Mehanistički uvid u neuroprotekciju izazvanu diosminom i poboljšanje pamćenja u modelu pacova intracerebroventrikularno-kinolinske kiseline: uskrsnuće mitohondrijskih funkcija i antioksidansa, 2. dio

2.8. Zadatak za prepoznavanje novih objekata (NORT).

Praćen je standardni protokol kao što su dali Kumar i Bansal [23]. NORT je neprofitabilan i nehostivi eksteroceptivni arhetip koji se koristi za procenu radnog tipa kolektivnog pamćenja koji se eksploatiše kroz impulsivno sondiranje glodara. Istraživanje se izvodi u kockastoj posudi od šperploče na krovu (80 cm × 42 cm × 62 cm), smještenoj u mirnom području, osvijetljenoj LED diodom od 60 W kako bi se osigurala konzistentna svjetlina u posudi.

Glodari su vrsta malih sisara koji žive na Zemlji. Često žive na travnjacima, šumama i drugim mjestima. Žive nježnim životom, kratki su i slatki. U poređenju s drugim organizmima, glodari imaju snažnu prednost u pamćenju, a mnoga istraživanja su pokazala da je pamćenje glodara daleko izvan naše mašte.

Mozak glodara je vrlo fleksibilan, posebno kada se bavi zadacima vezanim za pohranjivanje informacija. Mnogi eksperimenti su pokazali da pamćenje glodavaca može čak i premašiti memoriju drugih velikih sisara. U eksperimentu su neki istraživači davali glodavcima poput miševa i hrčaka mnogo različitih mjesta, objekata, događaja i drugih informacija, a zatim su promatrali njihove reakcije i obradu tih informacija. Utvrđeno je da su se ovi glodari vrlo dobro sjećali, pa čak i da su mogli zapamtiti mnogo različitih informacija i scena, čak i bolje od većine ljudi.

Pa zašto glodari bolje pamte od drugih životinja? Ovo je neodvojivo od životnog okruženja glodara. Ove male životinje često žive u opasnim okruženjima, pa moraju naučiti da se brzo prilagode i prežive. Da bi održali svoj opstanak i reprodukciju, glodavci moraju razumjeti promjene u okruženju i informacije kao što su putanje aktivnosti drugih životinja i biljaka. To od njih zahtijeva odlične sposobnosti zapažanja i pamćenja kako bi se bolje prilagodili životnoj sredini.

Osim toga, način života i navike ponašanja glodara također mogu pomoći u poboljšanju njihovog pamćenja. Neka istraživanja su pokazala da glodari vole sakupljati i pohranjivati ​​predmete, koji mogu poboljšati njihovo pamćenje i prostornu percepciju. Osim toga, glodavci vole obavljati i neke rutinske aktivnosti, poput kretanja određenom rutom i obavljanja iste vrste zadataka. Ovo rutinsko ponašanje im također može pomoći da ojačaju svoje pamćenje i sposobnost stvaranja navika.

U biološkom svijetu, glodari imaju jedinstveno pamćenje i snažne sposobnosti zapažanja, pamćenja i prilagođavanja. Za nas, pamćenje glodara može odgovarati našim sposobnostima učenja i pamćenja. Od glodara možemo naučiti da sve dok smo pažljivi, nastavljamo da učimo i akumuliramo u svojim studijama i životima, također možemo imati iste izvrsne sposobnosti pamćenja i stvaranja navika kao i glodari. To pokazuje da moramo poboljšati svoje pamćenje, a Cistanche može značajno poboljšati naše pamćenje, jer Cistanche može regulisati i ravnotežu neurotransmitera, kao što je povećanje nivoa acetilholina i faktora rasta, koji su veoma važni za pamćenje i učenje. Osim toga, Cistanche deserticola može poboljšati protok krvi i promovirati isporuku kisika, što može osigurati da mozak dobije adekvatnu ishranu i energiju, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite na dugme Znaj poboljšanje memorije

Drveni predmeti u obliku cilindra (bijeli), piramidalni (crveni) i kocke (crni) (visoki 12 cm) (u identičnim trojkama) bili su čvrsti i dovoljne težine da ih glodari učine nepokretnima. NORT je izveden 16. dana u 3 faze (S): aklimatizacija (S1), akvizicija (S2) i faza ispitivanja (retenzije) novih objekata (S3). Tokom S1, tri uzastopna dana prije pokusa su izdati pacovi kako bi se otkrila prazna podna osnova posude (5 minuta). Po završetku S1, pojedinačna životinja je navikla na bilo koji set čvrstih predmeta u fazi učenja (S2).

