i izraženu kao ∆ L vrijednost.

Koristeći vosak tipa štapića koji sadrži ekstrakt M. chamomilla, ispitali smo kliničke efekte na pigmentaciju inSL-a. U ovoj kliničkoj studiji, svaka pigmentirana mrlja je ispitana na promjene boje i procijenjeni su stupnjevi kliničkog poboljšanja i validnosti. Klinička procjena obavljena na Tokijskom ženskom medicinskom univerzitetu otkrila je da je dvomjesečno liječenje ekstraktom M.chamomilla rezultiralo u 48 posto ispitanika koji su pokazali značajno poboljšanje i 40 posto sa blagim poboljšanjem [1]. U promjenama nivoa pigmentacije mjerenih vrijednostima ∆L, svi pacijenti sa SL-om imali su izrazito povećanje vrijednosti ∆L za više od dva, što je vidljivo prepoznatljiv nivo, nakon tretmana od 2-3 mjeseca. Došlo je do značajnog smanjenja nivoa pigmentacije mjerenog vrijednostima ∆L između 0, 1 i 2 mjeseca nakon tretmana (Slika 7). Sveukupno, klinička evaluacija tokom tri mjeseca je otkrila da je tretman ekstraktom M. chamomilla doveo do značajnog poboljšanja kod 42 posto ispitanika, 12 posto s umjerenim, a 25 posto sa blagim poboljšanjem. Drugo kliničko ispitivanje obavljeno u dvije srodne dermatološke bolnice u Tokiju pokazalo je da je tretman s ekstraktom M. chamomilla postepeno smanjivao pigmentaciju i nakon šest mjeseci, rezultiralo je da je otprilike 70 posto ispitanika pokazalo više nego blago poboljšanje, uključujući 10 posto nestanka i 15 posto s izrazitim poboljšanjem . Postojala su dva slučaja u kojima su SL-ovi potpuno nestali nakon otprilike šest mjeseci liječenja, pri čemu su vrijednosti ∆L porasle na 8,4 i 6,9 nakon šest mjeseci liječenja (Slika 8) [1].

U zaključku, što se tiče terapijskih pristupa za SL-ove blokiranjem esencijalne melanogene intracelularne signalizacije, gore navedene kliničke studije sugeriraju da je blokiranje signalizacije povezane s EDN1/EDNBR efikasan terapijski tretman za SL-ove bez ikakvih hipopigmentirajućih efekata.

5.2. Inhibiranje aktivnosti tirozinaze

Inhibiranje aktivnosti tirozinaze je još jedan pristup za ublažavanje hiperpigmentacije u SL-ima koji ima moguće nedostatke hipopigmentacije, ali potencijalnu korist od djelotvornosti i kod kože bez lezija. Kako su sredstva za izbjeljivanje općenito dizajnirana za liječenje UVB-melanoze, nije bilo kliničke dvostruko slijepe studije o potencijalnim antipigmentacijskim efektima sredstava za izbjeljivanje na SL-ove. Proveli smo dvostruko zaslijepljenu studiju na pola lica na 27 japanskih volonterki sa SL-om. U toj kliničkoj studiji, losioni sa ili bez 6 posto L-askorbat-2-fosfata 3 Na (APS) (testni losion/placebo losion, respektivno) nanošeni su dva puta dnevno na lice tokom 24 sedmice [45]. Reprezentativne fotografije lica subjekata br. 012 i br. 016 prije i nakon tretmana pokazale su da se nivo pigmentacije testnih SL-a tretiranih losionom blago smanjio zajedno s blagim smanjenjem kože bez lezija tretirane testom losionom [ 45]. Nasuprot tome, nivo pigmentacije SL-a tretiranih placebo losionima i kože bez lezija su ostali nepromijenjeni. Dok su L vrijednosti u testnim SL-ovima tretiranim losionom značajno porasle nakon 24 sedmice liječenja, L vrijednosti u SL-ovima tretiranim placebo losionom ostale su nepromijenjene (Slika 9) [45]. Poređenja vrijednosti oL prije i nakon tretmana su otkrila značajno veće oL vrijednost u testnim SL-ovima tretiranim losionom nego u SL-ovima tretiranim placebo losionom (Slika 9). Ovi nalazi sugeriraju da je test losion koji sadrži APS imao značajno jači antipigmentacijski učinak na SL od placebo losiona. Dok su L vrijednosti u testiranoj koži bez lezija tretiranoj losionom značajno porasle nakon tretmana tokom 24 sedmice, vrijednosti L u koži bez lezija tretirane placebo losionom ostale su nepromijenjene. Poređenje vrijednosti oL prije i nakon tretmana otkrilo je značajno višu vrijednost oL u koži bez lezija koja je bila tretirana losionom nego u koži bez lezija tretiranoj placebo losionom [45]. Ovi nalazi sugeriraju da je test losion imao znatno jači učinak izbjeljivanja na kožu bez lezija od placebo losiona. Poređenje efekata protiv pigmentacije između SL-a i kože bez lezija otkrilo je da, iako su postojale značajno veće vrijednosti oL između prije i poslije tretmana testnim losionom u SL-ima nego na koži bez lezija, vrijednosti oL-a bile su na sličnom nivou. u SL i koži bez lezija bez ikakve značajne razlike između njih [45].

Cistanche inhibira aktivnost tirozinaze.

Odnos između L vrijednosti i indeksa melanina za sva mjerenja tokom ove kliničke studije otkrio je značajnu korelaciju između njih oba. Ovaj rezultat je pokazao da je vrijednost 2.0 ∆L bila približno ekvivalentna 20 ∆ melanin indeksu sa 10- puta većom osjetljivošću u indeksu melanina od vrijednosti L. Poređenje između L vrijednosti i indeksa melanina za svako mjerenje u sedmicama 0 i 24 na SL je otkrilo značajne korelacije. Ova poređenja između L vrijednosti i indeksa melanina su pokazala da je došlo do značajnog pomaka distribucije prema svjetlijoj boji, kao što je veća L vrijednost i manji indeks melanina u testnim SL-ovima tretiranim losionima, dok nije bilo tako jasnog pomaka u distribuciji u placebo losionu. -tretirane SL-ove [45].

U zaključku, što se tiče terapijskog pristupa za SL koji koristi inhibitor tirozinaze, zbir gornjih nalaza snažno ukazuje da APS ima slab, ali značajan antipigmentacijski učinak na SL i značajan učinak izbjeljivanja čak i na normalno obojenu zdravu kožu, bez ikakvog hipopigmentirajućeg efekta.

6. Zaključci

U zaključku, što se tiče mehanizama aktivacije melanocita i terapijskog lokalnog tretmana SL-a, na osnovu gornjih nalaza o mehanizmu aktivacije melanocita u SL-ima, kao i kliničke efikasnosti dobijene upotrebom blokatora signala EDN i inhibitora tirozinaze, snažno se sugerira da se kombinirano liječenje blokator EDN signala i inhibitor tirozinaze je poželjan terapijski tretman za SL.

cistanche tablete

Za više informacija kliknite na sliku.