baJezik
Dom / Znanje / Sadržaj

Znanje

Duga nekodirajuća RNA KCNQ1OT1 reguliše protein kinazu CK2 preko MiR-760 u starenju i ograničenju kalorija Ⅱ

May 08, 2023

3. Diskusija

Epigenetic regulation mechanisms, including microRNAs (miRNAs), nucleosome remodeling, DNA methylation, and histone modification, can change heritable phenotypes without changing the DNA sequence (26). There are two main classes of non-coding RNAs(ncRNAs): the larger long ncRNAs (IncRNAs; >200 nukleotida), i manje miR.NA (21-25 nukleotida) [1-3]. KCNO10T1 je prvobitno identifikovan kao lncRNA, koja utišava nekoliko gena unutar kcng1 lokusa uspostavljanjem strukture višeg reda hromatina (4 61. Nedavno su drugibiološke funkcije KCNO1OT1su prijavljeni uključujući i one povezane safibroza,cerebralna ishemija,ateroskleroza moždanog udara, onkogeneza, osteogene diferencijacije, zarastanje preloma, isrčana hipertrofija(7-13). Međutim, detaljni mehanizmi pomoću kojih KCNO10T1 reguliše ćelijsko starenje i CR su još uvijek nepoznati. Stoga smo pokušali da razjasnimo da li je KCNO10T1 bio uključen u starenje i CR. Ova studija pokazuje da je knockdown KCNO10T1 izazvao nekoliko markera ćelijskog starenja, uključujući indukciju SA--gal aktivnosti, aktivaciju p53-21Cip1/WAF1 puta, povećanu trimetilaciju H3K9 koja je potrebna za formiranje SAHF i faktor SASP (L{{ 13}}, IL-6 i MMP3) u ćelijama humanog raka HCT116 i MCF-7 (Slike 1 i 2A). Budući da je oksidativni stres značajan uzrok starenja (14,15 istražen je efekat KCNO10T1 na generiranje ROS. Kao što se očekivalo, KCNO1OTknockdown povećao je unutarćelijski ROS u HCT116 i MCF-7 ćelijama (Slika 2B). Dodatno, nivo KCNO10T1 mRNA je smanjena u starim ćelijama izazvanim LPS-om, a ektopična ekspresija KCNQ10T1 potisnula je ekspresiju SASP faktora posredovanu LPS-om u ovim ćelijama raka (Slika 3A,B). Nadalje, KCNO10T1 nokdaun inducira aktivnost SA-B-gal u IMR-u humanih plućnih fibroblasta{ {39}} ćelija, a ekspresija KCNO10T1 je smanjena tokom replikativnog starenja u IMR-90 ćelijama (Slika 6). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da KCNO10T1 djeluje kaoreagens protiv starenjaiantioksidansu ljudskim ćelijama raka zalijepljene za fibroblaste.

Cistanche Benefits in depression

Kliknite ovdje da biste saznali više Cistanche dodataka protiv starenja

Ranije je pokazano da Ck2 knockdown inducira markere starenja kao što je SA-gal bojenje [16], aktivacija p53-p21Cip1/WAF1 puta (generacija 171ROS [18SAHF formiranje (19l, i ekspresija SASP faktora 20).) istražena je veza između KCNO10T1 i CK2 Ova studija pokazuje da je prekomjerna ekspresija CK2x poništila ove markere starenja uzrokovane padom KCNO10T1 (slike 1, 2 i 6B) Dodatno, obaranje KCNO10T1 smanjilo je proteine ​​i mRNA (nivoe CK2A2 i mRNA CKA2 i B44). ), a prekomjerna ekspresija KCNO10T1 (36,181-37,140) stimulirala je nivo mRNA CK2x (slika 4A), što ukazuje da KCNQ1OT1 funkcionira kao pozitivan regulator CK2a u stanicama. Nedavne studije su otkrile da lncRNA mogu sunđer miRNA inhibirati ekspresija ciljne mRNA (1-3). Budući da su prethodne studije pokazale da miR-760 interaguje sa CK2a (21,22] i KCNO10T1 [27], signalnom mrežom KCNO10T1, CK2x i miR{{ 47}}. Ova studija pokazuje da dodatni tretman sa miR-760 oponaša potisnutu KCNQ10T1-posredovanu CK2x regulaciju, a dodatni tretman miR-760 inhibitorom potiskuje KCNO10T1 posredovanu knockdownom CK2 downregulation (Slika 4). Konzistentno, tretman sa LPS, koji je smanjio ekspresiju KCNO10T1, povećao je nivo miR-760 (slika 3C). Stoga, ove studije sugeriraju da količina KCNQ1OT1 RNK može titrirati miR-760 i na taj način regulisati dostupnost miR-760 za vezivanje za mRNA CK2x. KCNO1OT1 i CK2a mogu preslušavati kroz sposobnost svog transkripta da se takmiče za miR-760 vezivanje.