U 2 proizvoljno odabrana suprotna ugla plovila (9 cm do 11 cm razmak od bočnih bedema) postavljene su stvari nalik blizancima. Zasebno, glodavac je postavljen u centar posude okrenut suprotno od dva čvrsta predmeta i dozvoljeno mu je da otkrije dva slična predmeta na 5 minuta. Navođenje njuške u blizini predmeta na udaljenosti manjoj ili jednakoj 2–3 cm ili fizički kontakt sa predmetom njuškom je pretpostavljeno kao istražni postupak.

Nakon S2, glodar je bio smješten u kućnom kavezu praćenom međuprobnom pauzom (ITR) od 60 minuta.

Bilo koji pojedinačni čvrsti predmet ponuđen u S2 zamijenjen je drugim čvrstim predmetom, a glodari su ponovo predstavljeni blizancima, tj. replika poznatog predmeta i različite stavke..cijela spajanja i pozicije stavki su pomjerene na ublažiti vjerovatne predrasude izazvane sklonošću određenim postavkama ili predmetima. Posuda i čvrsti predmeti su pažljivo obrisani (etil alkohol 15% i suha krpa) nakon svake istrage kako bi se suzbili tragovi mirisa. .e period potrošen na otkrivanje svake stavke u S2 i S3 dokumentiran je pomoću štoperice. .e trajanje utrošeno na istraživanje dvije podudarne stavke u S2 (I1 � Ii1 + Ii2) i trajanje utrošeno na istraživanje dvije različite stavke, tj. upoznati i različite, u S3 (I2 � Ii3 + Ib) je snimljen. Varijanca u trajanju utrošenom na istraživanje različitog predmeta i trajanju istraživanja upoznatog predmeta (Ib–Ii3 � DI) otkriva zadržavanje pamćenja.

DI (indeks diskriminacije)/S3 trajanje(a) istraživanja i upoznatog i novog predmeta (izmijenjeni DI) poboljšava pristrasnosti varijansama u kompletnoj istrazi i označava sklonost različitim predmetima za razliku od poznatih {DI � (Ib–Ii3 )/(Ii3 + Ib)}. Rekolektivno pamćenje je procijenjeno kvantificiranjem vještine glodara da izdvoje poznate/noveliteme u S3 i navedeno je kao DI (izmijenjeno za cjelokupni period istraživanja u S3) [24].

2.9. MorrisWater Maze (MWM). Praćen je standardni protokol, kao što su dali Kumar i Bansal [25]. MWM procjenjuje prostornu memoriju plivanjem, u kojem glodar pronalazi put za bijeg do skrivenog podijuma.

Okrugli rezervoar crne boje (2 m prečnika, 0.6 m visine) imao je vodu (25 ± 1 stepen) napunjen do dubine od 0.3 m. Vodeni rezervoar je podijeljen u smjeru kazaljke na satu na 4 slična područja (R1, R2, R3 i R4) pomoću dva najlonska vlakna, pričvršćena okomito na gornji perimetar rezervoara.

Podmorje (10,5 cm × 10,5 cm) je postavljeno pod vodom (1 cm ispod vode) u području rezervoara R4. Tačka na podijumu je ostala netaknuta tokom perioda nabavke. Svaki pojedini štakor je predstavljen sa četiri serijske runde akvizicije (5 minuta ITR) svakog dana. Glodavac je lagano pušten u vodeni rezervoar koji je okrenut prema zidu rezervoara, pri čemu je lokacija varirala sa svakim pojedinačnim pokušajem od R1-R4, R2-R1, R3-R2 i R{{ 13}}R3 od 1. do 4. dana, respektivno, i bilo je dozvoljeno 120 sekundi za otkrivanje podvodnog podijuma. Glodari su nastavili da miruju na podijumu 20 sekundi.

