Lizozomalna lipidna peroksidacija reguliše imunitet tumora

Lizozomalna inhibicija izazvana inhibitorima palmitoil-protein tioesteraze 1 (PPT1) kao što je DC661 može dovesti do smrti ćelije, ali mehanizam za to nije u potpunosti shvaćen. Programirani putevi ćelijske smrti (autofagija, apoptoza, nekroptoza, feroptoza i piroptoza) nisu bili potrebni da bi se postigao citotoksični efekat DC661. Inhibicija katepsina, ili kelacija gvožđa ili kalcijuma, nije spasila DC661-indukovanu citotoksičnost. Inhibicija PPT1 inducirala je lizosomalnu lipidnu peroksidaciju (LLP), što je dovelo do permeabilizacije lizozomske membrane i ćelijske smrti koju je mogao poništiti antioksidans N-acetilcistein (NAC), ali ne i drugi antioksidansi lipidne peroksidacije. Lizozomalni cisteinski transporter MFSD12 bio je potreban za intralizosomalni transport NAC-a i spašavanje LLP-a. Inhibicija PPT1 proizvela je ćelijsku intrinzičnu imunogenost s površinskom ekspresijom kalretikulina koja se mogla poništiti samo pomoću NAC-a. DC661-liječene ćelije primaju naivne T ćelije i povećavaju toksičnost posredovanu T ćelijama. Miševi vakcinisani DC661-tretiranim ćelijama izazvali su adaptivni imunitet i odbacivanje tumora kod "imunoloških vrućih" tumora, ali ne i kod "imunoloških hladnih" tumora. Ovi nalazi pokazuju da LLP pokreće lizozomalnu ćelijsku smrt, jedinstveni imunogeni oblik ćelijske smrti, ukazujući na put do racionalnih kombinacija imunoterapije i lizozomalne inhibicije koje se mogu testirati u kliničkim ispitivanjima.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

Uvod

Uz ohrabrujuću aktivnost u kliničkim ispitivanjima koja uključuju lizosomalni inhibitor hidroksihlorokin (HCQ) (1), identifikaciju palmitoil-protein tioesteraze 1 (PPT1) kao molekularne mete derivata hlorokina (2) i lansiranje novih inhibitora PPT1 u kliničku studijama (3, 4), postoji potreba da se razume mehanizam kojim lizozomalni inhibitori izazivaju ćelijsku smrt i efekat lizozomalne inhibicije na imunitet tumora. Kanonski mehanizam lizozomalne ćelijske smrti opisan za HCQ uključuje permeabilizaciju lizozomske membrane (LMP), curenje katepsina i aktivaciju apoptoze posredovane kaspazom (5, 6). Ranije smo pokazali da lizosomalni inhibitor DC661 prodire u ćelije u kiselom tumorskom mikrookruženju i lokalizuje se na lizosom efikasnije od HCQ (2, 7). DC661 proizvodi snažnu ćelijsku smrt u mnogim ćelijskim linijama raka (2). DC661 vezuje i inhibira PPT1, dekiseli lizozom i inhibira autofagiju. DC661 takođe indukuje LMP i povećava nivoe cijepane kaspaze 3 (2, 7). Poslednjih godina definisani su novi mehanizmi ćelijske smrti koji imaju imunogene posledice i uključuju nekroptozu, feroptozu i piroptozu (8). Pokazalo se da autofagija zavisna od lizosoma razgrađuje MHC klasu I (9), kao i komponente imunoproteasoma (10), što sugerira da inhibicija autofagije može poboljšati procesiranje antigena. Međutim, imunogeni efekti lizosomalne inhibicije i smrti ćelije nisu u potpunosti okarakterisani. Kako bismo riješili ovaj jaz u znanju, istražili smo efekte DC661 na kanonske mehanizme ćelijske smrti kako bismo utvrdili da li je lizosomalna ćelijska smrt njegov oblik ćelijske smrti ili jednostavno preteča jednog od drugih utvrđenih mehanizama. Otkrili smo da HCQ i DC661 induciraju značajno povećanje samo malog broja proteina u proteomu melanoma, a većina njih su proteini povezani s autofagijom i apoptozom. Inhibitori programirane ćelijske smrti (apoptoza, nekroptoza, feroptoza i piroptoza) nisu ublažili citotoksične efekte nakon lizozomskog oštećenja od strane DC661. Lizosomalna lipidna peroksidacija (LLP) je glavni pokretač ćelijske smrti izazvane LMP-om povezane s ekspresijom kalretikulina (CALR) na površini ćelije. Ovaj oblik ćelijske smrti može se preokrenuti samo upotrebom antioksidansa N-acetilcisteina (NAC). Aktivnost NAC-a je oslabljena inhibicijom uvoznika lizozomskog cisteina MFSD12. LLP je izazvao imunogene fenotipove koji potiču ubijanje posredovano T ćelijama. Ovi nalazi pokazuju da je lizosomalna stanična smrt potencijalno jedinstven oblik imunogene stanične smrti.

cistanche biljka koja povećava imuni sistem

Rezultati

Lizozomalna inhibicija izaziva značajne promjene u proteomu povezane s autofagijom i apoptozom. Da bismo utvrdili citotoksični efekti lizozomalnih inhibitora, procijenili smo održivost A375P melanoma, RKO karcinoma debelog crijeva i MIA PaCa{1}} ćelijskih linija karcinoma pankreasa tretiranih vakuolarnim inhibitorom H+-ATPaze bafilomicinom-A1 (1 00 nM); PPT1 inhibitori DC661 (3 μM) ili HCQ (10 μM ili 30 μM); palmitat mimetik heksadecil sulfonil fluorid (HDSF; 60 μM); inhibitori katepsina pepstatin A (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/mL) ili PepA+E64; i disruptor lizozomalne membrane Leu-Leu metil ester hidrobromid (20 μM) tokom 48 sati. Samo bafilomicin-A1 i DC661 izazvali su značajno smanjenje vijabilnosti ćelija preko ćelijskih linija raka (slika 1A i dopunska slika 1A; dodatni materijal dostupan na internetu uz ovaj članak; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), pri čemu proizvodi DC661 dublje smanjenje vitalnosti ćelija od bafilomicina-A1. Na osnovu ovih podataka i farmakoloških svojstava derivata hlorokina nalik lekovima, usredsredili smo našu studiju na derivate hlorokina kao alate za razumevanje lizosomske ćelijske smrti. Nepristrasna globalna proteomska analiza primijenjena je na ćelije melanoma A375P tretirane sa DC661 (3 μM) ili manje potentnim HCQ (10 μM ili 30 μM) tokom 24 sata. Od 4.264 kvantifikovana proteina visoke pouzdanosti, samo 87 i 55 proteina je značajno povećano sa DC661 (3 μM) i HCQ (30 μM), respektivno; dodatno, 14 i 15 proteina je značajno smanjeno sa DC661 (3 μM) i HCQ (30 μM), respektivno (apsolutna promjena puta veća od 2; q < 0,05) sa DC661 (3 μM) ili HCQ (30 μM), respektivno , u poređenju sa kontrolom vozila. Niža doza HCQ (10 μM) nije pokazala značajne promjene proteina u poređenju sa kontrolom nosača. Top 50 proteina koji su značajno povećani nakon tretmana DC661 bili su uglavnom povezani s autofagijom i apoptozom, a slične promjene su uočene i za veće doze HCQ (slika 1B). Iz ovih razloga, odlučili smo da fokusiramo dalje studije na moćniji DC661. Primjeri nekih od najvećih promjena proteina povezanih s autofagijom i apoptozom bili su porezno1-vezujući protein 1 (TAX1BP1; povećan 15-put); BCL2-protein 3 u interakciji (BNIP3; povećan 6-put); susjed proteina BRCA1 gena 1 (NBR1; povećan 12-put); sekvestozom-1 (SQSTM1/p62; povećan 5-put); koaktivator nuklearnog receptora 4 (NCOA4; povećan 3-put); i LC3B (MAP1LC3B; povećan 3-put). Apolipoprotein B-100 (APOB; povećan 66-put) je izveden iz fetalnog telećeg seruma i nije dalje proučavan. Imunobloting je potvrdio da tretman sa DC661 ili višim koncentracijama HCQ dovodi do značajnog povećanja ekspresije kargo receptora autofagije NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 i NCOA4 na način ovisan o dozi i vremenu (dodatna slika 1, B i C). CRISPR/Cas9 KO PPT1 u A375P ćelijama fenokopirao je efekte DC661 na ove proteine ​​u poređenju sa njihovim WT kolegama (dopunska slika 1D). Međutim, ekspresija kargo receptora autofagije i relativna povećanja izazvana tretmanom DC661 bili su varijabilni kod karcinoma debelog crijeva, raka gušterače i drugih ćelijskih linija melanoma u kojima DC661 pokazuje citotoksičnost (dodatna slika 1E). Ovo sugerira da sami kargo receptori autofagije, iako su povećani na nivou proteina, vjerovatno neće biti odgovorni za ćelijsku smrt nakon tretmana DC661. Da bismo to potvrdili, fokusirali smo se na autofagijske cargo receptore TAX1BP1 i BNIP3 jer imaju poznate proapoptotičke efekte u ćelijama raka (Slika 1C). TAX1BP1 je autofagijski cargo adapter (11) i također reguliše apoptozu izazvanu inhibitorima sinteze proteina ili agensima koji oštećuju DNK u ćelijama raka (12). Obaranje TAX1BP1 siRNA (Slika 1D) nije uticalo na DC661-indukovanu citotoksičnost u kratkoročnim (Slika 1E) i dugoročnim testovima održivosti (Slika 1F). Ovi rezultati su pokazali da TAX1BP1 ne igra bitnu ulogu u DC{126}posredovanoj citotoksičnosti. BNIP3 je proapoptotički protein koji narušava bioenergetiku mitohondrija i reguliše mitofagiju (13). Efikasno uništavanje BNIP3 (Slika 1G) nije uticalo na DC{131}}indukovanu citotoksičnost (Slike 1, H i I). Ovi rezultati su pokazali da su citotoksični efekti DC661 nezavisni od ekspresije BNIP3. Zatim smo proučavali efekte iscrpljivanja ćelija kanonskih gena autofagije potrebnih za proizvodnju autofagosoma na efikasnost DC661 uništavanjem unc-51 poput kinaze koja aktivira autofagiju 1 (ULK1) i gena 7 povezanog sa autofagijom (ATG7). Efikasno uništavanje ULK1 ili ATG7 (dodatna slika 2, A i B) inhibirala je autofagični tok (dopunska slika 2C), ali nije uticala na citotoksičnost izazvanu DC661- (slika 1, J–M). Ovi rezultati su pokazali da odsustvo suštinske mašinerije autofagije ne poništava citotoksične efekte DC661. Lizozomalna inhibicija DC661 inducira višestruke programirane puteve ćelijske smrti. Kanonsko gledište je da je smrt lizozomske ćelije posljedica apoptoze (5). Imunobloting je otkrio da je tretman DC661 rezultirao aktivacijom kaspaze-3, -7 i -9 i cijepanjem PARP-1, potvrđujući da je DC661 aktivirao apoptozu (slika 2A). Inhibitor pan-kapaze Z-VAD-FMK spriječio je aktivaciju kaspaze pomoću DC661, ali nije inhibirao akumulaciju LC3B i p62, pokazujući da se aktivacija apoptoze i blokada autofagije mogu odvojiti nakon lizozomske inhibicije (slika 2B). Blokiranje apoptoze sa ZVAD-FMK nije pojačalo ili ograničilo citotoksičnost DC661, što sugerira da je apoptoza neophodna za lizozomalnu ćelijsku smrt (Slika 2, C i D). Citotoksični efekti DC661 bili su slični u Bax/Bak double-KO primarnim ćelijama koštane srži nesposobnim da se podvrgnu apoptozi i WT ćelijama (slika 2E). Blokada apoptoze nije uticala na DC{171}}indukovanu citotoksičnost u ćelijama raka debelog crijeva i pankreasa (dodatna slika 2, D–F). Budući da smo otkrili da je apoptoza neophodna za ćelijsku smrt izazvanu DC661-, istražili smo da li DC661 inducira nekroptozu, drugi oblik programirane ćelijske smrti reguliranu protein kinazom (RIPK) u interakciji s receptorom i proteinom nalik domeni kinaze miješane loze ( MLKL). Nivoi fosforiliranih i aktiviranih oblika RIPK i MLKL povećani su nakon tretmana DC661 sa 0,1-1 μM (Slika 2F). Kod 3 μM DC661 izostao je fosforiliran RIPK1, ali je postojao fosforiliran MLKL, što sugerira da bi, pri ovoj višoj koncentraciji, mogli biti uključeni dodatni oblici ćelijske smrti. Predtretman inhibitorima RIPK1 nekrostatinima-1 ili nekrostatinima-1 ili MLKL inhibitorom nekrosulfonamidom spriječio je fosforilaciju RIPK1 nakon tretmana DC661 (1 μM) u ćelijama melanoma (slika 2G), ali nije uspio{{1192 DC spasiti }}indukovana citotoksičnost u ćelijama melanoma (slika 2H) ili raka debelog creva ili ćelija raka gušterače (dodatna slika 2G). Ovi nalazi ukazuju na to da je nekroptoza aktivirana, ali neophodna za DC{195}posredovanu ćelijsku smrt.

