Razlike u sastavu i ljekovitoj djelotvornosti sirovih proizvoda i proizvoda prerađenih parom vina od Cistanches Herba Ⅱ
Sep 10, 2024
2.3.3 Detekcija tjelesne težine i tjelesne temperature
Pacovi su hranjeni adaptivno 1 sedmicu, zabilježeno kao 0 dan, a zabilježena je tjelesna težina i rektalna temperatura; nakon što je injekcija hidrokortizon natrijum sukcinata kontinuirano primijenjena 14 dana, zabilježeno je 14 dana, a zabilježena je tjelesna težina i rektalna temperatura; nakon uspješnog modeliranja, liječenje lijekom je provedeno prema šemi doziranja u trajanju od 30 dana, evidentirano kao 44 dana, a zabilježena je tjelesna težina i rektalna temperatura.
2.3.4 Detekcija frekvencije spontane aktivnosti
Broj aktivnosti štakora u roku od 5 minuta zabilježen je pomoću multifunkcionalnog registratora spontane aktivnosti pacova. Pacovi su stavljeni u instrument za spontanu aktivnost, prve 3 minute je bio period adaptacije, a broj spontanih aktivnosti pacova brojao je rekorder u posljednjih 5 minuta. Prostorija treba da bude tiha, sobna temperatura treba da se održava na 18-22 stepeni , a vlažnost treba da se održava na 45%-65%. Zabilježen je broj spontanih aktivnosti na 0, 14, odnosno 44 dana.
2.3.5 Detekcija serumskog indeksa
Nakon anesteziranja pacova, krv je sakupljena iz abdominalne aorte, stavljena u koagulacionu epruvetu i centrifugirana na 2,000 r/min 15 minuta da bi se otkrio sadržaj T, E2, CREA i BUN u serum.
VISOKOKVALITETNA CISTANŠA ZA BOLESTI BUBREGA
Služba podrške Wecistanche
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
2.3.6 Izračunavanje indeksa organa
Nakon anesteziranja pacova i uzimanja krvi, uklonjeni su bubrezi, testisi, epididimis, sjemene mjehuriće i prostata, obrisani filter papirom i masa je odmah izmjerena. Indeks organa je izračunat na osnovu mase pacova.
Indeks organa=masa organa/tjelesna masa
2.3.7 Detekcija tkiva
Nakon što su testisi pacova uklonjeni, masa je izvagana i odmah stavljena u frižider na -80 stepeni radi zamrzavanja. Prije mjerenja su izvađene, odmrznute i dodat je prethodno ohlađeni fiziološki rastvor da bi se napravio homogenat tkiva u uslovima ledene kupke i pripremljen je 10% homogenat tkiva. Homogenat je odmah centrifugiran na 5,{4}} r/min tokom 10 min, a supernatant je uzet za upotrebu. Prema zahtjevima kompleta, za određivanje sadržaja SOD u tkivu testisa korištena je metoda hidroksilamina, a za određivanje sadržaja MDA u tkivu testisa TBA metoda.
Slika 2. Dijagram ukupne jonske struje Cistanches Herba i pirjanih Cistanches Herba u režimu negativnih jona
3 rezultata
3.1 Razlike u sastavu Cistanche deserticola prije i poslije obrade
3.1.1 Ukupni dijagram toka jona
U ovoj studiji, detektor masenog spektrometra koristio je elektrosprej ionizacijski izvor negativnih jona (ESI−). Slika 2 prikazuje dijagram ukupnog toka jona sirove Cistanche deserticola i proizvoda pirjanih u vinu u režimu negativnih jona. Može se vidjeti da je sastav uzoraka Cistanche deserticola vrlo složen, te da postoje očigledne razlike između sirovog Cistanche deserticola i proizvoda pirjanih u vinu. Pored toga, pretraživanjem postojeće baze podataka i konsultacijom relevantne literature za elementarni sastav i podudaranje jedinjenja, identifikovano je ukupno 45 jedinjenja, kao što je prikazano u tabeli 3.
Tabela 3. Identifikovana jedinjenja u uzorcima Cistanches Herba
3.1.2 Rezultati PCA
PCA dijagrami sirovog Cistanche deserticola i proizvoda pirjanih u vinu prikazani su na slici 3, koji se mogu zasebno grupirati. Može se utvrditi da moraju postojati razlike u sastavu Cistanche deserticola prije i nakon obrade.
