Aktivacija makrofaga pomoću saharida niske molekularne težine iz Cistanche Deserticola

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

［ Abstracak］

Istražiti učinak imunološke aktivacije i mehanizam saharida niske molekularne težine izCistanche deserticola(LMSC) na peritonealnim makrofagima miša, RAW264. 7 ćelija. RAW264. 7 ćelija je podijeljeno u normalnu kontrolnu grupu, LPS pozitivnu kontrolnu grupu i LMSC tretirane grupe. RAW264. 7 ćelija je tretirano različitim koncentracijama LMSC od 3,91 do 62,5 g·L - 1. Neutralni crveni test je korišćen za otkrivanje fagocitne aktivnosti makrofaga. Oslobađanje NO detektovano je upotrebom NO kompleta i nivoima ekspresije proteina povezanih sa aktivacijom makrofaga (TNF-, IL-6, IKK, p-IKK, IκB, p-IκB, NF-κB i p-NF-κB) otkriveni su Western blot-om. Rezultati su pokazali da LMSC ima aktivacijski efekat na makrofage; može značajno povećati oslobađanje NO u RAW264. 7 ćelija i podstiču ekspresiju citokina TNF- i IL-6. Štaviše, LMSC je značajno povećao fosforilaciju IKK, IκB, i NF-κB p65. Nadalje, manitol je jedan od glavnih sastojaka u LMSC značajno pojačao fagocitnu aktivnost makrofaga. Ovi rezultati su pokazali da LMSC može aktivirati makrofage povećanjem regulacije NF-κB signalnog puta, a manitol može biti jedna od glavnih aktivnih komponenti u LMSC.

［Ključne riječi］ Saharidi niske molekularne težine; Cistanche deserticola; imunološka aktivacija; makrofag; inflamatorni faktor; NF-κB

Cistanche deserticola YC Maje biljka koja pripada roduCistanche deserticolaYC Ma. Njegova mesnata stabljika može se koristiti kao lijek. Ima funkciju hranjenja janga bubrega, hranjive esencije i krvi, te vlaženja crijeva. Poznat je kao "pustinjski ginseng". Hemijske komponente Cistanchea uključuju feniletanoidne glikozide, iridoidne glikozide, šećere, lignane i mnoge druge vrste. Moderne farmakološke studije su otkrile da Cistanche ima mnogo bioloških aktivnosti kao što su neuroprotekcija, antitumorska, imunološka regulacija, protuupalna i antioksidativna [1]. Istraživanja su pokazala da dekocija Cistanchea i polisaharida može značajno poboljšati fagocitnu sposobnost i funkciju izlučivanja makrofaga [2-3]. Međutim, ne postoji izvještaj o istraživanju aktivnosti njegovih niskomolekularnih ugljikohidrata. Stoga je ova studija koristila in vitro sistem kulture RAW264. 7 peritonealnih makrofaga miša za istraživanje imunomodulatorne aktivnosti i povezanih mehanizama Cistanche niskomolekularnih ugljikohidrata. Ovo istraživanje može pružiti više eksperimentalnih dokaza za sveobuhvatno razumijevanjeCistancheov imunomodulatorni efekatu budućnosti, kako bi dalje usmjeravao njegovu kliničku primjenu.

Cistanche deserticola ima mnogo efekata, kliknite ovde da saznate više

1. Materijali

RAW264. 7 ćelija je kupljeno od Centra za ćelije Kineske akademije medicinskih nauka; fetalni goveđi serum (FBS) nabavljen je od PAN Biotech, Njemačka; antibiotici i DMEM medijum su kupljeni od Zhongke Machen Technology Co., Ltd. Lipopolisaharidi iz Escherichia coli O55:B5 (LPS) su nabavljeni od kompanije Sigma, SAD. Komplet za azot oksid (NO) kupljen je od Nanjing Jiancheng Instituta za bioinženjering. ECL hemiluminiscencijski komplet je kupljen od Thermo Fisher-a, SAD; antitelo je kupljeno od Cell Signaling Technology, SAD; Ukupne glikozide Cistanche Cistanche, šećere niske molekularne težine Cistanche i polisaharide Cistanche samostalno je proizvela naša istraživačka grupa. Maseni udio cistanche ukupnih glikozida iznosio je 78,76 posto. Maseni udio šećera niske molekularne težineCistanche deserticolaje 58. 00 posto i maseni udio odCistanche deserticolapolisaharida je 65,24 posto. Tanon-5200Multi gel split sistem za snimanje je kupljen od Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd.; Čitač mikroploča Sunrise-Basic kupljen je od kompanije TECAN.