Slika 1. Inhibicija lizozomalne autofagije izaziva značajne promjene u proteinima apoptoze i autofagije. (A)

Lizozomi su jedno od glavnih mjesta skladištenja željeza. Disregulirani intracelularni metabolizam željeza u kombinaciji sa smanjenim redukcijskim kapacitetom može izazvati neapoptotičku smrt stanice poznatu kao feroptoza. Obilježje feroptoze je pojačana regulacija prostaglandin-endoperoksid sintaze 2 (PTGS2), homologa 1 regulatora transporta katjona (CHAC1) i cisteinil-tRNA sintetaze (CARS) (14). Sva 3 ova markera feroptoze su transkripcijski povećana tretmanom DC661 (slika 3A), što sugerira da lizozomalna inhibicija inducira feroptozu. DC661 je izazvao pomak fluorescencije u ćelijama A375P tretiranim C11–BODIPY, što ukazuje na peroksidaciju lipida, karakterističnu za feroptozu. Ovaj DC661-indukovani pomak je značajno obrnut u prisustvu inhibitora feroptoze ferostatina-1 ili roksstatina na usnama-1 koji su davani u efektivnoj koncentraciji (slika 3B i dopunska slika 3A), što dalje ukazuje da DC661 indukovana feroptoza. Međutim, inhibicija feroptoze nije spasila citotoksičnost povezanu sa DC661 (Slika 3, C i D). Kotretman ćelija raka kelatorom gvožđa deferoksaminom (DFO) i DC661 nije spasio citotoksičnost DC661 (Slika 3E). Tretman ferostatinom-1, roksstatinom usana-1 ili DFO nije spasio DC661 inhibiciju kratkoročne održivosti ili dugotrajnog klonogenog rasta ćelija raka melanoma, debelog crijeva i gušterače (dopunska slika 3, B –E i Dodatna slika 4, A–D). Ovi podaci pokazuju da je feroptoza aktivirana, ali neophodna za DC{31}posredovanu ćelijsku smrt. Piroptoza je oblik programirane stanične smrti povezane s upalnim odgovorom koji uključuje aktivaciju kaspaza koje obrađuju gastrin (GSDM), omogućavajući formiranje pora na plazma membrani i naknadno oslobađanje molekularnih uzoraka povezanih s oštećenjem, kao što je visoka pokretljivost grupna kutija 1 (HMGB1). Tretman DC661 u višestrukim ćelijskim linijama melanoma (A375P, A375, WM35 i WM793) rezultirao je aktivacijom inicijatorske kaspaze-8 i -9 i kaspaze egzekutora-7, tipične za piroptozu, i proizvedenih cijepanje GSDME pune dužine, sličnog obima poznatom induktoru piroptoze PLX4720 i PD0325901 (dodatna slika 5A). DC661 je proizveo jače ekstracelularno oslobađanje HMGB1 od poznatog induktora piroptoze, BRAF i MEK inhibicije u 1% FBS (15), što odražava funkcionalnu posljedicu aktivirane piroptoze. Zatim smo testirali da li bi inhibicija piroptoze pomoću GSDME KO poboljšala citotoksične efekte DC661. Tretman DC661 inducirao je akumulaciju LC3II i SQSTM1/p62 i aktivaciju kaspaze, ali oslobađanje HMGB1 je gotovo potpuno poništeno u GSDME-KO WM35 ljudskim ćelijama, pokazujući da je postignuta funkcionalna posljedica inhibicije piroptoze (Slika 3F). Međutim, tretman DC661 je proizveo jednaku citotoksičnost u YUMM1.7 WT, praznom vektoru (EV) i Gsdme KO1 i KO2 ćelijama u 10% i 1% FBS uslovima (Slika 3G i Dodatna slika 5B). Jedan uobičajeni ishod višestrukih oblika ćelijske smrti je oslobađanje LDH. DC661 je proizveo značajno povećanje oslobađanja LDH, a to se nije moglo poništiti apoptozom, nekroptozom ili inhibicijom feroptoze (dodatna slika 5C). Ovi rezultati su pokazali da DC661 inducira višestruke načine ćelijske smrti, uključujući apoptozu i piroptozu, kao i nekroptozu i feroptozu, ali nijedan od ovih načina ćelijske smrti nije potreban za DC661-indukovanu ćelijsku smrt. Inhibicija katepsina ili kelacija kalcija ne sprječavaju smrt stanica uslijed permeabilizacije lizozomske membrane. Pošto smo pokazali da je aktivacija kaspaze (koja je potrebna za apoptozu i piroptozu) neophodna za DC661-indukovanu ćelijsku smrt, pretpostavili smo da oslobađanje katepsina iz lizosoma može uzrokovati ćelijsku smrt zavisnu od kaspaze. Hemijska (DC661) ili genetska (PPT1 siRNA [siPPT1]) inhibicija PPT1 dovela je do permeabilizacije lizozomske membrane (LMP), dok HDSF, manje moćni ireverzibilni inhibitor PPT1 koji se brzo iscrpljuje u ćelijskoj kulturi, nije mogao inducirati LMP, kako je mjereno pomoću galektina-3–pozitivne puncta (Slika 4A). LMP dovodi do oslobađanja katepsina i drugog lizosomskog sadržaja u citoplazmu i smatra se da je ključna proksimalna karakteristika stanične smrti zasnovane na lizozomima. LMP induciran DC661 bio je povezan sa značajnim povećanjem aktivnosti citoplazmatskog katepsina-L, koji je bio značajno blokiran inhibitorom cistein proteaze E64 (slika 4B). Prethodni izvještaji sugerirali su da oslobađanje katepsina iz slomljenih lizosoma potiče aktivaciju kaspaze, što dovodi do apoptotičke smrti stanica (16-18). Potpuna inhibicija katepsina nije spriječila cijepanje kaspaze (Slika 4C) i nije spasila DC{92}}indukovanu citotoksičnost u testovima kratkoročne i dugoročne održivosti melanoma (Slika 4, D i E), raka debelog crijeva i pankreasa ćelije raka (dopunska slika 6, A–C). Ovi rezultati se suprotstavljaju kanonskom gledištu o smrti ćelija lizozoma izazvanoj smrtnošću ćelija posredovanom katepsinom. Osim oslobađanja katepsina iz nepropusnih lizosoma, oslobađanje kalcija iz lizosoma je uključeno u ćelijsku disfunkciju kada je PPT1 oštećen (19). Tretman DC661 je rezultirao ekstenzivnim oslobađanjem kalcija, što je poništeno prethodnom obradom ćelijskog trajnog kelatora (Ca{101}}), BAPTA-AM. (Slika 4F). Značajno je da BAPTA-AM nije spriječio DC661-indukovanu LMP (slika 4G) ili cijepanje kaspaze (dodatna slika 6, D i E) i, što je najvažnije, nije spasio DC{108}indukovanu citotoksičnost ( Slika 4H). Ovi nalazi su također primijećeni u RKO i MIA PaCa-2 ćelijskim linijama, u kojima nisu uočene značajne razlike u vrijednostima IC50 sa BAPTA-AM i DC661 (dopunska slika 6F), što sugerira da je smrt stanica povezana s LMP ne zavisi od kalcijuma ili katepsina.