3.1.3 OPLS-DA rezultati
Nakon OPLS-DA obrade, S-Plot dijagram je prikazan na slici 4. Dva kraja krivulje u obliku slova S na slici predstavljaju karakteristične markere sa najvećim doprinosom u svakoj grupi. Analizom podataka o fragmentima jona sa VIP vrijednostima većim od 1 na oba kraja krivulje u obliku slova S i poređenjem sa kontrolom, identifikovane su četiri diferencijalne komponente: ehinakozid (tR=8.39 min, m/z 785. 250 9), verbaskozid (tR=11.51 min, m/z
623.198 1), izoverbaskozid (tR=13.38 min, m/z623.198 1) i tubulozid B (tR=18.41 min, m/z 665. 208 7).
VISOKO KVALITETNO LIKER CISTANCHE ZA BOLESTI BUBREGA
3.2 Eksperimentalni rezultati na životinjama
3.2.1 Općenito zapažanje statusa
Nakon modeliranja, pacovi su pokazali niz simptoma poput voljenja topline i straha od hladnoće, savijanja i savijanja leđa, bezvoljnosti, dosadne i neuredne dlake, hladnih udova, smanjenog apetita, smanjene tjelesne težine i prozirnog urina. Nakon primjene, gore navedeni simptomi u svakoj grupi su značajno poboljšani.
3.2.2 Promjene u ishrani i dobrovoljnoj aktivnosti pacova nakon modeliranja
Nakon kontinuirane injekcije hidrokortizon natrijum sukcinata tokom 14 dana, mjereni su tjelesna težina, broj voljnih aktivnosti unutar 5 minuta i unos hrane, unos vode i izlučivanje urina štakora u svakoj grupi kako bi se utvrdilo da li je model nedostatka hidrokortizona bubrega yang je uspješno uspostavljen. Rezultati su prikazani u tabeli 4. Kao što je prikazano u tabeli 4, nakon 14 dana primene hidrokortizona, u poređenju sa normalnom grupom, sve grupe su pokazale smanjenje telesne težine, smanjenje unosa hrane, povećanje unosa vode, povećanje izlučivanja mokraće, i smanjenje dobrovoljne aktivnosti, a bilo je značajnih razlika (P < 0.05). Prema opisu nekih sindroma nedostatka yang bubrega u terminologiji kliničke dijagnoze i liječenja tradicionalne kineske medicine: „strah od hladnoće i hladnih udova, posebno ispod struka i koljena, blijedi ili tamni ten, bistar i dug urin, učestalo mokrenje kod noć, bled jezik sa belim krznom, slab puls, itd." U kombinaciji sa opažanjem općeg stanja nakon modeliranja, simptomi nakon modeliranja bili su u skladu s opisom yang nedostatka bubrega, što ukazuje da je modeliranje bilo uspješno.
| br. | Compound | t/min | Jonization Mode | Molecular Formula | Teorijska vrijednost (m/z) | Eksperimentalna vrijednost (m/z) | Greška (×10⁻⁶) | Informacije o fragmentu (m/z) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Grape Sugar | 0.79 | [M–H] | C₆H₁₂O₆ | 179.055 | 179.055 | 0.20 | 97, 89 |
| 2 | Grape Tanin | 0.81 | [M–H] | C₁₅H₁₄O₈ | 331.139 | 331.139 | 1.53 | 295, 313, 311 |
| 3 | Sorbitol | 0.88 | [M–H] | C₁₂H₂₂O₁₁ | 341.108 | 341.108 | 1.50 | 179, 161, 143, 131 |
| 4 | Pola mlečni šećer | 1.10 | [M–H] | C₆H₁₂O₆ | 181.071 | 181.071 | 2.68 | 163, 101 |
| 5 | Biljni nutrijent C | 1.20 | [M–H] | C₂₈H₄₃O₁₂ | 561.197 | 561.197 | -0.01 | 543, 461, 399 |
| 6 | Pine Sugar | 1.21 | [M–H] | C₁₆H₂₀O₈ | 341.123 | 341.124 | 1.63 | 179, 161, 143, 131, 119 |
| 7 | Succinic Acid | 1.52 | [M–H] | C₄H₄O₄ | 117.018 | 117.019 | 3.40 | 99, 73 |