Neuspeh u otkrivanju platforme u roku od 120 sekundi je ukazivao na ručno postavljanje pacova na platformu, a zatim im je bilo dozvoljeno 20 sekundi na platformi. Vrijeme kašnjenja u bijegu (ELT) je trajanje(a) otkrivanja skrivenog podmeta u vodenom rezervoaru. Prostorno učenje obilježeno je prvim danom u odnosu na dan četvrti ELT.

U ispitivanju sonde (5. dan), glodari su istraživali rezervoar 120 sekundi, ali im je oduzeto postolje. Zabilježeno je srednje trajanje potrošeno u cijelom rezervoaru (4 regije). .e srednje trajanje utrošeno u R4 (TSTQ: vrijeme provedeno u ciljnom kvadrantu) sondiranje skrivenog podijuma smatrano je indeksom referentne memorije. .uporedna postavka spremnika u odnosu na predmete u laboratoriji koji djeluju kao vizualni znakovi i pozicija istraživača ostala je neometana [26].

2.10. Procjena biohemijskih parametara. Nakon završetka ispitivanja ponašanja, kompletan mozak pacova je sakupljen i pozicioniran na usitnjene kockice leda, nakon čega je uslijedilo kupanje zamrznutom steriliziranom fiziološkom otopinom (izotonični 308 mOsmol/l NaCl) kako bi se uklonili ostaci i krv.

Homogenizacija cijelog mozga je trenutno postignuta u puferu za odvajanje smrzavanja (pH 7,4) sa sastavom 215 mM D-manitola, 20 mM 2-[4-(2-hidroksietil )piperazin-1-il]etansulfonska kiselina, 1 mM 1,2-bis[2-[bis(karboksimetil)amino]etoksi]etan, 75 mM saharoze i 0,1% BSA. Homogenat je centrifugiran na 4 stepena upotrebom sile od 13000 × g tokom 5 minuta. Pelet je odbačen, a supernatant je odvojen na dva dela i centrifugiran (4 stepena) pri 13000 × g sile 5 minuta. Sirovi mitohondrijski pelet je odvojen i ponovo centrifugiran u puferu za odvajanje sa 1,2-bis[2-[bis(karboksimetil)amino]etoksi]etanom na 12,500 × g tokom 11 minuta (4 stepena). Tako dobijeni polučvrsti depozit koji sadrži nekontaminirane mitohondrije resuspendiran je u puferu za odvajanje (pH 7,4) koji sadrži 75 mM saharoze, 20 mM 2-[4-(2-hidroksietil)piperazin-1- il]etansulfonska kiselina i 215 mM D-manitola [27].

Kasnije je mitohondrijalna frakcija homogenata cijelog mozga korištena za određivanje biokemijskih markera standardnim metodama.

2.11. Procjena mitohondrijalnog kompleksa

2.11.1. NADH: Aktivnost ubikinon oksidoreduktaze.

Aktivnost kompleksa I (NADH dehidrogenaza) kvantificirana je (nmol NADH oksidiran/minuta/mg proteina) slijedeći tehniku ​​Kinga i Howarda [28]. eoksidativno stvaranje NAD+ iz NADH je praćeno redukcijom citokroma c. Mješavina za ispitivanje sastojala se od citokroma c (10.5 mM), 6 mM -nikotinamid adenindinukleotida (DPNH) otopljenog korištenjem 2 mM diglicinskog pufera i diglicinskog pufera (0,2 M, pH 8,5).

Mitohondrijska frakcija koja se može rastvoriti je ugrađena u mešavinu testa da bi se pokrenula reakcija. Varijacija u optičkoj gustoći (OD) na λmax � 550 nm je praćena 120 sekundi.2.11.2. Sukcinat: Aktivnost ubikinon oksidoreduktaze.. Stopa aktivnosti sukcinat dehidrogenaze (kompleks II) kvantificirana je (nmol sukcinat oksidiran/minuta/mg proteina) slijedeći Kingovu tehniku ​​[29].