2. Metoda

2. 1 Neutralna crvena metoda za mjerenje fagocitne aktivnosti makrofaga

Uzmite mišje peritonealne makrofage u logaritamskoj fazi rasta, nakon tripsinizacije, prebrojite ćelije, podesite broj ćelija na 5 × 104 ćelija/mL i inokulirajte ih u 96-pločicu za ćelijsku kulturu, 100 μL/jažici , na 37 stepeni Uzgojno pod uslovima 5 procenata CO2, nakon što se ćelije prianjaju na zid, odbacite supernatant kulture, dodajte DMEM medijum (10 procenata FBS plus 1 procenat P /S), LPS (1 mg·L － 1) i Cistanche cistanche odnosno Ukupni glikozidi,Cistanchekultivisani su ukupni polisaharidi i šećeri niske molekularne težine Cistanche cistanche (3,91 ~ 62,5 g·L -1, respektivno, filtrirani filterskom membranom prije primjene). Nakon kultivacije u trajanju od 48 sati, dodajte 100 μL 0,075 posto neutralne crvene fiziološke otopine soli u svaku jažicu, nastavite kultivaciju 4 sata, aspirirajte supernatant, isperite 3 puta sa PBS, dodajte ćelijski lizat (glacijalna octena kiselina -etanol 1:1) 100 μL, stavite na 4 stepena na 2 h i izmjerite apsorbanciju (A540 nm) nakon što su ćelije lizirane.

2. 2 Detekcija količine oslobađanja NO u ćelijskom supernatantu

Inokulirajte RAW264. 7 ćelija u 48- ploču (1 × 105 ćelija/mL, 500 μL/jamici), aspirirajte medij ćelijske kulture nakon inkubacije preko noći, dodajte DMEM medij (10 posto FBS plus 1 posto P /S), 500 μL svakog od LPS (1 mg·L -1) i Cistanche cistanche ukupnih glikozida, ukupnih polisaharida i šećera niske molekularne težine (3,91 ~ 62,5 g·L -1, respektivno). Nakon 24 sata indukcione kulture, supernatant je sakupljen. Odredite koncentraciju NO u ćelijskom supernatantu svake grupe pomoću NO kompleta, slijedite upute i konačno detektirajte apsorbanciju (A570 nm) čitačem mikroploča

2. 3. Western blot

Inokulirajte RAW264. 7 ćelija u 6-pločicu, aspirirajte medij ćelijske kulture nakon inkubacije preko noći, dodajte DMEM medijum (10 procenata FBS plus 1 procenat P /S), LPS (1 mg·L － 1) iCistancheUkupni polisaharidi i šećeri niske molekularne težine (3,91 ~ 62,5 g·L -1) bili su po 2 mL, a supernatant je odbačen nakon 24 sata indukcijske kulture. Ćelije su dva puta isprane sa PBS i odbačene. Nakon tripsinizacije, ćelije se pipetiraju. Centrifugirajte, uklonite supernatant, dodajte 100 μL NP40 pufera za lizu i lizirajte na ledu 40 min. Nakon centrifugiranja, uzet je supernatant, a koncentracija proteina je određena BCA metodom, a koncentracija proteina svakog histona je ravnomjerno podešena. Uzmite istu količinu uzoraka proteina i odvojite ih na 12 posto SDS-PAGE pod stalnim pritiskom. Zatim upotrijebite Bio-Rad spremnik za prijenos elektroforeze za prijenos membrane sa konstantnom strujom od 350 mA u trajanju od 1 sata i prebacite protein na PVDF membranu (predtretman PVDF membrane: potopite u metanol i uravnotežite s prijenosnim puferom). Nakon blokiranja sa 5% obranog mlijeka (konfigurirano sa TBST koji sadrži 0,1% Tween-20) u trajanju od 1 h na sobnoj temperaturi, membrana je isprana 3 puta sa TBST, a membrana je inkubirana u razrjeđivaču primarnog proteina antitijela na 4 stepen preko noći. Membrana je isprana 3 puta sa TBST svaki drugi dan, a odgovarajući razblaživač je dodan da se inkubira 1 h. Membrana je isprana 3 puta sa TBST, a trake su razvijene sa ECL hemiluminiscencijskim razvijačem.