| 8 | Biljni nutrijent B | 2.04 | [M–H] | C₂₈H₃₃O₁₃ | 577.192 | 577.192 | -0.03 | 297, 208, 183, 178, 171, 153 |
| 9 | Čaj Flavonoidi | 2.20 | [M–H] | C₇H₆O₆N₂ | 164.071 | 164.072 | 1.00 | 103 |
| 10 | Ekstrakt pekinške kruške | 3.73 | [M–H] | C₁₄H₁₂O₁₁ | 373.113 | 373.115 | 5.48 | 355, 327, 297 |
| 11 | Ekstrakt goji bobica | 4.28 | [M–H] | C₂₀H₂₄O₁₈ | 461.169 | 461.169 | 0.00 | 485, 293, 215, 197, 167 |
| 12 | Ekstrakt lista ananasa | 4.74 | [M–H] | C₁₁H₁₂O₇ | 487.145 | 487.146 | 0.88 | 389, 179 |
| 13 | Ekstrakt cvijeta hibiskusa | 4.63 | [M–H] | C₂₄H₂₈O₁₀ | 537.197 | 537.197 | 0.00 | 501, 415, 375, 357 |
| 14 | 8- -Hidroksilakton | 5.27 | [M–H] | C₁₂H₂₀O₈ | 241.096 | 241.097 | 0.04 | 213, 189 |
| 15 | Rhizoma Dioscoreae | 6.10 | [M–H] | C₁₈H₂₄O₈ | 361.115 | 361.113 | 2.20 | 309, 163, 137 |
| 16 | Ekstrakt slamke | 6.82 | [M–H] | C₁₅H₂₁O₁₀ | 327.108 | 327.109 | 1.00 | 307, 195 |
| 17 | Pčelinji polen | 7.20 | [M–H] | C₁₄H₂₈O₈ | 437.472 | 437.472 | 0.00 | 393, 373, 355 |
| 18 | - Karoten | 7.53 | [M–H] | C₂₉H₄₆O₁₆ | 629.192 | 629.192 | 0.00 | 617, 479, 459, 315, 221 |
| 19 | Ljubičasti slatki krompir | 7.70 | [M–H] | C₁₇H₂₄O₉ | 371.134 | 371.134 | 0.00 | 349, 328 |
| 20 | Ekstrakt pekinške kruške | 8.02 | [M–H] | C₁₇H₂₄O₉ | 371.134 | 371.134 | 0.00 | 349, 328 |
| 21 | Ekstrakt cvijeta breskve | 8.09 | [M–H] | C₂₈H₄₀O₁₂ | 561.197 | 561.197 | 0.00 | 543, 461, 399 |
| 22 | Ekstrakt ginsenga | 10.39 | [M–H] | C₈H₁₈O₈ | 799.266 | 799.266 | 0.03 | 417, 439, 543, 561 |
| 23 | Ekstrakt Oolong čaja | 10.63 | [M–H] | C₂₄H₃₄O₁₆ | 539.149 | 539.149 | 0.10 | 637, 621, 471, 473 |
| 24 | Ekstrakt Lotusovog lista | 11.51 | [M–H] | C₂₇H₃₄O₁₂ | 549.197 | 549.197 | 0.00 | 197, 153, 135 |
| 25 | Ekstrakt dlakavog cvijeta | 11.51 | [M–H] | C₂₉H₄₈O₁₆ | 623.197 | 623.196 | -0.21 | 387, 531 |
| 26 | Ekstrakt bambusovih izdanaka | 11.51 | [M–H] | C₃₇H₄₈O₂₁ | 827.261 | 827.259 | -1.92 | 461, 315, 135, 297, 161 |
| 27 | Ekstrakt krizanteme | 11.60 | [M–H] | C₂₁H₃₀O₉ | 429.118 | 429.118 | 0.00 | 663, 625, 413 |
| 28 | 6-Acetil flavon | 12.32 | [M–H] | C₁₈H₁₈O₆ | 345.118 | 345.119 | 0.02 | 301, 281 |
| 29 | Ekstrakt voća Longan | 13.41 | [M–H] | C₁₈H₁₈O₈ | 417.154 | 417.159 | -0.11 | 165, 119, 327, 129, 27 |
Slika 3 Dijagram analize glavnih komponenti CistanchesHerba (1) i Cistanches Herba pirjanog vina (2)
Slika 4 S-Grafikon Cistanches Herba i pirjana vinski Cistanches Herba
Tabela 4 Promjene u ishrani i autonomnoj aktivnosti pacova nakon modeliranja (xs ± , n=10)
| Grupa | tjelesna težina (g) | 24 h unos hrane (g) | 24 h unos vode (mL) | 24 h Izlaz urina (mL) | 5 min Spontane Activity Count |
|---|---|---|---|---|---|
| Normalno | 285.14 ± 9.26 | 15.81 ± 2.19 | 20.86 ± 3.59 | 11.09 ± 2.57 | 100.4 ± 14.7 |
| Model | 226.67 ± 12.14* | 11.92 ± 3.69* | 32.53 ± 4.65* | 15.58 ± 6.38* | 72.7 ± 11.6* |
| PR | 222.89 ± 9.87* | 10.65 ± 4.20* | 31.54 ± 3.55* | 19.36 ± 5.20* | 68.9 ± 18.0* |
| PW | 219.16 ± 10.75* | 12.37 ± 3.42* | 29.11 ± 4.78* | 16.01 ± 3.96* | 62.8 ± 14.9* |
| JK | 230.02 ± 7.95* | 10.22 ± 2.26* | 34.57 ± 5.36* | 19.13 ± 7.57* | 69.3 ± 11.3* |
napomene:
Poređenje sa normalnom grupom: *P < 0.05.