Oksidaciju jantarne kiseline pokreće lažni prijemnik elektrona, kalijum cijanoferat (K3Fe(CN)6). .e mješavina za analizu koja se sastoji od jantarne kiseline (0.63 M), 1% BSA, K3Fe(CN)6 (0.036 M) i Na+-K+ [PO4]2- pufer (0,23 M, pH 7,6). Mitohondrijska frakcija koja se može rastvoriti je ugrađena u mešavinu testa da bi se pokrenula reakcija. Varijacija u OD na λmax � 420 nm je praćena 120 sekundi.

2.12. Određivanje biomarkera oksidativnog stresa2.12.1. Iobarbiturne kiseline reaktivne supstance (TBARS). Za procjenu TBARS (nmol po mg proteina) [30], kombinacija analize (zaključna količina ∼4 ml) sadrži 0.10 ml homogeniziranog mozak, 1,51 ml 4,6-dihidroksi-2-merkaptopirimidina (0,8%), 200 µl SLS (8,18%), 1,49 ml glacijalacirćetne kiseline (21%, pH 3,51) i 0,71 ml dejonizirane vode ispražnjene grejanje u vodenom kupatilu na 96 stepeni u trajanju od 60 minuta.

Omjer butil alkohol/azabenzen (5,1 ml) u omjeru 15:1 (5,1 ml) je dodat u analizu mješavine koja je centrifugirana na 4,000 × gpower (10 minuta), a supernatant je izdvojen. Dvosmjernim UV1700 spektrofotometrom (Shimadzu, Japan), kromofor malondialdehid-4,6-dihidroksi-2-merkaptopirimidin OD je procijenjen na talasnoj dužini (λmax � 532 nm.5 nm), i 105/M/cm (molarni koeficijent ekstinkcije) primijenjen je za izračunavanje 4,6-dihidroksi-2-merkaptopirimidinskih adukata.

2.12.2. Smanjeni nivoi glutationa (Lc-Glutamil-L-Cysteinyl-glycine). Ellmanova [31] procedura je implementirana za procjenu sadržaja L-glutationa (GSH). .e testna mješavina koja se sastoji od homogenata (1,1 ml) i 1 ml 4% 2-hidroksi-5-sulfobenzojeve kiseline (5-SSA) centrifugirana je (4 stepena) 11 minuta pri 2,500 × g snage .

Kasnije, 2,8 ml Na+-K+[PO4]2- pufera (51,2 mM, pH 7,77) i {{10}},21 ml 3-karboksi{{13 }}nitrofenil disulfid (0,12 mM, pH 7,89) pomiješan je sa gore odvojenim supernatantom (0,12 ml). Tripeptid (µmolGSH po mg proteina) je kvantifikovan na spektrofotometru s dvostrukim zracima UV1700 (λmax � 412 nm). primjena � 1,36 ×104/M/cm.

2.12.3. Aktivnost glutation peroksidaze. Aktivnost glutation peroksidaze (GPx) (EC 1.11.1.9) procijenjena je primjenom tehnike Mohandas et al. [32]. .eanalyze mješavina koja se sastoji od 100 µl 10% homogenata, 100 µl natrijum azida (1,11 mM), 100 µl EDTA (1,13 mM), 40 µl glutation reduktaze-disulfata (GSR, 1 IU/ml) (EC1.8.1.7), 10 µl H2O2 (0,28 mM), 40 µl Lc-glutamil-L-cisteinil-glicina (1,2 mM), 100 µl koenzima II redukovane tetranatrijumove soli (M0.22m ), i 0,12 M 1,49 ml Na+-K+ [PO4]2-pufera (pH 7,4) u cijeloj količini od 2000 µl. Dokumentovan je gubitak tetranatrijuma redukovanog koenzimom II na λmax � 340 nm na temperaturi od 25 stepeni.

Brzina GPx izračunata je kao nmol NADPH oksidiran/minuta/mg proteina koristeći ε � od 6,22 × 103/M/cm.