2. 4 analiza podataka

Podaci su izraženi kao x ± s, a značajnost razlike je testirana pomoću statističkog softvera GraphPad Prism 6 za jednosmjernu analizu varijanse. Uzmi P<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Rezultati

3. 1. Efekti šećera niske molekularne težine Cistanche cistanche, ukupnih glikozida i ukupnih polisaharida na fagocitnu aktivnost RAW264. 7 ćelija

Istraživanje o hemijskim komponentama Cistanchea to pokazujeCistancheuglavnom sadržifeniletanoidni glikozidi, iridoidni glikozidi i ugljikohidrati. U ovom eksperimentu odabrani su ukupni glikozidi cistanhe (uključujući glikozide fenetil alkohola i iridoidne glikozide), niskomolekularni šećeri i šećeri. Istražena su tri aktivna mjesta ukupnih polisaharida zbog njihovog djelovanja na aktivaciju RAW264. 7 ćelija. I Cistanche cistanche polisaharid i cistanche niskomolekularni šećer mogu značajno povećati fagocitnu aktivnost RAW264. 7 ćelija, ali se fagocitna aktivnost grupe davanja ukupnih glikozida ne mijenja značajno. Osim toga, lijek pozitivne kontrole LPS također je značajno poboljšao fagocitnu aktivnost RAW264. 7 ćelija, kao što je prikazano na slici 1. Gore navedeni rezultati sugeriraju da šećeri niske molekularne težine i polisaharidi Cistanchea mogu imati učinak aktivacije RAW264. 7 ćelija.

3. 2. Utjecaj Cistanche ukupnih glikozida, niskomolekularnih šećera i ukupnih polisaharida na sadržaj dušikovog oksida (NO) u ćelijskom supernatantu

U cilju daljeg istraživanja efekta aktivacije tri aktivna mjesta Cistanchea na RAW264. 7 ćelija, određen je sadržaj NO u ćelijskim supernatantima stimulisanim različitim lekovima. Rezultati su pokazali da je oslobađanje NO u LPS grupi značajno veće nego u slepoj kontrolnoj grupi (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Cistanchenije imao značajan efekat. Gore navedeni rezultati pokazuju da i polisaharidi i šećeri niske molekularne težine Cistanchea mogu promovirati oslobađanje NO iz RAW264. 7 ćelija. Među njima je posebno značajan učinak šećera niske molekularne težine Cistanchea, kao što je prikazano na slici 2.

3. 3. Utjecaj šećera niske molekularne težine Cistanche cistanche na ekspresiju TNF- i IL-6 proteina u RAW264. 7 ćelija

TNF- je važan inflamatorni medijator koji se pojavljuje u procesu aktivacije RAW264. 7 ćelija, koje mogu promovirati sintezu i oslobađanje drugih citokina (kao što je IL-6). Rezultati su pokazali da je ekspresija TNF-a i IL-6 značajno povećana nakon što je stimulisan šećer niske molekularne težine Cistanche cistanche, što sugerira da niskomolekularni šećer Cistanche može promovirati ekspresiju TNF-a - i IL-6 u RAW264. 7 ćelija, čime se aktivira fagocitoza ćelijskog imuniteta, vidi sliku 3.

3. 4. Regulatorni učinak šećera niske molekularne težine Cistanche cistanche na signalni put IKK /IκB /NF-κB

U cilju istraživanja potencijalnog mehanizma Cistanche cistanche šećera niske molekularne težine u aktiviranju RAW264. 7 ćelija, autori su istraživali njegove regulatorne efekte na IKK /IκB /NF-κB klasični signalni put. Cistanche cistanche niskomolekularni šećer može značajno povećati fosforilaciju NF-κB i fosforilaciju njegovih uzvodnih ključnih signalnih proteina IKK i IκB, te smanjiti ekspresiju ukupnog IκB proteina, što ukazuje da ima aktivirajući učinak na IKK / IκB /NF-κB signalni put. Lijek pozitivne kontrole LPS također ima sličan regulatorni učinak. Ukratko, šećeri niske molekularne težine Cistanchea mogu aktivirati IKK /IκB /NF-κB signalni put, uzrokujući tako sintezu i oslobađanje citokina kao što su TNF- i IL-6, i konačno uzrokujući imunološki aktivacija RAW264. 7 ćelija, vidi sliku 4.

3. 5. Skrining aktivnih sastojaka sa efektom aktiviranja makrofaga u Cistanche niskomolekularnim šećerima

Naša laboratorija je analizirala niskomolekularne šećere sadržane uCistancheu ranoj fazi i utvrdio da uglavnom sadrži manitol (16,53 posto), saharozu (8,34 posto), fruktozu (25,38 posto), i glukozu (7,75 posto), i druge sastojke. Dakle, autor je koristio neutralnu crvenu metodu za skrining efekta aktivacije gornjih komponenti na makrofage. Manitol može značajno povećati fagocitnu aktivnost makrofaga na način ovisan o dozi, dok efekti ostalih komponenti nisu značajni. Ovo sugerira da manitol može biti jedna od ključnih aktivnih komponenti u šećerima niske molekularne težine Cistanche cistanchea za aktiviranje makrofaga, kao što je prikazano na slici 5.

