Smanjenje makrofaga smanjuje patologiju bolesti kod glomerulonefritisa koji ovisi o imunološkom kompleksu

Faktor komplementaH (FH) je ključni regulator alternativnog puta komplementa, kod čovjeka i miša. Ranije su naše studije otkrile da odsustvo FH uzrokuje da miš C57BL6 postane osjetljiv nahronična serumska bolest(CSS) zajedno sa povećanjem ububrežni infiltracija makrofagau poređenju sa kontrolama. Da bismo razumjeli da li povećano zapošljavanje makrofaga (Mϕs) u bubreg je zabijaoflzapaljenje i širenje ozljede, pregledali smo effect od Mϕ iscrpljivanje klodronatom kod FH nokaut miševa sa CSS. Osmonedeljni FHKO miševi su tretirani apoferitinom (4 mg/miš) tokom 5 nedelja i sa vehikulom (PBS) ili klodronatom (50 mg/kg ip, 3 puta nedeljno tokom poslednje 3 nedelje). Administracijaklodronat je smanjio monocite i Mϕs u bubrezimaby>80%. 

Funkcija bubregaprocijenjeno BUN-om i albumin je ostao bliži normalnoj vrijednosti nakon iscrpljivanja Mϕs. Liječenje klodronatom spriječilo je promjenu citokina, TNF i IL-6, te povećanje ekspresije gena faktora rasta vezivnog tkiva (CTGF), TGF -1, matriksna metaloproteinaza-9 (MMP9),fibronhektin, laminin i kolagen kod FHKO miševa sa CSS (P < 0:05). Tretman klodronatom doveo je do relativne zaštite odimuni kompleks- (IC-) posredovana patologija bolesti tokom CSS prema procjenisignifiznatno smanjena glomerularna patologija(GN) i ekstracelularni matriks. Naši rezultati sugeriraju da je aktivacija komplementa jedan od mehanizama koji reguliraju pejzaž makrofaga i timefibrosis. Tačan mehanizam ostaje da se dešifruje. Ukratko, naši podaci pokazuju da je Mϕigraju ključnu ulogu u ICGN-u i Mϕ iscrpljivanjesmanjuje progresiju bolesti.

KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 25% EHINAKOZIDA I 9% AKTEOZIDA ZA FUNKCIJU BUBREGA

1. Uvod

Hronična bolest bubrega(CKD) je globalni zdravstveni problem; Od toga je 10% posredovano imunološkim kompleksom (IC-) i javlja se kod serumske bolesti, infekcija i autoimunih bolesti. [1]. To navodi američki Renal Data System Godišnji izvještajosobe sa CKD"jasno je da su u visokom riziku od smrti" sa 10-putostruko povećanom incidencijom tokom tri decenije u kojima su oboljeli pacijenti izgubili 70% svog životnog vijeka. Prema NIDDK, oko 14% odrasle populacije ima dijagnozu bolesti bubrega, što ga čini 9. vodećim uzrokom smrti [2]. Bubrezi su vrlo osjetljivi na oštećenja posredovana komplementom, posebno u autoimunim i inflamatornim uvjetima [3, 4].

Sistem komplementa učestvuje u urođenim i adaptivnim imunološkim odgovorima i pruža prvu liniju odbrane od mikroorganizama [5, 6]. Sastoji se od tri aktivaciona puta, koji se pokreću na jedinstven način, a sastoje se od više od 30 proteina plazme i ćelija povezanih [7]. Alternativni put je stalno na oprezu i reguliran je proteinima kao što je faktor komplementa H (FH). FH je cirkulirajući protein koji se uglavnom sintetizira u jetri [8]. Miševi s nedostatkom FH (fh-/-) liječeni apoferitinom razvijaju kroničnu serumsku bolest (CSS) koja dovodi do difuznog proliferativnog glomerulonefritisa (GN) unutar 5 sedmica liječenja, dok miševi iz legla C57BL/6 koji imaju dovoljan faktor H (FH) imaju malo glomerularna upala [9]. F4/80+ infiltracija makrofaga se javlja u bubrezima i uočava se oko IC depozita kod fh-/- miševa. Aktivacija komplementa stvara anafilatoksine, C3a i C5a, koji učestvuju u transportu Mϕs na mjesto upale. Inhibicija C5a/C5aR1 signalizacije smanjila je Mϕs u bubregu [10]. U ovoj postavci,povreda bubregaje povezan s infiltracijom bubrega, ali mehanizmi koji mogu biti uključeni u izazivanjepovreda bubregaostaju nepoznati.