*P < 0.05 u odnosu na normalnu grupu.
Tabela 5 Promjene tjelesne težine pacova tokom ciklusa doziranja ( xs ± , n=10)
| Grupa | tjelesna težina (g) | 0 d | 14 d | 44 d |
|---|---|---|---|---|
| Normalno | 192.12 ± 5.48 | 285.14 ± 9.26 | 430.02 ± 6.14 | |
| Model | 187.24 ± 4.56* | 226.67 ± 12.14* | 328.33 ± 14.77* | |
| PR | 185.07 ± 5.11 | 222.89 ± 9.87* | 345.25 ± 8.22*# | |
| PW | 183.48 ± 6.44 | 219.16 ± 10.75* | 362.17 ± 7.82*#Δ | |
| JK | 194.13 ± 5.90 | 230.02 ± 7.95* | 356.94 ± 7.47*# |
napomene:
*P < 0.05 u odnosu na normalnu grupu.
*P＜{{0}}.05 naspram normalne grupe; #P＜0,05 u odnosu na grupu modela; △P<0,05 vs PRgroup. Isto kao ispod.
3.2.3 Promjene tjelesne težine pacova
Na osnovu promjena tjelesne težine tri puta za 0, 14 i 44 dana, analiziran je učinak injekcije im hidrokortizon natrijum sukcinata na tjelesnu težinu pacova i oporavak tjelesne težine pacova nakon intervencije lijekom. Rezultati su prikazani u tabeli 5.
Iz Tabele 5 se može vidjeti da je nakon 1 sedmice adaptivnog hranjenja tjelesna težina pacova porasla i bila je relativno uravnotežena. Sve tjelesne težine pacova bile su (200±20) g. Nije bilo značajne razlike između grupa, što ukazuje na to da su uslovi hranjenja i ishrane pogodni za preživljavanje pacova. Nakon 14 dana primjene hidrokortizona, u poređenju sa normalnom grupom, povećanje tjelesne težine štakora u modelnoj grupi i svakoj grupi lijeka je smanjeno, te je postojala značajna razlika (P<0.05). The body weight of the rats in the normal group was
3.2.4 Promjene tjelesne temperature pacova
Na osnovu promjena tjelesne temperature od tri puta tokom 0, 14 i 44 dana, analiziran je učinak intramuskularne injekcije hidrokortizon natrijum sukcinata na tjelesnu temperaturu štakora i oporavak tjelesne temperature štakora nakon intervencije lijeka. . Rezultati su prikazani u tabeli 6.
3.2.5 Promjene u spontanim aktivnostima pacova
Na osnovu promjena u broju spontanih aktivnosti u 3 dana na 0, 14 i 44 dana, učinak im hidrokortizon natrijum sukcinata injekcije na broj spontanih aktivnosti kod pacova i oporavak broja spontanih analizirane su aktivnosti kod pacova nakon intervencije lijekom. Rezultati Vidite tabelu 7.