Slika 2. DC661-indukovana apoptoza i nekroptoza. (A)

Slika 3. DC661-indukovana feroptoza i piroptoza. (A)

LLP pokreće LMP. Utvrdivši da su inhibitori glavnih puteva ćelijske smrti (apoptoza, nekroptoza, feroptoza i piroptoza), katepsini (PepA i E64) i kelatori jona (BAPTA-AM [Ca2+]] i DFO [Fe{{3} }]) nije spriječio ćelijsku smrt od strane DC661 i pronalazeći dokaze o peroksidaciji lipida pomoću C-11-BODIPY, izvršili smo globalnu analizu lipidoma 2 i 4 sata nakon tretmana DC661. DC661 je inducirao rano i trajno povećanje od 3- do 10- puta u svakoj klasi lizofosfolipida (slika 5A). Nasuprot tome, minimalne ili nikakve promjene su uočene u klasama fosfolipida, uključujući fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilinozitol, fosfatidilglicerol i fosfatidnu kiselinu (dopunska slika 7A). Lizofosfolipidne vrste mogu se generirati pomoću ROS, koji oksidira lanac zasićenih masnih kiselina koji se zatim odcjepljuje fosfolipazama (20). Da bismo utvrdili mogu li antioksidansi spriječiti oštećenje lipida posredovano ROS-om, istražili smo citotoksičnost izazvanu DC661-u prisustvu pan-ROS čistača N-acetilcisteina (NAC) (21, 22) i navodnih inhibitora peroksidacije lipida Troloxa (23 ) i vitamin C (askorbinska kiselina) (24, 25). Za razliku od bilo kojeg drugog do sada testiranog agensa, zajednički tretman sa NAC-om je spasio DC661-povezanu citotoksičnost u više ćelijskih linija (slika 5B i dopunska slika 7B). Dugotrajni CFU testovi su pokazali da je NAC, za razliku od svih inhibitora ćelijske smrti, helatora jona i inhibitora katepsina koji su ovdje testirani, spriječio citotoksične efekte DC661 u A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 i MC38 ćelijama ( Slika 5C i Dodatna slika 7C). Zanimljivo je da Trolox i vitamin C nisu spasili citotoksičnost DC661 u humanom melanomu, kolorektalnom karcinomu, ćelijama raka gušterače i mišjem melanomu i ćelijama kolorektalnog karcinoma (Slika 5D i Dodatna slika 7, D–H). Ovaj disparitet nas je potaknuo da testiramo da li NAC, Trolox i vitamin C utiču na LMP. Naši rezultati su pokazali da je NAC jedini antioksidans koji je značajno smanjio LMP izazvan DC661-(Slika 5E). Pretpostavili smo da LLP pokreće proizvodnju LMP pomoću DC661, koji NAC može poništiti, ali ne i Trolox i vitamin C. Za proučavanje procesa LLP koristili smo fluorescentnu sondu FOAM-LPO (26), koja se specifično lokalizira na lizozomu i proizvodi spektralni pomak od 586 do 512 nm (crveno u zeleno) kada je izloženo lipidnim peroksidima. Otkrili smo da je DC661 inducirao LLP u poređenju sa kontrolom (Slika 5F). NAC je smanjio peroksidaciju lipida u lizosomima ćelija melanoma tretiranih DC661-, dok Trolox i vitamin C nisu uspjeli smanjiti LLP (slika 5F). NAC, Trolox i vitamin C sami po sebi nisu imali značajan uticaj na peroksidaciju lipida. Obaranje PPT1 (dopunska slika 8A) ili tretman sa visokim koncentracijama HCQ (dodatna slika 8B) također je inducirao LMP koji bi mogao biti poništen pomoću NAC-a, dok kemijska inhibicija ULK1 nije izazvala LMP (dopunska slika 8C). Važno je snižavanje siPPT1 također uključivalo LLP koji se može poništiti pomoću NAC-a (Dopunska slika 8D) Ovi rezultati su pokazali da inhibicija PPT1 inducira LLP koji se može spasiti NAC-om i vjerovatno je uzrok LMP-a izazvanog PPT1- inhibicijom. Nadalje, ovi nalazi sugeriraju da je LLP kritičan za lizozomalnu ćelijsku smrt.

Kineska biljka cistanche biljka-antitumor

Uvoz cisteina u lizozome pomoću MFSD12 ublažava lizozomalnu ćelijsku smrt. Od 3 inhibitora lipidne peroksidacije, samo je NAC spriječio LLP. Nedavni izvještaj je pokazao da je glavna fasilitatorska superporodična domena koja sadrži 12 (MFSD12) bitna komponenta uvoznika cisteina za lizozome i melanozome (27). Zaključili smo da se NAC, ili njegov metabolit cistein, transportuje u lizozom preko MFSD12, gdje se cistein oksidira u svoj disulfid, cistein. Da bismo testirali ovu hipotezu, uporedili smo sposobnost NAC-a da spasi DC661 citotoksičnost u siNT i siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP ćelijama. Naši rezultati su pokazali da je NAC spasio DC{11}}indukovani LMP u siNT ćelijama, ali nije spasio LMP u ćelijama siMFSD12 (Slika 6A). NAC je smanjio LLP ćelija siNT-A375P tretiranih DC661-ali ne i ćelija siMFSD12. siMFSD12 ćelije tretirane DMSO ili NAC imale su povećan bazalni LLP (slika 6B) u poređenju sa siNT ćelijama. Dok je NAC spasio DC661 citotoksičnost u siNT ćelijama, sposobnost NAC-a da spasi DC661 citotoksičnost je potpuno poništena u ćelijama siMSFD12 (slika 6C). Ovo je pokazalo da MFSD12 knockdown blokira citoprotektivne efekte NAC protiv DC661. NAC je deacetiliran acilazom u citosolu (28). Da bismo utvrdili da li tretman NAC proizvodi akumulaciju cisteina ili cistina unutar lizozoma, upotrijebili smo tehniku ​​lizosomalne imunoprecipitacije (Lyso-IP) (29) da pročistimo lizozome iz DMSO i NAC-tretiranih A375P ćelija (slika 6D i dopunska slika 9A) i izveli smo ciljana metabolomika za kvantifikaciju NAC-a i srodnih metabolita. Kao što se očekivalo, NAC je otkriven u NAC-tretiranom lizatu cijelih stanica i povezanim nevezanim frakcijama. Nivoi L-cisteina su značajno povećani unutar NAC-tretiranih lizozoma. L-cistin se mogao detektovati samo unutar NAC-tretiranih lizozoma. Zapanjujuće je da nismo pronašli značajno povećanje glutationa (smanjenog) u grupama koje su tretirane NAC (Slika 6E); ovo je bilo iznenađujuće jer se uobičajeno vjeruje da NAC tretman izaziva povećanu proizvodnju glutationa, ispravljajući redoks ravnotežu. Ovi rezultati sugeriraju da je cistein uvezen u lizozome putem uvoznika MFSD12 kritičan za spašavanje LLP, LMP i lizozomalne ćelijske smrti. LLP je imunogen. Neki oblici regulirane stanične smrti izazvane DC661 (piroptoza, nekroptoza, feroptoza) identificirani su kao imunogeni. Ranije je opisana imunogena ćelijska smrt za lijekove za kemoterapiju na osnovu karakterističnih karakteristika, koje uključuju prikaz molekularnih obrazaca povezanih s oštećenjem, uključujući ekspresiju CALR na površini ćelije i oslobađanje HMGB1 proteina i adenozin trifosfata (ATP) (30). CALR djeluje kao signal "pojedi me" kada je izložen ćelijskoj površini tokom ćelijskog stresa. Ekstracelularno oslobađanje HMGB1 i ATP-a djeluje kao signal "nađi me" koji prepoznaju fagocitne stanice. Usporedili smo dva modela: B16F10 ćelije, koje su u modelima singenih tumora gotovo u potpunosti lišene limfocita koji infiltriraju tumor, i MC38 ćelije, koje u modelima singenih tumora imaju limfocite koji infiltriraju tumor. Prvo, pokazali smo da tretman DC661 ili siPpt1 značajno inducira površinsku ekspresiju CALR koja se može potpuno poništiti tretmanom NAC u MC38 ćelijama (Slike 7, A i B). Slični nalazi su uočeni u B16F10 ćelijama (Slika 7C). Inhibitori glavnih puteva ćelijske smrti (apoptoza, nekroptoza, feroptoza i piroptoza) nisu uspjeli spriječiti površinsku ekspresiju CALR (slika 7D). Da bi se utvrdilo da li je imunogena ćelijska smrt izazvana DC661 uzrokovana povećanjem regulacije MHC klase I, ćelije B16F10 i MC38 su tretirane DC661 (3 μM) ili DMSO tokom 24 sata. Otkrili smo da tretman DC661 nije povećao ekspresiju MHC klase I i regulaciju imunoproteasoma (Slika 7E i Dodatna slika 9, B i C).

Slika 4. Inhibicija katepsina ili kelacija kalcijuma ne sprečava DC{1}}indukovanu smrt ćelije. (A)

Da bismo razumjeli efekte inhibicije autofagije na prajming T ćelija, izveli smo in vitro eksperiment sa prajmingom i kokulturom koristeći C57BL6/J splenocite kao što je prethodno opisano (31). Za prajming, izložili smo splenocite DC661- ili DMSO tretiranim B16F10 ili MC38 ćelijama. Zatim su ovi pripremljeni splenociti uzgajani sa živim B16F10 ili MC38 ćelijama i izmjerena je citotoksičnost (Slika 8A). Splenociti napunjeni DC661-tretiranim B16F10 ćelijama proizveli su značajno povećanje IFN-a u poređenju sa splenocitima izloženim B16F10 ćelijama tretiranim DMSO. Ubijanje proliferirajućih B16F10 ćelija posredovano T ćelijama je značajno povećano u DC661-primiranim splenocitima u poređenju sa DMSO-primiranim splenocitima (Slika 8, B i C). Ćelije MC38 tretirane sa DC661 proizvele su još veću citotoksičnost za IFN i T ćelije u poređenju sa ćelijama B16F10 (Slika 8, D i E). Tretman NAC-om sa DC661 bio je u stanju da u potpunosti poništi oslobađanje IFN-a iz splenocita i citotoksičnost T-ćelija tupog pražnjenja (Slika 8, F i G). Obaranje kalretikulina od strane siCalr-a u MC38 ćelijama (dopunska slika 9D) poništilo je primarnu efikasnost tretmana DC661 i značajno smanjilo citotoksičnost primarnih T-ćelija (Slika 8, H i I). Uzeti zajedno, ovi podaci podržavaju mehaničku ulogu povećanja regulacije CALR-a povezane s LLP-om u promoviranju imuniteta T-ćelija antitumorskih stanica. Zatim smo proširili ove in vitro nalaze na in vivo studiju antitumorske vakcinacije na imunokompetentnim i imunodeficijentnim modelima miševa. Za ovaj test, in vitro zamrznuto-odmrznute ili DC661-tretirane B16F10 ili MC38 ćelije su injektirane sc na lijevom boku kako bi se zaštitile imunokompetentne C57BL/6 ili NOD/SCID miševe od ponovnog izazivanja sa živim tumorskim ćelijama iste vrste koje su ubrizgane 7 dana kasnije u desni bok (slika 9A). DC661-liječene B16F10 ćelije nisu uspjele spriječiti odbacivanje tumora uprkos in vitro testovima, što sugerira da je DC661 inducirao imunogenu ćelijsku smrt (Slika 9B i Dodatna slika 9E). Nasuprot tome, inokulacija jednog boka sa DC661-tretiranim MC38 ćelijama promoviše potpuno odbacivanje živih MC38 ćelija implantiranih na suprotnom boku (Slika 9C i Dodatna slika 9F). Da bismo utvrdili da li je adaptivni imunitet bio kritičan za efekat vakcine koji DC661 ima kod MC38 tumora, ponovili smo eksperiment na NOD/SCID miševima. Zapanjujuće, otkrili smo da DC661-liječene MC38 ćelije nisu izazvale odbacivanje tumora ponovnog izazivanja kod imunodeficijentnih NOD/SCID miševa (Slika 9D i Dodatna slika 9G), što ukazuje da je za uočeni efekat vakcine potreban adaptivni imunitet. Da bismo testirali robusnost ovog nalaza, odabrali smo drugu dobro poznatu imunogenu ćelijsku liniju raka miša, CT26, i izveli eksperiment vakcinacije kao gore. Kao što se očekivalo, implantacija DC661-tretiranih CT26 ćelija u jedan bok miša proizvela je efekat sličan vakcini i spriječila izrastanje živih CT26 ćelija implantiranih na drugom boku (slika 9E i dodatna slika 9H). Naši nalazi sugeriraju da je DC{73}}indukovana LLP kritična za imunogenu ćelijsku smrt posredovanu LMP-om, koja je poništena uvozom cisteina u lizozom putem lizozomalnog transportera MFSD12 (slika 9F).

Diskusija

Čini se da je lizozomalna inhibicija obećavajući terapijski pristup u pretkliničkim studijama, a klinička ispitivanja HCQ dala su ohrabrujuće, ali mješovite rezultate (1, 32). PPT1 je molekularna meta HCQ, a jači inhibitori PPT1, kao što su DC661 (2) i GNS561 (3), induciraju smrt ćelija posredovanu LMP in vitro. Precizan mehanizam smrti lizozomske ćelije i njegova uloga u imunogenosti tumora nije u potpunosti razjašnjen. Antitumorski imunitet se pojačava kada se inhibicija autofagije kombinuje sa imunoterapijom (9, 10, 31). Predloženi mehanizmi za ćelijsku intrinzičnu imunogenost nakon inhibicije autofagije uključuju MHC klase I i regulaciju imunoproteasoma, koji podržavaju poboljšanu obradu i prezentaciju antigena. Pored toga, gubitak proteina autofagije ili inhibicija autofagije hlorokinom je povećao odgovor CD8+ T ćelija povećanjem površinskih nivoa MHC klase I u dendritskim ćelijama (33). Ranije smo pokazali da sistemska inhibicija PPT1 može repolarizirati makrofage iz M2 u M1 fenotip. PPT1 inhibitori mogu povećati nivoe STING-a, što dovodi do oslobađanja IFN-a i povećanja ubijanja posredovanog T ćelijama u modelima melanoma (31). Ovdje smo pokazali da sam LLP proizvodi intrinzični imunogeni oblik smrti ćelije tumorske ćelije. Otkrili smo da je lizozomska inhibicija izazvala vrlo malo promjena proteina u stanicama raka, a najznačajniji povišeni proteini uključivali su receptore autofagije i regulatore apoptoze. Naš pristup koji je ciljao neke od ovih gena u različitim funkcijama pokazao je da proteini izazvani lijekovima vjerojatno nisu glavni regulatori ćelijske smrti. Genetska inhibicija ULK1 ili ATG7 također nije spasila DC661 citotoksičnost. Pokazali smo da lizozomalna inhibicija aktivira višestruke oblike programirane stanične smrti, uključujući apoptozu, nekroptozu, feroptozu i piroptozu, ali svaki od njih je bio neophodan za citotoksičnost izazvanu lijekovima. Treba napomenuti da se programirani mehanizmi ćelijske smrti mogu preklapati i kotargetiranje višestrukih mehanizama ćelijske smrti može obezbijediti citoprotekciju protiv ćelijske smrti nakon permeabilizacije lizozomske membrane. Naš rad je isključio mehanizme zavisne od katepsina i kalcijuma za lizozomalnu ćelijsku smrt i naglasio važnost LLP-a kao kritične determinante ćelijske smrti. Pronašli smo dokaze o LLP-u koji je bio reverzibilan antioksidansom koji je transportiran u lizozom, NAC i bio je kritičan za permeabilizaciju lizozomske membrane i citotoksičnost. NAC je bio jedini agens koji je mogao ublažiti ili preokrenuti DC661-indukovanu ćelijsku smrt, a ovaj kapacitet je zavisio od prisustva lizozomalnog cisteinskog transportera MFSD12. Nedostatak lizozomske penetracije vjerovatno je razlog zašto drugi navodni inhibitori peroksidacije lipida, Trolox i vitamin C, nisu bili u stanju spriječiti DC661 citotoksičnost. NAC se pretvara u cistein, koji se uvozi u lizozome i oksidira u svoj disulfidni oblik, cistin. Cistin se izvozi u citosol pomoću drugog lizozomalnog transportera, cistinoze, gdje se reducira na cistein koji remobilizira unutrašnje izvore hranjivih tvari, reaktivira metu kompleksa rapamicina 1 i potiče autofagiju (34). Ovaj oksidaciono-redukcioni ciklus cisteina u cistin (lizozomi) i nazad u cistein (citosol) mogao bi biti mogući mehanizam spašavanja NAC-a od citotoksičnosti DC661 ili općenitije ozljede lizosoma u drugim kontekstima bolesti gdje se NAC pokazao korisnim u terapiji (35) . NAC ne samo da je preokrenuo DC661-indukovane LLP i LMP već i površinsku ekspresiju imunogenog markera ćelijske smrti kalretikulina. Ekspresija CALR proteina na površini ćelije bila je potrebna za pojačanu citotoksičnost posredovanu T ćelijama izazvanu DC661-primiranim splenocitima, pokazujući da lizozomalna inhibicija proizvodi specifičan oblik ćelijske intrinzične imunogenosti.

Dok su prethodne studije pokazale da lizosomalna inhibicija može poboljšati antitumorsku aktivnost inhibicije imunološke kontrolne tačke kod utvrđenih tumora boka (9, 31), naša studija je prva po našem saznanju koja pokazuje učinak sličan vakcini za tumore MC38, ali ne i za tumore B16 u tumorske ćelije prethodno tretirane sa DC661 prije implantacije. Ovo pokazuje da smrt lizozomskih ćelija može izazvati ćelijsku intrinzičnu imunogenost, ali ove promene same po sebi nisu dovoljne da preokrenu "imuno-hladno" tumorsko mikrookruženje u "imuno vruće" tumorsko mikrookruženje. Naše prethodne studije na modelima mikrookruženja tumora "imune hladnoće" B16 i BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 genetski modifikovani mišji modeli (31) su pokazali da sistemska lizozomska inhibicija proizvodi efekte na makrofage povezane sa tumorom i ćelije izvedene iz mijeloidnih ćelija koje su bile dovoljne za supresiju ćelija. efikasnost imunoterapije. Moguće je da ćelijska intrinzična imunogenost također igra ulogu u ovim imunološkim hladnim tumorima koji postaju osjetljiviji na ICD nakon lizozomalne inhibicije. Efekat inhibicije lizozoma sličan vakcini uočen u kontrolisanom laboratorijskom okruženju može, ali ne mora da se prenese u kliniku, ali bi mogao da objasni zašto su neki pacijenti liječeni dabrafenibom, trametinibom i HCQ u prethodno lečenom BRAF mutantnom melanomu imali tako dubok i izdržljiv odgovor na ovaj režim (32). Dalja studija je potrebna da bi se razumjelo kako inhibicija PPT1 proizvodi lizozomalni ROS i peroksidaciju lipida. PPT1-zavisna regulacija V-ATPaze i lizozomske acidifikacije nije dovoljno objašnjenje jer bafilomicin inhibira lizozomsko acidifikaciju, ali ne proizvodi LMP (podaci nisu prikazani). Implikacije ovih nalaza sugeriraju da se inhibitori lizozoma koji povećavaju intrinzičnu imunogenost tumorskih stanica mogu racionalno kombinirati s terapijama koje pojačavaju aktivaciju T-ćelija, ili infiltraciju u mikrookruženje tumora, potencijalno dajući sinergističke efekte.

Slika 5. N-acetil cistein sprečava ćelijsku smrt izazvanu DC661-. (A)

Metode

Ćelijska kultura. Human A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185) i ćelijske linije miša B16F10 (CRL-6475) kupljene su od ATCC. Ljudske A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 i mišje YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, i Gsdme KO1 i KO2) linije su dobijene u kompaniji. Mišje ćelije MC38 i CT26 obezbijedio je Andy Minn, Univerzitet Pennsylvania. FL5.12 i IL-3-zavisne Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) primarne ćelije koštane srži dobijene su od Kathryn E. Wellen, Univerzitet Pennsylvania. Ljudsku Panc-1 (CRL-1469, ATCC) ćelijsku liniju obezbijedio je Ben Z. Stanger, Univerzitet Pennsylvania. Ćelijska linija miša YUMMER 1.7 je dobijena od Xiaowei (George) Xu, Univerziteta Pennsylvania. Sve ćelijske linije su dva puta godišnje testirane na Mycoplasma u objektima Univerziteta Pennsylvania Core i potvrđene korištenjem kratkih tandem ponovljenih otisaka prstiju od strane Wistar Institute Genomics jezgra. A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 i Bax/Bak DKO ćelijske linije su uzgajane u RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); A375, MIA PaCa{41}}, Panc{42}}, B16F10 i MC38 ćelijske linije su uzgajane u DMEM (Invitrogen, 11995); i YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV, i Gsdme KO1 i KO2) ćelije (15) su uzgajane u DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Podloga za kulturu je dopunjena sa 10% fetalnog goveđeg seruma (12306C, MilliporeSigma) i 1× antimikotičkom otopinom antibiotika (Gibco, 15140-122). FL5.12 i Bax/Bak DKO ćelijske linije su održavane u kompletnom RPMI mediju sa dodatkom 50 μM -merkaptoetanola (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma) i 0,35 ng/mL i /mL IL-3, respektivno. Ćelijske linije YUMMER1.7 i YUMM1.7 (WT, Gsdme EV i Gsdme KO) održavane su u kompletnom mediju sa dodatkom 1× MEM NEAA (Gibco, 11140-050). WM35 i WM793 ćelije su uzgajane u MCDB mediju 153 (MilliporeSigma, M7403), koji sadrži 10% FBS u 1× Leibovitz L-15 mediju (Corning, 10-045-CV), 7,5% w/v natrijum bikarbonata ( Corning, 25-035-CI), 1× antimikotični rastvor antibiotika (Gibco, 15140-122) i 5 ug/mL insulina (MilliporeSigma, I0516). Ćelije su uzgajane na 37 stepeni u prisustvu 5% CO2. Hemikalije i reagensi. Kupljene hemikalije uključivale su HCQ sulfat (Spectrum Chemicals, 747-36-4) i DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) je korišten za bojenje ćelija na kalcij prema uputama proizvođača. Lista antitijela i inhibitora je data u Dodatnoj tabeli 1 i Dodatnoj tabeli 2.

Slika 6. NAC poništava LLP na MFSD12-zavisan način. (A-C)

Ekstrakcija i digestija proteina za tečnu hromatografiju–tandemsku analizu masene spektrometrije za proteomiku. {{0}}.7 × 106 A375P ćelija melanoma uzgajano je u posudama za kulturu od 60 mm. Ćelije su tretirane sa DMSO (kontrola), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM) ili HCQ (3{{70}} μM) tokom 24 sata u približno 5{{ 112}}% ušća. Smrznute ćelijske pelete su lizirane sa 50 mM Tris pH 7,4, 1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.15 mM PMSF, 1 ug/mL pepstatina, i 1 ug/mL leupeptina. Pročišćeni lizati (10 ug svaki) su elektroforezom 0,5 cm u bis-tris gel praćeno fiksiranjem i bojenjem koloidnim Coomassie-om. Svaka gel traka od 0,5 cm je izrezana, obojena, redukovana tris (2-karboksietil) fosfinom, alkilovana jodoacetamidom i digestirana tripsinom kao što je prethodno opisano (36). Digesti (1 ug) su analizirani tečnom hromatografijom-tandem masenom spektrometrijom (LC-MS/MS) na Q-Exactive Plus masenom spektrometru (Thermo Fisher Scientific) u skladu sa nanoAQUITY UPLC (Vode). Analitičko odvajanje je izvedeno na koloni 1,7 μm × 250 mm Peptide BEH C18 (Waters, 186003546) koristeći 245-minutni gradijent sa 0,1% mravlje kiseline u vodi (mobilna faza A) i acetonitrilom (mobilna faza B) kako slijedi : 5%–30% B tokom 225 minuta, 30%–80% B tokom 5 minuta, 15-minuta zadržavanja na 80% B, i povratak na početne uslove. Puni MS spektri su dobijeni pri rezoluciji 70,000, sa opsegom skeniranja od 400–2,000 m/z, ciljanom automatskom kontrolom pojačanja od 3 × 106 jona i maksimalnim vremenom ubrizgavanja od 50 milisekundi. MS2 spektri ovisni o podacima dobijeni su za 20 najzastupljenijih jona pri rezoluciji od 17 500, sa širinom izolacije od 1,5 m/z, ciljanom automatskom kontrolom pojačanja od 5 × 104 jona i maksimalnim vremenom ubrizgavanja od 50 milisekundi. Podudaranje peptida je postavljeno na preferirano, a nedodijeljeni i jednostruko nabijeni ioni su odbijeni (37). Sirovi MS podaci analizirani su korištenjem MaxQuant 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) s Uniprot bazom podataka ljudskih sekvenci (pristupljeno 10. oktobra 2019.) i uobičajenom bazom podataka o zagađivačima, uključujući tripsin, keratine, goveđe proteine, i mikoplazma (38). U pretraživanju je korištena specifičnost triptičnog peptida s maksimalno 2 propuštena cijepanja, fiksna modifikacija cisteina (karbamidometilacija) i varijabilna oksidacija metionina ili N-terminalna acetilacija (39). Za peptide i proteine ​​korištena je granica od 1% FDR. Podudaranje između rundi je omogućeno; proteini su kvantificirani korištenjem kvantifikacije bez oznaka (40). Statistička analiza je izvršena pomoću Perseusa 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Proteini su morali biti identificirani sa najmanje 3 jedinstvena peptida i imati 3 važeće vrijednosti (kvantifikacija koja nije nula) unutar grupe uzoraka, a kontaminanti i reverzni proteini su filtrirani iz skupa podataka. Vrijednosti koje nedostaju su imputirane iz normalne distribucije. Poređenja u paru između stanja su izvedena na nivou proteina korištenjem 2-repa Studentovog t-testa sa FDR-om zasnovanim na permutaciji sa s0=0.1 i 250 randomizacija. Značajne promjene su definirane kao FDR manji od 5% i promjena apsolutnog puta veća od 1,5 ili 2,0, kako je navedeno. Lyso-IP. A375P ćelije su inficirane pLJC5-Tmem192-3xHA lentivirusom i odabrane korištenjem 1 mg/mL puromicina (MilliporeSigma, P4512). Približno 3 × 106 HA-označenih A375P ćelija tretirano je bilo 10 mM NAC ili vodenim nosačem kontrole 24 sata u prethodno opisanim uslovima kulture. Nakon tretmana, ćelije su isprane u PBS-u, sakupljene u 0,5 mL hladnog KPBS-a i nježno homogenizirane pomoću 20 poteza u 2 mL Dounce homogenizatoru. Oko 2,5% homogenata je rezervisano za analizu lizata cijele ćelije, a ostatak je centrifugiran na 3,000g 2 minute na 4 stepena da se uklone ostaci ćelijske membrane. Supernatant homogenata je zatim prebačen u čistu epruvetu od 1,5 mL i inkubiran sa 50 μL anti-HA perlicama (Pierce, 88836) ili anti-DDK/Flag kuglicama (OriGene, TA150042) 15 minuta na 4 stepena. Uzorci su zatim precipitirani stavljanjem epruveta na DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) i lagano ljuljani 2 minute na sobnoj temperaturi. Supernatant je rezervisan za analizu nevezanih frakcija. IP je ispran 3 puta sa KPBS koji sadrži 8 mM CaCl2. Lyso-IP je ekstrahovan u 80% MeOH za metabolomičku analizu. Ekstrakcija i analiza lipida pomoću LC-MS/MS za globalni lipidom. Ćelije melanoma A375P zasijane su u posude od 60 mm sa 0,7 × 106 ćelija po posudi. Kada su ćelije bile na približno 50% konfluencije, tretirane su DMSO (kontrola), DC661 (3 μM) ili HCQ (30 μM) tokom 24 sata. Ćelije su isprane 2 puta sa HBSS, sastrugane u ledeno hladan metanol i prebačene u staklene epruvete za ekstrakciju lipida sa hloroformom/metanolom/0,88% NaCl (2:1:1) koji sadrži EquiSPLASH interni lipidni standard (Avanti Polar Lipids). Uzorci su vorteksirani, a zatim sonicirani u vodenom kupatilu 5 minuta na ledu. Nakon centrifugiranja na 500g tokom 15 minuta na 40 stepeni, donja faza je prebačena u drugu staklenu epruvetu. Gornja faza je ponovo ekstrahirana upotrebom sintetičke donje faze. Nakon sonikacije i centrifugiranja, donja faza je kombinirana s prvom sakupljanjem niže faze. Uzorci su osušeni pod dušikom, resuspendirani u 10% hloroformu/90% metanolu i prebačeni u staklene LTQ bočice. Uzorci lipida su analizirani na Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X masenom spektrometru i Vanquish Horizon UHPLC sistemu. Za analitičko odvajanje korištena je Accucore C30 kolona (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) sa 50:50 acetonitril/voda i 88:10:2 izopropanol/acetonitril/voda, od kojih svaka sadrži 5 mM amonijum formata i 0,1% mravlje kiseline. LC-MS/MS podaci su prikupljeni odvojeno u pozitivnim i negativnim polaritetima sa sljedećim parametrima instrumenta: MS1 skeniranje 120,000 rezolucija; MS2 zavisan od podataka o 20 najzastupljenijih jona u rezoluciji 15,000; 0,4 m/z širina izolacije; i stepenastu normalizovanu energiju sudara od 20:30:40 (43).

Slika 7. N-acetil cistein sprečava DC661-indukovanu površinsku ekspresiju kalretikulina. (A-D)

Lipidi su identificirani i kvantificirani pomoću LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Identifikovane vrste lipida su filtrirane prema očekivanim aduktima i identifikacionom stepenu na osnovu klase. Površine vrhova su normalizovane prema EquiSPLASH standardima za podržane klase i dalje normalizovane na osnovu ukupne površine za svaki uzorak da bi se ispravile varijacije u broju ćelija. Statistička analiza je izvršena na log-transformisanim podacima pomoću Perseusa 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Ekstrakcija i analiza metabolita pomoću LC-MS/MS za metabalon. Polarni metaboliti su ekstrahovani iz celih ćelija, Lyso-IP nevezanih frakcija i Lyso-IP vezanih uzoraka korišćenjem 80% metanola i pohranjeni su na –8{{30}} stepeni pre tečne hromatografije – masena spektrometrija (LC-MS) analiza. Ekstrakti su analizirani pomoću LC-MS pomoću Thermo Scientific Q-Exactive HF-X masenog spektrometra sa HESI II sondom u skladu sa Thermo Vanquish Horizon UHPLC sistemom. LC odvajanje je izvedeno korišćenjem ZIC-HILIC kolone (2,1 mm × 150 mm, veličina čestica 5 μm, EMD Millipore) sa ZIC-HILIC zaštitnom kolonom (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore) držanom na 45 stepeni sa brzinom protoka od 0,2 mL/min. Kromatografija je izvedena u kiselim uvjetima kako bi se smanjila reaktivnost tiolnih grupa. Mobilna faza A je bila voda, a B je bio acetonitril, oba sadrže 0,1% mravlje kiseline. LC gradijent je bio 85% B tokom 2 minuta, 85% B do 20% B tokom 15 minuta, 20% B do 85% B tokom 0,1 minuta i 85% B tokom 8,9 minuta. Autosampler je držan na 4 stepena, a po analizi je ubrizgano 4 μL svakog uzorka. Korišteni su sljedeći MS parametri: brzina protoka plina u omotaču, 40 AJ; protok pomoćnog gasa, 10 AJ; brzina protoka gasa za čišćenje, 2 AJ; temperatura pomoćnog plinskog grijača, 350 stepeni; napon raspršivanja, 3,75 kV za pozitivni mod i 3,5 kV za negativan mod; temperatura kapilara, 375 stepeni; i nivo RF lijevka, 40%. Svi uzorci su analizirani punim MS sa promjenom polariteta. Potpuna MS skeniranja su dobijena od 65 do 975 m/z pri rezoluciji 120,000 sa ciljem automatske kontrole pojačanja od 1 × 106 jona i maksimalnim vremenom ubrizgavanja od 100 milisekundi. Sirovi podaci su analizirani pomoću TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Ciljani metaboliti su identifikovani prema tačnoj masi i vremenu zadržavanja u željenom polaritetu na osnovu analitičkih standarda. Detekcija pikova je koristila ICIS algoritam sa izravnavanjem od 1. Relativna kvantifikacija je izvršena korišćenjem integrisane površine pika, a ove vrednosti su korigovane na ukupnu količinu po uzorku (definisanu kao ukupna površina pika). PPT1-CRISPR/Cas9 uređivanje. A375P PPT1-neciljne i KO ćelije su pripremljene kao što je prethodno opisano (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) je poklon od Feng Zhanga (Addgene plazmid, 48139). Vodeći RNA oligo (IDT) su žareni, fosforilirani, a zatim ligirani u BbsI digestirani i defosforilirani plazmid pX459 prema Zhang laboratorijskim protokolima, dostupnim preko Addgenea. Ligirani plazmidi su transformisani u Stbl3 ćelije (Invitrogen). Sekvenciranje preparata plazmida potvrdilo je prisustvo željenih vodećih RNA sekvenci. A375P ćelije su transficirane upotrebom Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), nakon čega je uslijedila selekcija puromicina. Ispitivači su potvrdili uređivanje gena PPT1 od strane CRISPR/Cas9, a nokdaun PPT1 je potvrđen Western blotingom sa PPT1 antitijelom (Origene). Sekvence za oligo RNA vodiča su sljedeće: neciljana RNA vodiča naprijed (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), neciljana vodična RNK obrnuta (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), ljudska PPT1 vodeća RNA 1 naprijed (CACCGTTGGACTCCCTCGATGCCC), ljudska PPT1 vodeći RNA RNA 1 naprijed (CACCGTTGGACTCCCTCGATGCCC), ljudska PPT1 reverzna vodilica GACGCAGACAA PPT1 GACGCAGACGACAA RNK 3 naprijed (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC), a ljudski PPT1 vodi RNK 3 unazad (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Klonovi uzgojeni iz pojedinačnih ćelija korišteni u ovom radu uključuju sljedeće: klon C8 je ljudski vodič 1, a klon B5 je ljudski vodič 3. Imunobloting. Milion ćelija je stavljeno u posudu od 10 cm, a tretmani su dati sledećeg dana; ćelije su sakupljene struganjem. Lizati cijelih stanica pripremljeni su korištenjem SDS pufera za lizu. Koncentracija proteina je mjerena korištenjem Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23225). 30-50 ug proteina je korišteno za SDS-PAGE i prebačeno je na PVDF membranu (Bio-Rad, 1620177). Membrana je blokirana korišćenjem 5% BSA ili 5% obranog mleka, prema optimizovanim uslovima, i inkubirana sa primarnim antitelom preko noći na 4 stepena. PVDF membrane su isprane sa 1× TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) i inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi sa specifičnim HRP-konjugiranim sekundarnim antitijelom. Membrane su zatim isprane i razvijene upotrebom Pierce ECL Western Blotting supstrata (Thermo Fisher Scientific, 32106) i autoradiografskih filmova (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Za studije piroptoze, proteinski lizati su odvojeni pomoću SDS-PAGE i prebačeni na PVDF membrane. Nakon blokiranja u 5% BSA, PVDF membrane su inkubirane sa naznačenim primarnim antitelima preko noći na 4 stepena, isprane u PBS/Tween i inkubirane sa sekundarnim antitelima vezanim za peroksidazu. Imunoreaktivnost je otkrivena upotrebom sekundarnih antitijela konjugiranih s HRP (CalBioTech), hemiluminiscentnog supstrata (Thermo Fisher Scientific) i ChemicDoc MP sistema za snimanje (Bio-Rad). Za eksperimente koji uključuju supernatant, ćelije su uzgajane u mediju bez FBS da bi se izbjeglo izobličenje SDS-PAGE. Ćelijski supernatanti su sakupljeni i centrifugirani 10 minuta na 500g na 4 stepena da bi se uklonili ćelijski ostaci. Dobijeni supernatanti su koncentrirani 10× koristeći Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) centrifugiranjem 30 minuta na 4.500 g na 4 stepena. Koncentrati su pomiješani sa puferom za uzorke i analizirani Western blotingom kao što je gore opisano. Bojenje proteinskim gelom izvedeno je Ponceau crvenom bojenjem. Test aktivnosti LMP i katepsina L. Ljudski pEGFP-hGal3 plazmid je poklon Tamotsu Yoshimorija (Addgene plazmid, 73080) i korišten je za kreiranje linije A375P-Galectin{139}}. Kupljena je okosnica kontrolnog plazmidnog vektora pEGFP-C1 (novo prolabs, V012024). Plazmidi su transficirani (1 ug/mL) u A375P ćelije koristeći Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) prema protokolu proizvođača; transficirane ćelije su stabilno odabrane pomoću G418 (Gibco, 10131035). Za LMP je izbrojano ukupno 25 A375P-galektin-3 puncta-pozitivnih ćelija u višestrukim poljima slike. Procenat punkta pozitivnih ćelija izračunat je u svakom polju posebno, a za svaku grupu izračunat je prosečan procenat. Komplet za ispitivanje Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) korišten je prema protokolu proizvođača. Ćelije su snimljene pod Zeiss Axio Observer 7 invertnim mikroskopom. Magic Red sirovi integrisani intenzitet izračunat je korištenjem softvera Fiji - ImageJ (NIH). MTT (3-[4, 5-dimetiltiazol-2-il]-2, 5 difenil tetrazolijum bromid) test vitalnosti ćelija. 2.000 ćelija je postavljeno u tri primjerka u svaku jažicu ploče 96-jažice, a 3-dnevni MTT testovi su izvedeni korištenjem kompleta za vitalnost ćelija (Roche, 11465007001) prema protokolu proizvođača. Predtretman inhibitorima je dat 1 sat, nakon čega je uslijedio zajednički tretman ćelija inhibitorima sa ili bez DC661. Za izračunavanje IC50 korištena je metoda nelinearne regresije (prilagođavanje krive).

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Test formiranja kolonija. 2,000 ćelije po jažici su zasijane u 6-ploču sa bunarima i tretirane su sljedećeg dana; ćelije su držane pod tretmanom ukupno 8 dana. Kolonije formirane u svakoj jažici su isprane PBS-om, fiksirane hladnim metanolom na –20 stepena 20 minuta i obojene 0,5% vodenim rastvorom Crystal violet (V5265; MilliporeSigma).

Test isključenja tripan plave boje. Reakciona smjesa za test Trypan blue je pripremljena miješanjem 1 dijela 0.4% Trypan blue (25- 900-CI, Corning) i 1 dijela razrijeđenih uzoraka ćelija. Smjesa je inkubirana 1 minut, a ćelije su izbrojane na Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).

Slika 8. DC661-indukovana površinska ekspresija kalretikulina prima T ćelije protiv tumorskih ćelija. (A)

Slika 9. Inokulacija ćelija tretiranih DC661- dovodi do odbacivanja tumora u specifičnim kontekstima. (A)

PJENA-LPO. LLP je proučavan pomoću fluorescentne sonde, FOAMLPO. FOAM-LPO je sintetiziran kako je prethodno opisano (26). Ćelije su uzgajane na μSlide sa 8 jažica (ibid, 80807) i tretirane inhibitorima i sa ili bez DC661. Ćelije su inkubirane sa podlogom koja sadrži FOAM-LPO (1 M) u atmosferi od 5% CO2 i 95% vazduha tokom 5 minuta na 37 stepeni. Ćelije su dva puta isprane sa medijumom, a zatim su ćelije posmatrane pod mikroskopom (Zeiss Axio Observer 7 invertirani mikroskop) da bi se otkrilo pomeranje fluorescencije od 586 do 512 nm kao odgovor na LLP. qRT-PCR i prajmeri. A375P (3 × 105) ćelije su uzgajane u posudama od 60 mm i tretirane sa DMSO ili DC661 (3 μM) tokom 24 sata. Ukupna RNK je izolovana kompletom za izolaciju RNK (QIAGEN, 74134) prema protokolu proizvođača. cDNA je sintetizovana korišćenjem iScript kompleta reverzne transkriptaze sa 500 ng prečišćene RNK prema protokolu proizvođača (Thermo Scientific, K1642). qPCR reakcija je postavljena korištenjem SYBR Green PCR Master Mixa (BioRad, 1725121) koji sadrži 1 μL cDNA. Sva mjerenja su obavljena u tri primjerka, a BACTIN je korišten kao interni standard za ΔCT proračune. Gene expression analysis was done using the following primers: PTGS2/COX-2 forward (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 reverse (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS forward (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS reverse (GACCAGTGATGTCAACAGGAGC), CHAC1 forward (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 unazad (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN naprijed (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) i BACTIN unazad (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

siRNA transfekcija. Genetička knockdown studija za humane ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 i MFSD12 izvedena su u A375P ćelijskim linijama. Studije genetske inhibicije za mišji Ppt1 i Calreticulin izvedene su u MC38 ćelijama. Neciljna siRNA (sc{{10}}), ljudska ULK1 (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), miš Ppt1/Cln1 (sc-142398) i Calreticulin /Calregulin (sc-29895) siRNA su kupljene od Santa Cruz Biotechnology. Ove siRNA se sastoje od skupova od 3-5 ciljno specifičnih siRNA. Protočna citometrija. Indukcija feroptoze je mjerena korištenjem C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). A375P ćelije su zasijane u 6-pločicu i tretirane sa DMSO, ferostatinom{{40}} (10 μM), roksstatinom za usne-1 (2 μM), elastinom (5 μM ), DC661 (3 μM) ili kombinacija tokom 24 sata. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 300 g tokom 5 minuta. Ćelije su resuspendirane u 500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) koji sadrži 1 μM C11-BODIPY i inkubirane na 37 stepeni 15 minuta. Ćelije su peletirane i resuspendirane u 500 µL 1X HBSS, a intenzitet fluorescencije je mjeren na BD LSRII citometru korištenjem 530/30 Blue (University of Pennsylvania Flow Core Facility). Kvantifikacija ekspresije kalretikulina na površini ćelije za imunogenu ćelijsku smrt izvedena je kao što je prethodno opisano (45) pomoću protočne citometrije. B16F10 ili MC38 ćelije su kultivisane i tretirane sa NAC (10 mM) ili DC661 (3 μM) tokom 24 sata. MC38 ćelije su tretirane sa siPpt1 ili siNT tokom 48 sati u prisustvu ili odsustvu 10 mM NAC tokom 24 sata. Ćelije su obojene CALR antitelom (Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 kozjim drugim anti-zečjim antitelom (Invitrogen) i propidijum jodidom (PI) (Biolegend, 421301). Obojeni uzorci su uzeti na BD LSRII protočnom citometru korištenjem 710/50 plave i 670/30 crvene za hvatanje PI i CALR fluorescencije, respektivno (ustanova Flow Core Univerziteta u Pensilvaniji), a analiza je ograničena na CALR-pozitivne i PI-negativne ćelije kako bi izbjegli lažno pozitivne događaje. Primiranje T stanica i postotak citotoksičnosti. B16 ili MC38 tumorske ćelije (5 × 104) su kultivisane i tretirane sa NAC (10 mM) ili DC661 (1 μM ili 3 μM), respektivno, tokom 24 sata. Za Calr genetsku inhibiciju, MC38 ćelije su tretirane sa Calr siRNA ili neciljnom siRNA (siNT) tokom 48 sati, nakon čega je uslijedio tretman sa DMSO ili 3 μM DC661 tokom 24 sata. Splenociti su zatim kultivisani sa DC661 sa ili bez B16 ili MC38 ćelija u prisustvu IL-2 (5 IU/mL) i kokultivisani tokom 72 sata. Prajming je potvrđen IFN-ELISA (Biolegend, 430815) supernatanta. Primirani splenociti su zatim zajedno kultivirani sa svježe kultiviranim stanicama B16 ili MC38 s omjerom cilja i efektora (B16 ili MC38 prema splenociti) od 1:20 i 1:50 za ćelije B16 i MC38. Oslobađanje LDH povezanog sa smrću ćelija B16 ili MC38, a zatim procentualna citotoksičnost izmjereni su prema protokolu proizvođača (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Testovi antitumorske vakcinacije i studije kemoterapije sa utvrđenim modelima raka. Ženke miševa WT C57BL/6, NOD/SCID i BALB/c stare od šest do osam sedmica dobijene su iz laboratorije Jackson. Za eksperimente antitumorske vakcinacije, WT B16F10, MC38 i CT26 ćelije su tretirane sa DC661 (3 μM) tokom 36 sati u tikvicama od 175 cm2. Zatim su supernatanti i odvojene ćelije sakupljeni u epruvetu od 50 mL falcon. Ćelije su centrifugirane i isprane ledeno hladnim PBS-om. Za vakcinaciju, 150 μL ćelijske suspenzije je ubrizgano sc u lijevi bok imunokompetentnih miševa C57BL/6, imunodeficijentnih NOD/SCID miševa (1,8 × 104 B16F10 ćelija, 1,5 × 106 MC38 ćelija po mišu) ili syngene miic miša (BALB30). × 106 CT26 ćelija po mišu). Zamrznute odmrznute ćelije resuspendirane u PBS-u su ubrizgane kao negativna kontrola. Nedelju dana kasnije, žive ćelije raka istog tipa (3 × 104 B16F10 ćelije, 2 × 105 MC38 ćelija ili 5 × 105 CT26 ćelija po mišu) sa jednakom zapreminom Matrigela (Corning, 354248) su ubrizgane u desni bok vakcinisanih miševa. Tumori su mjereni elektronskim čeljustima, a volumen je izračunat kao L × W2 × 0,5. Rast tumora se redovno pratio narednih dana, a odsustvo tumora se smatralo pokazateljem efikasne antitumorske vakcinacije. DC661-Studije vakcinacije MC38 su ponovljene na NOD/SCID miševima. Statistika. Statistička značajnost je određena korištenjem Studentovog neparnog, 2-repa t-testa prilikom poređenja 2 grupe. 1-Način ANOVA test je korišten kada je upoređeno više od 2 grupe. Nul hipoteza je značajno odbačena ako je P vrijednost bila manja od 0,05. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. Odobrenje studije. Svi eksperimenti na životinjama izvedeni su u skladu sa protokolima odobrenim od strane Komiteta za institucionalnu negu i upotrebu životinja Univerziteta Pensilvanije.

Kineska biljka cistanche biljka-antitumor

Reference

1. Zeh HJ, et al. Randomizirana faza II preoperativna studija inhibicije autofagije visokim dozama hidroksihlorokina i gemcitabina/Nab-paklitaksela kod pacijenata s karcinomom gušterače. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.

2. Rebecca VW, et al. PPT1 potiče rast tumora i molekularna je meta derivata hlorokina kod raka. Cancer Discov. 2019;9(2):220–229.

3. Brun S, et al. GNS561, novi inhibitor autofagije aktivan protiv matičnih ćelija raka u hepatocelularnom karcinomu i metastazama u jetri kolorektalnog karcinoma. J Rak. 2021;12(18):5432–5438.

4. Brun S, et al. GNS561, PPT1 inhibitor kliničke faze, efikasan je protiv hepatocelularnog karcinoma putem modulacije lizozomskih funkcija. Autofagija. 2022;18(3):678–694.

5. Oberle C, et al. Permeabilizacija lizozomske membrane i oslobađanje katepsina su Bax/Bak-ovisni događaj koji pojačava apoptozu u fibroblastima i monocitima. Cell Death Differ. 2010;17(7):1167–1178.

6. Boya P, Kroemer G. Permeabilizacija lizozomalne membrane u smrti ćelije. Onkogen. 2008;27(50):6434–6451.

7. Rebecca VW, et al. Jedinstveni pristup ciljanju na degradativne i signalne uloge lizosoma. Cancer Discov. 2017;7(11):1266–1283.

8. Tang R, et al. Feroptoza, nekroptoza i piroptoza u antikancerogenom imunitetu. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.

9. Yamamoto K, et al. Autofagija promoviše imunološku evaziju raka pankreasa razgradnjom MHCI. Priroda. 2020;581(7806):100–105.

10. Deng J, et al. Inhibicija ULK1 prevladava kompromitovanu prezentaciju antigena i obnavlja antitumorski imunitet kod LKB1 mutantnog raka pluća. Nat Cancer. 2021;2(5):503–514.

11. Lazarou M, et al. Ubikvitin kinaza PINK1 regrutuje receptore autofagije da izazove mitofagiju. Priroda. 2015;524(7565):309–314.

12. Choi YB, et al. TAX1BP1 ograničava apoptozu izazvanu virusom olakšavajući degradaciju mitohondrijalnog adaptera MAVS posredovanu svrabom. Mol Cell Biol. 2017;37(1):e00422-16.

13. Rikka S, et al. Bnip3 narušava bioenergetiku mitohondrija i stimuliše mitohondrijalni obrt. Cell Death Differ. 2011;18(4):721–731.

14. Leu JI, et al. Mehanistička osnova za oštećenu feroptozu u ćelijama koje eksprimiraju afričko-centričnu S47 varijantu p53. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.

15. Erkes DA, et al. Mutantni BRAF i MEK inhibitori regulišu imunološko mikrookruženje tumora putem piroptoze. Cancer Discov. 2020;10(2):254–269.

16. Serrano-Puebla A, Boya P. Permeabilizacija lizozomske membrane u ćelijskoj smrti: novi dokazi i implikacije na zdravlje i bolesti. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.

17. Thirusangu P, et al. Autofagija izazvana kinakrinom kod karcinoma jajnika pokreće katepsin-L posredovanu permeabilizaciju lizozomalne/mitohondrijalne membrane i ćelijsku smrt. Rakovi (Bazel). 2021;13(9):2004.

18. Michallet MC, et al. Katepsin ovisna apoptoza izazvana supraoptimalnim aktiviranjem T limfocita: mogući mehanizam tolerancije visoke doze. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.

19. Mondal A, et al. Nedostatak Ppt1-disreguliše homeostazu lizozoma Ca++ doprinoseći patogenezi na mišjem modelu CLN1 bolesti. J Inherit Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM, et al. Fosfolipaze i reaktivne vrste kiseonika su dobile lipidne biomarkere kod zdravih i bolesnih ljudi i životinja – fokus na lizofosfatidilkolinu. Front Physiol. 2021;12:732319.

21. Fu R, et al. Efikasnost N-acetilcisteina u fenotipskoj supresiji mišjih modela Niemann-Pickove bolesti, tip C1. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.

22. Boz Z, et al. N-acetilcistein sprečava oksidativni stres izazvan olanzapinom u mHypoA-59 neuronima hipotalamusa. Sci Rep. 2020;10(1):19185.

23. Khare S, et al. ASS1 i ASL suzbijaju rast karcinoma bubrežnih stanica bistrih stanica putem izmijenjenog metabolizma dušika. Cancer Metab. 2021;9(1):40.

24. Gęgotek A, et al. Poređenje zaštitnog efekta askorbinske kiseline na interakcije redoks i endokanabinoidnog sistema in vitro kultiviranih fibroblasta ljudske kože izloženih UV zračenju i vodikovom peroksidu. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.

25. De Raedt T, et al. Iskorištavanje ranjivosti ćelija raka za razvoj kombinovane terapije za tumore izazvane ras. Cancer Cell. 2011;20(3):400–413.

26. Zhang X, et al. Praćenje peroksidacije lipida u pjenastim ćelijama pomoću sonde ciljane na lizozome i ratiometrijske sonde. Anal Chem. 2015;87(16):8292–8300.

27. Wei CY, et al. Analiza zasnovana na bioinformatici otkriva povišeni MFSD12 kao ključni promotor ćelijske proliferacije i potencijalni terapeutski cilj u melanomu. Onkogen. 2019;38(11):1876–1891.

28. Aldini G, et al. N-acetilcistein kao antioksidans i sredstvo za razbijanje disulfida: razlozi zašto. Free Radic Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, et al. Metabolomika lizozoma otkriva regulaciju efluksa aminokiselina iz lizosoma zavisnu od V-ATPaze i mTOR. Nauka. 2017;358(6364):807–813.

30. Zhou J, et al. Imunogena smrt ćelija u terapiji karcinoma: sadašnji i novi induktori. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, et al. Inhibicija PPT1 pojačava antitumorsko djelovanje anti-PD-1 antitijela kod melanoma. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.

32. Mehnert JM, et al. BAMM (BRAF autofagija i MEK inhibicija kod melanoma): ispitivanje faze I/II dabrafeniba, trametiniba i hidroksihlorokina u uznapredovalom BRAFV600-mutantnom melanomu. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, et al. Proteini makroautofagije kontrolišu nivoe MHC klase I na dendritskim ćelijama i oblikuju antivirusne CD8(+) T ćelijske odgovore. Cell Rep. 2016;15(5):1076–1087.

34. Jouandin P, et al. Lizozomalna mobilizacija cisteina oblikuje odgovor TORC1 i rasta tkiva na gladovanje. Nauka. 2022;375(6582):eabc4203.

35. Schwalfenberg GK. N-acetilcistein: pregled kliničke korisnosti (stari lijek s novim trikovima). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.

36. Beer LA, et al. Sistematsko otkrivanje serumskih biomarkera vanmaterične trudnoće koristeći 3-D profiliranje proteina zajedno s kvantitacijom bez oznaka. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, et al. Primarni efekat na proteom ARID1A-mutiranog karcinoma jajnika jajnika je smanjenje regulacije mevalonatnog puta na post-transkripcionom nivou. Mol Cell Proteomics. 2016;15(11):3348–3360.

38. Cox J, Mann M. MaxQuant omogućava visoke stope identifikacije peptida, individualizovanu tačnost mase u opsegu ppb i kvantifikaciju proteina na nivou proteoma. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.

39. Cox J, et al. Andromeda: pretraživač peptida integrisan u MaxQuant okruženje. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.

40. Cox J, et al. Precizna kvantifikacija bez oznaka za čitav proteom odloženom normalizacijom i ekstrakcijom maksimalnog omjera peptida, nazvana MaxLFQ. Mol Cell Proteomics. 2014;13(9):2513–2526.

41. Tyanova S, et al. Perseus računarska platforma za sveobuhvatnu analizu podataka (prote)omike. Nat Methods. 2016;13(9):731–740.

42. Tyanova S, Cox J. Perseus: bioinformatička platforma za integrativnu analizu proteomskih podataka u istraživanju raka. Metode Mol Biol. 2018;1711:133–148.

43. Alicea GM, et al. Promjene u metabolizmu lipida fibroblasta u starosti induciraju otpornost stanica melanoma ovisnu o starosti na ciljanu terapiju putem transportera masnih kiselina FATP2. Cancer Discov. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ran FA, et al. Inženjering genoma pomoću sistema CRISPR-Cas9. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.

45. Liu P, et al. Kvantifikacija izloženosti kalretikulinu povezane s imunogenom smrću stanica. Metode Enzymol. 2020;632:1–13.