Slika 1: FH mijenja gene markera makrofaga u bubrezima miševa sa ICGN-ovisnim o FH. Kvantitativni PCR u realnom vremenu za CD204 i CD206 koristeći mRNA izoliranu iz bubrega nakon 5 sedmica fiziološkog rastvora ili apoferitina. Izraz je normaliziran na GAPDH (n=6/grupa). ∗P < 0:01. Grafikoni prikazuju promjenu gena kod fh-/- miševa tretiranih apoferitinom (n=6) u poređenju sa fh-/- miševima tretiranim fiziološkom otopinom (n=6).

Monociti (Mo) koje stvaraju hematopoetske ćelije [11] migriraju kroz endotel u tkiva, gdje se diferenciraju u Mϕs. Markeri kao što su F4/80, CD11b, CD68 i Fc receptori mogu identifikovati Mϕs. Mϕs su kritično uključeni u oštećenje bubrega, popravku i fibrozu u različitim eksperimentalnim modelima bubrežne bolesti [12, 13]. Nedavno su naše studije pokazale da je povreda bubrega kod ICGN-zavisnog od FH povezana sa bubrežnom infiltracijom Mϕs. Štoviše, prethodne studije su pokazale da inhibicija bubrežne Mϕ infiltracije smanjuje arterijski tlak i sprječava ozljedu glomerula i fibrozu u različitim životinjskim modelima nefropatije [14, 15]. Međutim, prema našim saznanjima, uticaj deplecije Mϕ tokom oštećenja bubrega povezanog sa ICGN-om zavisnim od FH nije obrađen. Stoga je ova studija ispitivala ulogu Mϕs na oštećenje bubrega povezano s ICGN-zavisnim od FH koristeći klodronat liposoma. Klodronat (klodronska kiselina) je bisfosfonat koji se metabolizira u analog ATP koji se ne može hidrolizirati [16]. Naši eksperimenti pokazuju da Mϕs igra ključnu ulogu u gubitku funkcije bubrega u okruženju neregulirane aktivacije komplementa. Stoga, smanjenje Mϕs ili upućivanje Mϕs da pretpostavi fenotip popravke može smanjiti patologiju bolesti i može se terapijski iskoristiti.

2. Materijali i metode

2.1. Eksperimentalne životinje.

Fh−/− soj miševa je generisan i ljubazno ga je obezbedila dr. Matthew Pickering i Marina Botto (Imperijalni koledž iz Londona) i kontinuirano se vraćali na soj C57BL/6 u našoj laboratoriji više od 10 generacija. Miševi sa dovoljnom količinom FH su služili kao kontrola (n=8/grupa). Genotipizacija je izvedena korištenjem pristupa baziranih na PCR-u. Miševi su održavani na temperaturi od 20-22 stepena C u ciklusu osvetljenja od 12 h svetlo-12 h u mraku, u sterilnim, ventiliranim kavezima sa hranom i vodom ad lib. Institucionalni komiteti za negu i upotrebu životinja Univerziteta u Čikagu i Univerziteta u Bufalu odobrili su sve studije.