4. Diskusija

Prijavljeno je da Cistanche cistanche, parazitska biljka iz porodice Lydanaceae, ima imunomodulatorne efekte, pa bi trebalo da sadrži imunomodulatorne supstance. U ovom eksperimentu, autor je pregledao fagocitnu aktivnost mišjih peritonealnih makrofaga na različitim pročišćenim dijelovimaCistanchei otkrili da šećeri niske molekularne težine i polisaharidi Cistanchea imaju učinak aktivacije makrofaga, ali ukupni glikozidi Cistanchea nisu očigledni. Istovremeno, autor je otkrio da šećeri niske molekularne težine mogu aktivirati makrofage u nižim koncentracijama, pa su autori odabraliCistanchešećere niske molekularne težine kao fokus kasnijih istraživanja.

Ispitujući uticaj cistanche šećera niske molekularne težine na ekspresiju citokina TNF- i IL-6, autori su otkrili da niskomolekularni cistanche šećer značajno povećava ekspresiju TNF- i IL-6, što dalje je dokazao da niskomolekularni cistanche šećer ima uticaj na miševe. Peritonealni makrofagi imaju aktivirajući efekat. Stoga je autor dalje istraživao njegov potencijalni mehanizam djelovanja. Istražite

Pokazano je da bakterijski lipopolisaharid (LPS) može inducirati aktivaciju mišjih makrofaga i glijalnih ćelija miša putem signalnih puteva kao što su JAK2/STAT3, NF-κB, p38/ERK i MAPK [4-8]. NF-κB put je prepoznat kao klasičan put, pa su signalni proteini na ovom putu testirani u ovom eksperimentu. Rezultati su pokazali da šećeri niske molekularne težine Cistanchea mogu značajno povećati fosforilaciju NF-κB i fosforilaciju ključnih uzvodnih signalnih proteina IKK i IκB, što sugerira da šećeri niske molekularne težineCistanchemože aktivirati mišje peritonealne divove preko IKK /IκB /NF-κB signalnog puta. Ćelije faga oslobađaju upalne citokine, a zatim igraju ulogu u aktiviranju ćelijskog imuniteta.

U ranoj fazi laboratorije, hemijski sastav ekstrakta šećera niske molekularne težineCistanche deserticolaje sistematski analiziran. Utvrđeno je da šećeri niske molekularne težine uglavnom sadrže monomere kao što su manitol, saharoza, fruktoza i glukoza. Dalja istraživanja su pokazala da manitol može značajno poboljšati fagocitnu aktivnost makrofaga. Stoga se nagađa da bi manitol mogao biti ključna komponenta šećera niske molekularne težine koja aktivira staničnu imunološku funkciju.

Ukratko, ova studija je koristila makrofage u sistemu Vitro kulture i otkrila da su šećeri niske molekularne težineCistancheimaju značajan aktivirajući učinak na makrofage i mogu aktivirati mišje peritonealne makrofage kroz NF-κB signalni put, a zatim igrati ulogu. Manitol u šećerima niske molekularne težine može igrati važnu ulogu u aktiviranju fagocitne aktivnosti makrofaga.

Reference

[1] Tu Pengfei, Guo Yuhai. Tehnike uzgoja pustinjske Cistanche i njenog domaćina Tamarixa [M]. Peking: Science Press, 2015:31.

[2] Gao Xiaoxia, Chen Jun, Peng Yanli. Istraživački pregled farmakoloških efekataCistanche deserticolapolisaharid [J]. Hrana i lijekovi, 2015, 17(2):136.

[3] Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan, et al. Makrofagna aktivacija polisaharida Cistanche [J]. Kineski farmakološki bilten, 2009, 25(6):787.

[4] Liu Zhongyuan, Li Yanping. Biološka aktivnost i mehanizam bakterijskog lipopolisaharida [J]. Medical Science Review, 2010, 16(2):166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao, et al. LPS kroz p38 /MAPK put i NF-κB aktivacija indukuje ekspresiju HIF-1 u RAW264. 7 ćelija [J]. Časopis medicinskog univerziteta Chongqing, 2016, 41(10): 1033.

[6] Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen, et al. JAK2/STAT3 signalni put je uključen u lipo poli Šećerom indukovanu aktivaciju mikroglije［J］. Časopis Trećeg vojnomedicinskog univerziteta, 2009, 31(12):1119.

[7] Song Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin, et al. Mulbascum glikozidi inhibiraju upalu BV-2 mikroglije izazvanu lipopolisaharidom i njen mehanizam [J]. Kineski časopis tradicionalne kineske medicine, 2016, 41(13): 2506.