2.12.4. Aktivnost superoksid dismutaze. Stopa djelovanja SOD (EC1.15.1.1) (jedinice po mg proteina) razmatrana je postupkom Kakkar et al. [33]. Reakciona mešavina je uključivala 0.3 ml homogenata, 100 µl 5-metilfenazinijummetil sulfata (197 µM) i 1,3 ml natrijum-difosfata koristeći 200 µl -nikotinamid adenin dinukleotida (DPNH)(7) zaustavljen 60 sekundi kasnije upotrebom 1 ml glacialCH3COOH u ovoj mješavini.

Generirana količina hromogena je izračunata primjenom jačine boje na λmax� 56{{10}} nm.2.12.5. Catalase Activity. Za procjenu brzine djelovanja katalaze (EC1.11.1.6), OD diskrepancija (λmax � 240 nm) analizirane mješavine (3.0 ml) koja se sastoji od 50 µl uzorka za ispitivanje, 1,22 ml H2O2 (0,03 M) u Na+-K+ [PO4]2- puferu (pH7,91, 0,06 M) i 1,63 ml 0,06 M Na+-K+ [PO4]{{33} } pufer (pH 7,1) je snimljen. Aktivnost katalaze (µmol H2O2 raspadnuta po minuti po mg proteina mozga) izračunata je primjenom ε � 43,6/M/cm [34].

2.12.6. Cijeli nivo nitrita. .e tehnika Sastry et al.[35] je implementiran za procjenu nitrita u cijelom mozgu (μmolper mg proteina mozga). U epruvetama koje su sadržavale 100 µistražnog uzorka, 145 mg amalgama bakar-kadmijum, 500 µl H2CO3 pufera (pH 8,89), 0,44 M 100 µl NaOH i 119,8 mM centrifugirano na 400 µl Zwern04 10 minuta, a suvišna gornja tečnost (supernatant) je izdvojena.

Siva hemikalija (50 µl) je uključena u 100 µl suvišne tečnosti. Posle 60 minuta inkubacije, primećen je OD (λmax � 548 nm talasne dužine) korišćenjem spektrofotometra sa dva snopa UV1700 (Shimadzu). Dizajnirana je tipična krivulja natrijuma dušične kiseline (0,02–0,2 mM), a cijeli nitrit je izjednačen.

2.12.7. Određivanje ukupnih proteina. Ukupni nivo proteina (mg/ml homogenata) je izračunat korištenjem grafika atipične krivine goveđeg serumskog albumina sa jačinom rastvora u rasponu od 0,3 do 3,8 mg/ml. Kombinacija ispitivanja je organizovana sa 250 µl homogenata, 5,1 ml Lowryjevog reagensa, Na+-K+ [PO4]2- pufera (900 µl) i 1,1 N 500 µl FCR-a. Diskrepancija OD je uočena na λmax � 650 nm [36].

2.13. Histopatologija sekcija mozga. Koristeći difuzijsku postavku hranjenu gravitacijom, pacovi su intrakardijalno (preko lijeve komore) difundirani sa 10% neutralnog puferovanog rastvora formaldehida (10% NBF) i akutno anestezirani. Hipokampus i kortikalni sektori su uronjeni u fiksator (10:1 fiksativ: proporcija tkiva), odnosno 10% NBF tokom jedne sedmice (4 stepena), uz 0,04% natriumazida (pH 7,4).

Etil alkohol (70%) je korišćen kao rastvor za pakovanje za fiksne delove tkiva držane na 4 stepena. Rezač mikrotoma (rotacijski tip) je upotrijebljen za dobivanje tankih dijelova (8,0 μm), koji su zatim obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E). .eslides su urađeni trajnim korištenjem DPX-smole, koji su kasnije prekriveni i pregledani optičkim mikroskopom (binokularnim) na ×40 uvećanja.

2.14. Statistička analiza. Vješt eksperimentator zaslijepio je različite režime lijekova koji su davani životinjskim kohortama pomno je pregledao i procijenio podatke. Outliers nisu bili pragmatični (Grubbov test) u podacima, a Kolmogorov–Smirnov test i Levenov test potvrdili su normalnu raspodjelu varijabli i homogenost varijanse (HOV p > 0.05, Levenov test), respektivno.