2.2. Protokol hronične serumske bolesti.

CSS je indukovana kod 6-8 sedmica fH−/− ili miševa divljeg tipa sa dnevnom intraperitonealnom primjenom 4 mg apoferitina konjske slezine (Calzyme Laboratories) bez adjuvansa [10, 17, 18] tokom 5 sedmica. Kontrolne grupe legla primale su istovremeno intraperitonealne injekcije fiziološkog rastvora

2.3. Procjene funkcije bubrega.

Koncentracije azota ureje u krvi (BUN) određivane su pomoću Beckman autoanalyzera (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Koncentracije albumina u urinu mjerene su ELISA kompletom za mišji albumin (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) i normalizirane na kreatinin u urinu izmjeren kolorimetrijski (Stanbio Laboratory, Boerne, TX) kao što je prethodno opisano [19].

Slika 2: Klodronat sve više smanjuje bubrežne makrofage kod miševa sa ICGN zavisnim od FH. Dati su profili protočne citometrije F4/80+ monocita/Mϕs na dan 0, 2, 4 i 7, reprezentativno. Ekspresija F4/80+ ćelija određena je protočnom citometrijom. Podaci su analizirani pomoću softvera FlowJo V10. F4/80+ ćelije se značajno smanjuju u svakoj vremenskoj tački dostižući manje od 10% do 7. dana. Svaka vremenska tačka n=6.

2.4. Histologija.

Bubrezi su ugrađeni u parafin i za malin fiksirani, a generisani su preseci od četiri mikrometra. Presjeci su obojeni periodičnom kiselinom-Schiffom i pregledani od strane bubrežnog patologa (AC) na slijep način. Za svaki slajd, proliferativni glomerulonefritis i glomeruloskleroza su ocijenjeni od 0 do 4 kao što je prethodno opisano [20]. Za imunofluorescentnu mikroskopiju, tkivo bubrega je naglo zamrznuto u 2-metilbutanu prethodno ohlađenom u suvom ledu. Kriostatske sekcije od četiri mikrona obrađene su za imunofluorescentno (IF) bojenje. Presjeci su fiksirani u 4% paraformaldehidu i obojeni sa Alexa488-konjugiranim anti-mišjim C3 (Cappel) i Alexa 555 anti-mišjim IgG. Polukvantitativna ocjena intenziteta bojenja i distribucije od 0 do 4 dobivena je na slijepi način kao što je prethodno opisano [19].

2.5. qRT-PCR.

Sakupljeni su bubrezi, a ukupna RNK ekstrahirana iz tkiva pomoću TRIzol reagensa prema uputama proizvođača (Invitrogen, SAD). cDNA je sintetizovana korišćenjem SuperScript III reverzne transkriptaze (Invitrogen). qRT-PCR je izveden korišćenjem Power SYBR Green PCR Master miksa na ABI 7700 detektoru sekvenci (Applied Biosystems). PCR amplifikacija je izvedena u ukupnoj zapremini od 25 ul koji sadrži 12,5 ul 2x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 6,25 ul vode bez nukleaza, 5 ul cDNA i 1,25 ul odgovarajućih prajmera (IDT). Svi qPCR prajmeri (Tabela 1) dizajnirani su pomoću softvera Primer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research) kako bi se osigurala specifičnost i osjetljivost. Da bismo kvantificirali nivoe mRNA, normalizirali smo ekspresiju ciljnih gena na gliceraldehid-3- fosfat dehidrogenazu. Relativni nivoi ekspresije mRNA su izračunati korišćenjem 2 − ΔΔCt metode i normalizovani su na nivoe ekspresije GAPDH.

2.6. Statistika.

Svi rezultati su srednji ± SD od najmanje {{0}} miševa u svakoj grupi. Za poređenje 2 grupe pomoću GraphPad Prism 5 korišćen je ili neupareni dvostrani test (podaci sa normalnom distribucijom) ili Mann-Whitney U test (podaci bez normalne distribucije). Statistička značajnost se izražava na sljedeći način: ∗P < 0:05; ∗∗P < 0:01; i ns: nije značajno.

Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Kupite za više detalja o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop