Inhibitor LRRK2 kinaze pomlađuje ćelijsko starenje uzrokovano oksidativnim stresom u neuronskim stanicama 1. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Pozadina.Ponovljena kinaza 2 (LRRK2) bogata leucinom igra ključnu ulogu u patogenezi Parkinsonove bolesti (PD). Starenje je najkritičniji faktor rizika za napredovanje PD. Utvrđena je korelacija između starenja i ćelijskog starenja. Ćelijsko starenje je u korelaciji sa disregulacijom proteolitičkog puta i mitohondrijalnom disfunkcijom, koji su takođe povezani sa agregacijom -sinukleina ( -syn). Metode. Ljudske ćelije slične dopaminergičnim neuronima (diferencirane SH-SY5Y ćelije) tretirane su rotenonom u prisustvu ili odsustvu inhibitora LRRK2 kinaze GSK2578215A (GSK-KI) tokom 48 sati. Markeri ćelijskog starenja, uključujući p53, p21Wafi/Cip1(p21), -galaktozidazu(-gal), fosforilaciju Rb, aktivnost povezanu sa starenjem (SA) -gal ilizozomalniaktivnosti, ispitani su. Dash ćelije i primarni kortikalni neuroni štakora tretirani su -syn fibrilima 30 minuta prije tretmana rotenonom u prisustvu ili odsustvu GSK-KI tokom 48 h. Miševima je intraperitonealno ubrizgan rotenon i MLi-2 (inhibitor kinaze LRRK2) jednom svaka dva dana tokom dvije sedmice. Rezultati. Rotenon je pojačao regulaciju fosforilacije LRRK2 i nivoe -gal kroz aktivaciju p53-p21 signalne ose i smanjenu fosforilaciju Rb. Dodatno, rotenon je povećao aktivnost SA-gal, nivoe reaktivnih vrsta kiseonika i LRRK2fosforilacijai inhibirao aktivnost lizosoma. Rotenonom indukovana regulacija LRRK2 narušena je klirens a-syn fibrila. Tretman inhibitorom LRRK2 ublažio je ćelijsko starenje i akumulaciju -syn izazvano rotenonom. Zaključci. Rotenonom indukovana regulacija aktivnosti LRRK2 kinaze promovirala je ćelijsko starenje, što je pojačalo akumulaciju -syn. Međutim, primjena inhibitora LRRK2 kinaze pomlađuje ćelijsko starenje izazvano rotenonom.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

1. Uvod

Parkinsonova bolest (PD), koja je najčešća neurodegenerativna bolest, karakterizirana je poremećenom motoričkom kontrolom[1]. Nekoliko genetskih i okolišnih faktora doprinose patogenezi PD[2-5]. LRRK2, glavni genetski faktor rizika za PD, pokazuje i GTPazu i kinaznu aktivnost [6]. LRRK2 G2019S mutant, koji pokazuje pojačanu aktivnost kinaze, promoviše napredovanje PD [7]. Rizik od razvoja PB kod pacijenata koji nose mutant G2019S raste sa godinama [8] jer je starenje povezano s progresijom neurodegenerativnih bolesti [9]. Ranije smo izvijestili da aktivnost LRRK2 kinaze promovira ćelijsko starenje i inhibira degradaciju alfa-sinukleinskih (-syn) agregata [10]. -Syn je glavna komponenta Lewyjevih tijela (LB) ili Lewyjevih neurita, koji su postmortem markeri PD. Oštećena degradacija -syn rezultira njegovom agregacijom [11].

Ćelijsko starenje narušava mašineriju razgradnje proteina[12-14]. Izlaganje niskim dozama rotenona, za koje se navodi da indukuje PD, promoviše ćelijsko starenje u ćelijskoj liniji ljudske trabekularne mreže [15]. Dodatno, rotenon povećava aktivnost LRRK2 kinaze u neuronima [16]. Stoga smo pretpostavili da rotenon promovira ćelijsko starenje kroz aktivaciju LRRK2 kinaze i posljedično pojačava -syn agregaciju.

Cistanche može poboljšati imunitet

2. Metode i materijali

2.1. Ćelijska kultura i tretman.

Ćelijska linija humanog neuroblastoma (SH-SY5Y ćelije) uzgajana je u medijumu za rast (Dulbecco-ov modifikovani Eagleov medijum (DMEM;10-013-CV; Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dopunjen sa 1{{ 48}} posto fetalnog goveđeg seruma (FBS, 35-010-CV, Corning cellgro), 1 posto penicilina/streptomicina (P/S, 10378-016, Gibco, Thermo Fisher Scientific) i 1 posto reagensa za uklanjanje mikoplazme (KOMA)) na 37 stepeni u 5% CO, inkubatoru (Thermo Fisher Scientific). Diferencirane ćelije SH-SY5Y (dSH ćelije) su dobijene nakon tretmana sa 10 μM all-trans retinoinske kiseline (R2625-100MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pripremljene u medijumu za rast jednom u dva dana za sedam dana. Dana 7 nakon tretmana retinoidnom kiselinom, ćelije su tretirane rotenonom (1 uM) i GSK2572815A (GSK-KI); Inhibitor LRRK2 kinaze;1μM) pripremljen u mediju za rast 48 h. Dimetil sulfoksid (DMSO) je korišten kao nosač za rotenon i GSK-KI. -syn fibrili su pročišćeni kako je prethodno opisano [10]. Ćelije tretirane rotenonom i GSK-KI tretirane su a-syn fibrilima (70 nM). Primarni kortikalni neuroni pacova tretirani su rotenonom (1 μM), GSK-KI (l μM) i a-syn fibrilom (70 nM) tokom 48 sati. Uslovi liječenja primarnih kortikalnih neurona pacova bili su identični onima korištenim za dSH. Ćelije su dva puta isprane ledeno hladnim fosfatnim puferom (PBS) i lizirane u 1 x puferu za uzorke (50 mM Tris-HCl (pH6,8), 2 procenta natrijum dodecil sulfata, 10 procenata glicerola, 1 procenat -merkaptoetanola i 0,02 postotak bromofenol plavog).

2.2.Izolacija i kultura primarnih kortikalnih neurona iz E16 embriona pacova.

Trudne pacove su eutanazirane sa CO, gasom. Uterus je seciran, a fetusi iz embrionalnih vrećica stavljeni su u ledeno hladan HBSS-/-(14175-079, Gibco, Thermo Fisher Scientific). Lubanja je oguljena pincetom, a korteksi su secirali iz cijelog mozga. Nakon uklanjanja meninga, korteksi su inkubirani sa 0.25 posto Tripsin-EDTA (25200-056, Gibco, Thermo Fisher Scientific) na 37 stepeni C 20 min u vodeno kupatilo. Zatim su korteksi inkubirani sa 40 ug/mL DNase I (DN25, Sigma-Aldrich), lagano vorteksirani i inkubirani 5 minuta u vodenom kupatilu od 37 stepeni. Većina supernatanta je uklonjena usisavanjem, a uzorci su inkubirani sa serumskim inhibitorom koji sadrži MEM(11090-08,Gibco, Thermo Fisher Scientific),1,5% DMEM,5% FBS,2,5mg/mL goveđi serum albumin (BSA; A7906, Sigma-Aldrich) i 2,5 mg/mL inhibitora tripsina (T9253, Sigma-Aldrich). Inhibitor seruma je uklonjen, a ćelijska peleta je resuspendirana u 10 puta većoj zapremini sa medijumom za rast. Sastav medijuma za rast bio je sledeći: neurobazalni medijum (21103-049, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific), 2 procenta B-27(17504044, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific) i 1x GlutaMAX{ {34}}(35050-061, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific). Izolirane ćelije primarnog kortikalnog neurona štakora (3×10 stepeni/jažicu) zasijane su u 12-ploču (SPL30012, SPL Life Sciences, Pochoen, Južna Koreja) i kultivisane u medijumu za rast na 37 stepeni u 5 procenat CO, inkubator 24h. Medijum za kulturu je zamenjen medijumom za rast sa dodatkom 0,2 mg/mL 5-fluoro-2'-deoksiuridina (F0503, Sigma-Aldrich) i 96 ug/mL uridina (U3750, Sigma-Aldrich) da se inhibiraju mitozu. Dana 6, ćelije su tretirane sa 1 uM rotenona, 1 uM GSK-KI i 70 nM -syn fibrila tokom 48 sati i sakupljene sa lx pufera za uzorke.

2.3. Western Blot.

Western blot je izveden kao što je prethodno opisano [17]. Za western bloting korišćena su sljedeća antitela: zečja anti-LRRK2 fosfo-S935 monoklonska (ab133450,Abcam, Cambridge,UK), zečja anti-LRRK2 fosfo-S1292 monoklonska (ab203181, Abcam2 monoklonska anti-LRRK2) N241A/34, Neu-roMab, UC Davis, Kalifornija, SAD), mišji anti-p53 monoklonski (za humani p53:sc-126; za miš p53:sc-393031; Biotechnology Santa Cruz, Dallas, TX, SAD), miš anti-p21wafi/-Ccip1(p21) monoklonski (CM5131, ECM Biosciences, Ver-sailles, KY, SAD), miš anti-Rb monoklonski (#9309S, tehnologija ćelijske signalizacije (CST), Danvers, MA , SAD), anti-phosphoRb (Ser807/811) (#9308S, CST), mišja anti- -galaktozidaza monoklonska (sc-377257, Santa Cruz Biotech-nology), mišja anti-p62 monoklonska (ab56416 ,Abcam), mišji anti- -aktin monoklonski(sc-47778; Bio-tehnologija Santa Cruz), poliklonski anti-LC3B zeca (#2775S; CST), mišji anti- -syn (klon 42)monoklonski (610786; BD Bio-sciences, San Jose, CA, SAD),anti-fosfo-treonin-argi-nine(#2351S, CST), anti-p53(SC-99, Santa Cruz Biotechnology),anti-LaminB(SC-6216,Santa Cruz Biotech-nology), AffiniPure konjugiran s kozjom peroksidazom anti-mišji IgG(H plus L)(#115-035-003;Jackson Immunoresearch Labo-ratories Inc., West Grove, PA, SAD) i kozakonjugiran s peroksidazomAffiniPure anti-zečja IgG(H plus L)(#1l1-035-144; Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.) antitijela. Imunoreaktivni signali u nitroceluloznoj membrani razvijeni su pomoću Luminata Crescendo Western HRP (#WBLUR0500, Merck & Co. Inc., Kenilworth, NJ, SAD), a slike su snimljene kamerom MicroChemi4.2 (Shimadzu, Kyoto, Japan).

2.4. Proximity Ligation Assay (PLA) i imunofluorescencija (IF).

PLA je izvedena korištenjem Duolink⑨ In Situ Reagents Green (DUO{{0}}RXN, Sigma-Aldrich), DuolinkeIn in Situ PLA4Probe Anti-Mouse MINUS antitijela (DUO92002-100RXN, Sigma-Aldrich) , i Anti-Rabbit Plus antitijela (DUO92004-100RXN, Sigma-Aldrich), slijedeći uputstva proizvođača. SH-SY5Y ćelije zasijane u 96-jažice crne ploče (655077, Greiner Bio-One, Krems-münster, Austrija) su diferencirane, a diferencirane ćelije su tretirane rotenonom i GSK-KI 7. dana. dva puta su isprani ledeno hladnim Dulbecco PBS (DPBS), fiksirani sa 4 posto paraformaldehida 30 minuta na sobnoj temperaturi (RT) i isprani triput ledeno hladnim DPBS. Zatim su ćelije permeabilizirane korištenjem 0,1 posto Triton X-100 pripremljenog u DPBS. Nakon tri puta ispiranja sa hladnim DPBS, ćelije su inkubirane sa kapljicom rastvora za blokiranje na 37C tokom 1h. Blokirajući rastvor je uklonjen, a ćelije su inkubirane sa antitelima (50 μL) na 37 stepeni tokom 3 sata. Mješavina antitijela se sastojala od razblaživača antitela iz kompleta (antitela korišćena za PLA: mišje anti-LRRK2 monoklonsko (1:20) antitelo i zečje anti-LRRK2 fosfo-S1292 monoklonsko (1:20) antitelo); korišćeno za IF test: pileće anti- -gal poliklonsko antitelo (1:400, ab9361, Abcam)). U IF testu, antitelo je dodavano tokom celog procesa do koraka primene PLA. Uzorci su zatim dva puta isprani sa 1x puferom za ispiranje A tokom 5 minuta. Da bi se pripremio rastvor sonde, Duolink⑧In Situ PLA· sonda Anti-Mouse Minus i Anti-Rabbit Plus su pomešani sa razblaživačem antitela (1:5). Za IF test, anti- -gal antitelo je takođe dodato (1:400) u smešu. Ćelije su inkubirane sa 50 μL rastvora sonde na 37 C tokom 1 sata. Zatim su ćelije isprane dva puta sa lx pufera za ispiranje A tokom 5 minuta. Za IF test, ligaza (40:1) i anti- -gal antitelo (400:1) su pomešani u puferu za ligaciju. Ćelije su inkubirane sa rastvorom za ligaciju (50 μL) na 37 stepeni tokom 30 minuta i isprane dva puta sa lx puferom za pranje A tokom 5 minuta. Za IF test,polimeraza(1:40)je inkubiran sa kozjim anti-pilećim IgY H plus L(Alexa Fluor② 594; ab150172)sekundarnim antitelom (1:500) 100 minuta na 37C. Ćelije su isprane dva puta sa 1x puferom za ispiranje B tokom 10 minuta, nakon čega je usledilo ispiranje sa 0,01x puferom za ispiranje B tokom 1 min. Za bojenje jezgra, ćelije su inkubirane sa Hoechst 33342(1:1000;62249, Thermo Fisher Scientific) pripremljenim u DPBS na sobnoj temperaturi 10 minuta. Slike ćelija u 96-crnim pločama u bunarima su snimljene pomoću konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa (LSM 700, Carl Zeiss Jena, Njemačka).

2.5. Imunoprecipitacija.

Celoćelijski lizati dSH ćelija tretiranih rotenonom (1 μM) i GSK-KI (1 uM) pripremljeni su pomoću rastvora za lizu (PBS, 1 posto Triton X-100, 1x koktel inhibitora proteaze i lx fosfataze koktel inhibitora). Lizati su centrifugirani na 4,{9}}g i 4 stepena 5 minuta, a supernatant je inkubiran sa anti-p53 antitelom (554293, BD Biosciences) i PierceProtein G Aga-rose (20398, Thermo Fisher Scientific) resuspendovan u rastvoru za lizu tokom 12h. Zrnca su dva puta isprana rastvorom za lizu, a kompleks zrno-protein je denaturisan sa lx pufera za uzorke.

2.6. Nuclear Fractionation.

Nuklearna frakcija je izolirana korištenjem NE-PERr reagensa za nuklearnu i citoplazmatsku ekstrakciju (78833, Thermo Fisher Scientific), slijedeći upute proizvođača.

2.7. Priprema mRNA i kvantitativna lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu (qRT-PCR).

mRNA je izolovana iz dSH ćelija tretiranih rotenonom/GSK-KI upotrebom RNeasy Plus Mini kita (74134, QIAGEN, Hilden, Njemačka). Zatim je mRNA reverzno transkribovana u komplementarnu DNK (cDNK) koristeći TOPscript komplet za sintezu cDNA (EZ005S, Enzynomics, Daejeon, Republika Koreja). cDNA je podvrgnuta qRT-PCR koristeći TOPreal"qPCR 2x Pre-MIX (SYBR Green sa niskim ROX, UDG plus)(RT500M, Enzynomics). Za qRT-PCR su korišteni sljedeći prajmeri: humani p21,5'-ATG AAA TTC ACC CCC TTT CC-3'(naprijed)) i 5'-CCC TAG GCT GTG CTC ACT TC-3'(obrnuto); ljudski p16INK4(p16),5'-CCC AAC GCA CCG AAT AGT TAC-3'(naprijed) i 5'-CAC GGG TCG GGT GAG AGT -3'(obrnuti).qRT-PCR je izveden na Mic qPCR ciklusu (MIC-4,BioMolecular Systems,Upper Coomera, Australija).

2.8. Mjerenje aktivnosti galaktozidaze (-Gal) povezane sa starenjem (SA), reaktivne vrste kisika (ROS) i aktivnosti lizozoma.

Nakon 30 minuta nakon tretmana, žive dSH ćelije su obojene sa 2 μM GlycoGREEN-Gal (GC611, Goryo Chemical Inc., Hokkaido, Japan), 5 uM 2',7'-diklorofluorescein diacetatom (DCFDA; 287810, Calbio-chem, CA, San Diego USA）,2μM LysoSensorm Blue DND-167 (L7533, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i 1 μM Hoechst 33342 za ispitivanje SA-gal aktivnosti, ROS, aktivnih lizosoma i jezgra, respektivno. montiran sa ProLongDiamond Antifade Mountant (P36965, Invitrogen) i snimljen pomoću konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa. Diferencijalne kontrastne slike dobijene su konfokalnim laserskim skenirajućim mikroskopom. 2.9.SA -Gal Activity Assay. SA -gal aktivnost je ispitana pomoću { {21}}komplet za ispitivanje ćelijskog starenja (CBA-213, Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, SAD), slijedeći uputstva proizvođača.

2.10. Rukovanje mišem i administracija lijekova.

S miševima je postupano kako je prethodno opisano [18] u skladu sa smjernicama Dankook Animal Ethics Committee (Dankook IACUC,18-026). C57BL/6] mužjacima miševa starosti 16 sedmica intraperitonealno je ubrizgan rotenon (0 .75 mg/kg tjelesne težine) i MLi-2 (inhibitor LRRK2 kinaze; 1mg/kg tjelesne težine) jednom svaka dva dana tokom dvije sedmice.

2.11.Rotarod test i priprema moždanog tkiva.

Dana 14. nakon tretmana, miševi su postavljeni na rotirajući štap u obliku cilindra. Zabilježeno je vrijeme potrebno da padne na pod. Pojedinosti o testu rotaroda opisani su na drugom mjestu [18]. Zatim su miševi eutanazirani i transkardijalno perfuzirani ledeno hladnim HBSS koji sadrži Ca2 i Mg. Srednji mozak je seciran mikro škarama i pincetom. Tkiva su lizirana u PBS-u koji je sadržavao 1 posto Triton X-100, 1xXpert koktel otopine inhibitora proteaze (P3100, GenDEPOT, Katy, TX, SAD) i lx Xpert otopine koktela inhibitora fosfataze (P3200, GenDEPOT). Uzorci su homogenizirani korištenjem Pellet Pestle akumulatorskog motora (Sigma-Aldrich). Supernatant je podvrgnut western blot-u, testu aktivnosti SA-gal i testu imunog enzima (ELISA).

2.12.ELISA za oligomerne -Syn.

Prethodno smo uspostavili sendvič ELISA za analizu fibrilarnih -syn oligomera koristeći antitijelo koje prepoznaje filamentnu konformaciju -syn agregata [17]. Sirovi lizati srednjeg mozga podvrgnuti su ELISA testu, a agregati -syn su kvantificirani korištenjem standarda -syn fibrila.

2.13. Analiza slike i podataka.

Intenzitet PLA i bojenja živih ćelija mjereni su pomoću Zen 2012 (Carl Zeiss). Denzitometrija ciljnih proteina je izvršena korištenjem

SLIKA 1: Aktivacija LRRK2 kinaze izazvana rotenonom promoviše ćelijsko starenje u diferenciranoj ćelijskoj liniji humanog neuroblastoma. Western blotting analiza dSH ćelija tretiranih sa 1 uM rotenonom ili 1 uM GSK2578215A (GSK-K), inhibitorom LRRK2 kinaze, tokom 48 sati koristeći antitela protiv ciljnih proteina (a). Gustine proteina su normalizovane na one za -aktin (bg).n =3.(h) dSH ćelije tretirane sa 1 uM rotenonom ili 1 uM GSK-KI tokom 48 sati podvrgnute su testu blizine ligacije (PLA) phospho-S1292 LRRK2 i total IRRK2(PIA-pS1292) i imunofluorescentna (TF) analiza -galaktozidaze, jezgre su obojene sa Hoechst 33342. Kontrole korištene u PLA i IF bojenju otkrile su validnost rezultata (dva desna panela). Intenzitet PLA-pS1292(i) i -galaktozidaze (j) je normalizovan na intenzitet 4',6-diamidino-2-phenylindole.n= 4; broj ćelija= 12-17.

Multi Gauge (Fujilm, Tokio, Japan). Svi skupovi podataka su analizirani i grafički prikazani pomoću Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Podaci iz eksperimenata izvedenih pomoću dSH ćelija i primarnih kortikalnih neurona pacova analizirani su korištenjem dvosmjerne analize varijanse (ANOVA), nakon čega slijedi Bonferronijev post hoc test (n=3). u međuvremenu,the data obtained from mouse experiments, live-cell stain-ing,and PLA in the dSH cells were analyzed using two-way ANOVA, followed by Tukey's post hoc test (n>3). Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna greška srednje vrijednosti. *str<><><><0.0001,and n.s.="not">

SLIKA 2: Inhibitor LRRK kinaze inhibira aktivaciju p53 u diferenciranoj ćelijskoj liniji humanog neuroblastoma. (a) Sakupljeni su lizati cijelih stanica (20 posto), koji su korišteni kao ulaz za imunoprecipitaciju (IP), i nuklearna frakcija. Analiza je otkrila da je 20 posto unosa pokazalo rezultate slične onima koji su uočeni na slici 1. (b, c) IP uzorci su denaturirani i podvrgnuti western blotingu. Nivoi fosforilacije TXR mesta u p53 su normalizovani na ukupne nivoe p53. n=3.(de)Ukupni nivoi p53 u nuceusu su ispitani pomoću western blotinga. LaminB je korišten za normalizaciju nivoa nuklearnog p53. n=3.(f) Nivoi mRNA p21 i pl6 u tretiranoj grupi su normalizovani na one u grupi tretiranoj vehikulumom (dimetil sulfoksid-), n =3.

Ovaj članak je preuzet iz knjige Hindawi Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2021, ID članka 9969842, 16 stranica https://doi.org/10.1155/2021/9969842