Inače, u slučaju nejednake varijanse (HOV p < {{0}}.05, Levenov test), Welchova ANOVA (p < 0.05, F′-statistika) i Igre – mogu se primijeniti Howell post hoc testovi. Sredstva normalno raspoređenih varijabli su ispitana i povezana jednosmjernim ili ponovljenim mjerama dvosmjerne analize varijanse (ANOVA). U slučaju ANOVA, rezultati su značajni (p < 0,05) u F-statistici, primijenjeni su testovi višestrukog poređenja, odnosno Tukeyjev HSD (iskrena značajna razlika) ili Bonferroni. Statistička značajnost je procijenjena na p < 0,05, a rezultati su navedeni kao srednja vrijednost-± Standard Error of Mean (SEM).

3. Rezultati

3.1. Rezultati DSM-a na tjelesnu masu (g), ishranu i gutanje vode pacova kojima je primijenjen QA-ICV. Tjelesna težina, unos hrane i vode analizirani su sedmično, počevši od 1. dana. Značajno smanjenje (p < 0.001) tjelesne mase (g), unosa hrane i vode 7, 14. i 21. dana bilo je pragmatično kod pacova koji su bili podvrgnuti QA-ICV injekciji prvog dana u poređenju sa tosham kolegama (Slika 2).

Doziranje DSM-a (100 mg/kg) izazvalo je značajno povećanje tjelesne težine (dan 7p < 0.05, dan 14 p < {{14} }.01, dan 21 p < {{20}}.001), hrana (dan 7p < 0,05, dan 14 p < 0,01, dan 21 p < 0,001) i unos vode (7. dan p < 0.01, dan 14. p < 0.05) kod pacova protiv QA-ICV.

DSM (50 mg/kg) je također značajno oslabio smanjenje tjelesne težine izazvano QA-ICV (21. dan p < 0.05) i unosa hrane (7. dan p < 0.{{20}}1) štakora u odnosu na štakore koji su primili samo QA-ICV injekcije. Štakori tretirani QA-ICV i DNP otkrili su značajnu eskalaciju tjelesne mase (g) (dan 7p < 0.05, dan 14 p < 0.001, dan 21 p < 0,001), hranu (7p < 0,001, dan 14 p < 0,01, dan 21 p < 0,001) i unos vode (7, 14, 21 p < 0,01) u odnosu na pacove koji su ostali izloženi usamljenom QA-ICV.

3.2. Učinak DSM-a na lokomociju, motoričku koordinaciju i hod pacova u odnosu na QA-ICV. U ovoj studiji, QA-ICV ili tretmani lijekovima nisu utjecali na lokomotorne aktivnosti životinja.

QA grupa nije pokazala značajnu promjenu u srednjim brojevima za 5 minuta u aparatu za aktofometar u poređenju sa lažnom grupom (Slika 3(a)). Rotarod i analiza otiska stopala korišteni su za procjenu senzomotornih performansi i hoda štakora.

Rezultati su pokazali da je QA-ICV značajno ometao (p < 0.001) motoričku koordinaciju (Slika 3(b)) i hod (Slika 3(c)) pacova, što se odrazilo smanjenjem latencije pri padu sa osovine koja se okreće i dužina koraka štakora u analizi otiska stopala u poređenju sa tošamskim kolegama.

Grupe QA + DSM50 i QA + DSM100 prikazale su značajno povećanje latencije pada (p < 0.05, p < 0,01) i dužine koraka (p < 0,05, p < 0,001)u odnosu na QA grupu.

Tretman DNP-om značajno je oslabio QA-ICV i izazvao smanjenje latencije pada (p < 0.001) i dužine koraka (p < 0,001) u poređenju sa štakorima kojima je dato QA-ICV sam. Nadalje, tretman DSM-om (100 mg/kg) pokazao je značajno poboljšanje (p < 0,01) u hodu u odnosu na DSM (50 mg/kg) kod pacova podvrgnutih QA-ICV.

For more information:1950477648nn@gmail.com