Iz Tabele 7 se može vidjeti da je 14 dana nakon injekcije hidrokortizona, u poređenju sa normalnom grupom, broj spontanih aktivnosti unutar 5 minuta svake druge grupe značajno smanjen, te je postojala značajna razlika (P<0.05). One month after administration, compared with the model group, the number of spontaneous activities of rats in each Cistanche deserticola administration group increased (P<0.05); compared with the normal group, there was no significant difference in the number of spontaneous activities of rats in each Cistanche deserticola administration group; Compared with the JK group, there was no significant difference in the number of spontaneous activities among the Cistanche deserticola administration groups. It shows that Cistanche deserticola extract can increase the number of spontaneous activities in rats with kidney-yang deficiency, and after 30 days of treatment, the number of spontaneous activities is close to that of normal rats.
3.2.6 Indeks organa
Nakon 30 dana kontinuirane primjene, pacovi su gladni 12 sati i žrtvovani. Mjeren je kvalitet organa. Efekti modela nedostatka yang bubrega izazvanog hidrokortizonom na organe pacova i primjene različitih ekstrakata Cistanche deserticola promatrani su sa nivoa organa. Oporavak organa štakora nakon uzimanja lijeka. Nakon primjene hidrokortizona, tjelesna težina pacova je značajno varirala, a značajno se mijenjala i masa organa. Ovaj eksperiment je koristio indeks organa kao indikator za razmatranje
Efekti na organe primećeni su pre i posle primene. Rezultati su prikazani u tabeli 8.
Iz tabele 8 se može vidjeti da su u odnosu na normalnu grupu, nakon intramuskularne injekcije hidrokortizon natrijum sukcinata pacovima, svi indeksi organa bubrega, testisa, epididimisa i prostate u modelnoj grupi smanjeni (P<0.05), indicating that hydrocortisone-induced The kidney-yang deficiency model in rats will cause changes in the indexes of the kidneys, testicles, epididymis and prostate, but has little effect on the seminal vesicles.
Sveukupno, u poređenju sa modelnom grupom, indeksi organa svake grupe za davanje su poboljšani, što ukazuje da sirovi Cistanche deserticola, vino Cistanche deserticola i Jingui Shenqi pilule mogu ublažiti pad indeksa organa u modelu nedostatka bubrega i janga.
Iz perspektive svakog organa, u poređenju sa modelnom grupom, grupa vina Cistanche deserticola može značajno povećati indeks organa bubrega (P<0.05). Comparing different drug administration groups, the wine Cistanche deserticola group is better than the raw Cistanche deserticola group (P<0.05). ; From the perspective of testicular index, compared with the model group, each administration group can significantly increase the organ index of the testis (P<0.05). Comparing different administration groups, the wine Cistanche deserticola group has a significant advantage over the raw Cistanche deserticola group. (P < 0.05); from the perspective of epididymal index, compared with the model group, each administration group can significantly increase the organ index of the epididymis (P < 0.05); from the perspective of seminal vesicle index, compared with the model group , the wine Cistanche deserticola group can significantly improve the organ index of the seminal vesicles (P<0.05). Comparing different administration groups, the wine Cistanche deserticola group is significantly better than the raw Cistanche deserticola group (P<0.05); from the perspective of the prostate, compared with the model group In comparison, the raw Cistanche deserticola group and the wine Cistanche deserticola group could significantly increase the prostate organ index (P<0.05).
3.2.7 Detekcija indikatora bubrežne funkcije
BUN i CREA odražavaju funkciju bubrega. CREA u serumu je krajnji proizvod organske tvari koja sadrži dušik, a BUN u serumu je glavni krajnji produkt metabolizma proteina. Oba se uglavnom izlučuju glomerularnom filtracijom [10-11]. Kada je bubrežna funkcija oštećena, funkcija glomerularne filtracije se smanjuje, a koncentracije oba se povećavaju. Nivoi BUN u krvi i CREA u krvi odražavaju status funkcije bubrega: što su njihove razine veće, to je teže oštećenje funkcije bubrega. U ovom eksperimentu, sadržaj BUN i CREA u serumu štakora je detektovan kako bi se procijenili efekti svake grupe za primjenu na bubrežnu funkciju kod pacova s nedostatkom bubrega-yang izazvanim hidrokortizonom.
Kao što se vidi iz tabele 9, u poređenju sa normalnom grupom, sadržaj BUN i CREA u modelnoj grupi je povećan i postoji značajna razlika (P<0.05), indicating that hydrocortisone caused kidney damage to rats. Compared with the model group, the wine Cistanche deserticola and raw Cistanche deserticola groups can reduce the content of CREA (P<0.05), thereby alleviating kidney damage to a certain extent.
3.2.8 Detekcija indikatora polnih hormona
Bubrezi su temelj urođenosti i igraju važnu ulogu u ljudskom rastu, razvoju i životnim procesima. Tradicionalna kineska medicina vjeruje da bubrezi upravljaju reprodukcijom, a veza između bubrega i reproduktivnog sistema je vrlo bliska. Sve više istraživača je otkrilo da pacijenti sa nedostatkom bubrega-janga imaju značajne promjene u osovini hipotalamus-hipofiza-gonada, često praćene simptomima sniženog nivoa polnih hormona kao što su T i E2 [12]. U ovom eksperimentu, mjeren je sadržaj T i E2 u serumu kako bi se odredili efekti svake grupe za primjenu na polne hormone kod pacova s nedostatkom bubrega-janga izazvanim hidrokortizonom.
Kao što se vidi iz tabele 10, u poređenju sa normalnom grupom, sadržaji T i E2 u grupi modela su smanjeni (P<0.05), indicating that hydrocortisone can cause a decrease in rat sex hormone levels. Compared with the model group, each administration group was able to significantly increase the levels of T and E2 in serum (P<0.05) and improve the decrease in sex hormones induced by hydrocortisone. Comparing different administration groups, the wine Cistanche deserticola group was better than the raw Cistanche deserticola group (P<0.05). Generally speaking, wine Cistanche deserticola has obvious performance in increasing T and E2 in the serum of rats with kidney yang deficiency, which is consistent with literature reports that phenylethanol glycosides, the main components of wine Cistanche deserticola, have hormone-like effects [13].
3.2.9 Detekcija indeksa antioksidansa
SOD je antioksidans koji odražava sposobnost tijela da ukloni slobodne radikale, dok je MDA krajnji proizvod reakcije oksidativnog stresa i može odražavati stepen oksidativnog oštećenja organizma. U ovom eksperimentu, mjeren je sadržaj SOD i MDA u testisima kako bi se odredila antioksidativna aktivnost svake grupe koja je davala lijek protiv modela yang nedostatka bubrega izazvanog hidrokortizonom.
Kao što se vidi iz tabele 11, u poređenju sa normalnom grupom, sadržaj SOD u grupi modela je smanjen (P<0.05). After 1 month of administration, compared with the model group, the SOD content in the raw Cistanche deserticola group and the wine Cistanche deserticola group increased. Compared with the normal group, the MDA content in the model group increased (P<0.05), indicating that the testicular tissue of rats with kidney-yang deficiency induced by hydrocortisone was oxidatively damaged. After being given Cistanche deserticola extract or Jingui Shenqi Pill positive medicine, each administration group was able to significantly reduce the content of MDA in testicular tissue and alleviate the oxidative damage caused by hydrocortisone. Taken together, both raw Cistanche deserticola and wine Cistanche deserticola can improve the body's ability to resist oxidative damage and alleviate oxidative damage caused by hydrocortisone.
(1) Grupisanje: Pacovima je dat slobodan pristup vodi i ishrani. Nakon tjedan dana adaptivnog hranjenja, nasumično su podijeljeni u 5 grupa (Tabela 2), sa po 10 štakora u svakoj grupi, i to normalna grupa, model grupa, sirova Cistanche deserticola grupa (PR), pirjana Cistanche deserticola grupa (PW) i pozitivna kontrola Jinkui Shenqi Pill group (JK). (2) Modeliranje: Osim normalne grupe, sve ostale četiri grupe su dobile injekciju hidrokortizon natrijum sukcinata im, u dozi od 20 mg/kg, tokom 14 uzastopnih dana. Normalnoj grupi je ubrizgana ista doza normalnog fiziološkog rastvora. Općenito stanje štakora u svakoj grupi je promatrano kako bi se utvrdilo da li pokazuju simptome kao što su strah od hladnoće, sklonost toplini, hladni udovi, bistar i dugačak urin, sklupčana i savijena leđa, dosadna i neuredna dlaka i mentalna depresija. Istovremeno je mjerena tjelesna težina, broj spontanih aktivnosti, unos hrane, unos vode, izlučivanje urina i drugi pokazatelji pacova u svakoj grupi.