KSL01

Zato što CR pružaefekat protiv starenja(23], ispitano je kako CR reguliše KCNQ1OT1 i miR-760. Ova studija pokazuje da CR stanje povećava ekspresiju KCNO10T1 i CK2x i smanjuje nivo miR-760 (Slika 5A,B). , tretman sa miR-760 oponaša potisnutu CR-posredovanu CK2x regulaciju (Slika 5C). Konzistentno, KCNO10T1 nokdaun je povećao nivoe miR-760, dok su dodatni uslovi potisnuli miR posredovano obaranjem KCNQ10T1{19} } indukcija (Slika 5D). Konačno, CR stanje je spasilo smanjenu ekspresiju KCNO1OT1 i CK2a, posredovanu replikativnim starenjem (Slika 6C). Sveukupno, ovi rezultati su otkrili da je CR stanje smanjilo miR-760 putem povećanja KCNO10T1, što rezultira povećanjem CK2x u ljudskim ćelijama. Iako lncRNA SNHG6 djeluje kao spužva miR-760u CRC stanicama [25], CR nije promijenio ekspresiju SNHG6 u eksperimentalnim uvjetima (podaci nisu prikazani). Kako CR pojačava regulaciju KCNQ1OT1 Druge grupe su ranije pokazale da faktori transkripcije NFY i -catenin regulišu KCNO10T1 (28,29). Međutim, CR nije mogao da reguliše ekspresiju NF-Y i B-katenina najmanje u eksperimentalnim uslovima (podaci nisu prikazani). Stoga su potrebne dodatne studije da bi se identifikovao specifični uzvodni regulator KCNO10T1 u uslovima CR.

U zaključku, na osnovu rezultata ove studije, predložen je model za ulogu KCNQ1OT1 u starenju i CR. KCNQ1OT1 pojačava regulaciju CK2 tako što uništava miR-760. KCNQ1OT1–miR-760–CK2 put je uključen u starenje i CR. Tretman LPS-om i dioba stanica u fibroblastima induciraju starenje smanjenjem KCNQ1OT1. CR potiskuje starenje aktiviranjem puta KCNQ1OT1–miR-760–CK2 (slika 6D). Stoga ova studija sugerira KCNQ1OT1 kao novu terapijsku metu kod starenja i bolesti povezanih sa starenjem, kao i kao alternativni tretman koji oponaša efekte CR.


4. Materijali i metode

4.1. Materijali

Antitijelaprotiv CK2 (#sc-373894), p53 (#sc-71820), p21Cip1/WAF1 (#sc-6246) i -actin (#sc-47778) su dobijeni iz Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornija, SAD). Antitijela specifična za histon H3- (#ab1791) i histon H3 Lys9 trimetilaciju (H3K9me3) (#ab8898) kupljena su od Abcam-a (Cambridge, Engleska). Od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, SAD). CM-H2DCFDA je nabavljen od Invitrogena (Carlsbad, CA, USA).

4.2. Ćelijska kultura i CR

IMR-90 ćelije ljudskih diploidnih fibroblasta su dobijene iz Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC, Manassas, VA, SAD) na nivou udvostručavanja populacije (PDL) od 24. MCF-7 ćelije raka dojke kod ljudi, ćelije raka debelog crijeva HCT116 (ATCC) i IMR-90 ćelije su uzgajane u Dulbecco-ovom modificiranom Eagleovom mediju koji sadrži 10 posto (v/v) fetalnog goveđeg seruma i 1 posto (v/v) penicilin-streptomicina, u vlažnoj atmosferi od 95 posto (v/v) zraka i 5 posto (v/v) CO2 na 37 ◦C. PDL IMR-90 ćelija je izračunat korištenjem formule PD=log(Nf/Ni)/log2, gdje je Nf konačni broj ćelije, a Ni početni broj zasijanih ćelija. Za izgladnjivanje ćelija (ograničenje kalorija), ćelije sa fosfatnim puferom su isprane dva puta i kultivisane u Earleovoj izbalansiranoj otopini soli (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), sa 5,5 mM glukoze, bez aminokiselina, sedam sati.

KSL16

4.3. Ekstrakcija RNK i miRNA kvantitativni PCR u realnom vremenu

RNK je ekstrahirana iz ćelija pomoću TRIzol reagensa (Invitrogen). miRNA kvantitativni PCR u realnom vremenu (qPCR) izveden je korištenjem TaqMan miRNA kompleta za reverznu transkripciju i putem miRNA testa sa ABI PRISM 7000 HT sistemom (Applied Biosystems, Kalifornija, SAD), slijedeći uputstva proizvođača. Mala nukleolarna RNK U48 (RNU48) odabrana je kao referentni gen za održavanje male RNK. PCR u realnom vremenu izvedeni su u tri primjerka iz tri različita cDNK uzorka.

4.4. Transfekcija DNK i interferencija RNK

Za generiranje pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36,181–37,140), fragment nukleotida od 36,181 do 37,140 KCNQ1OT1 je hemijski sintetiziran i ligiran u BamHI/NotI mjesto vektora pcDNA3.1. Ćelije su transficirane sa pcDNA3.1-HA-CK2 i pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36,181– 37,140) koristeći Polyfect (Qiagen, Hilden, Njemačka), prema uputama proizvođača. Mimici za miR-760 i kontrolnu miRNA su kupljeni od Genolution, Inc. (Seul, Koreja). Antisens inhibitor za miR-760 je nabavljen od Panagene, Inc. (Seul, Koreja). SiRNA sekvenca za CK2 bila je 50 -GAUGACUACCAGCUGGUUCdTdT-30. SiRNA sekvenca za KCNQ1OT1 bila je 50 –GCCAAUGGAUAGAGAGCAAdTdT-30. SiRNA sekvenca za negativnu kontrolu bila je 50 -GCUCAGAUCAAUACGGAGAdTdT-30 . RNK su transficirane u ćelije koristeći Lipofectamine (Invitrogen) tokom 48 h.

4.5. SA- -gal Activity Assay

Ćelije u sub-konfluentnim kulturama su isprane ledeno hladnim fosfatnim puferom (PBS), fiksirane sa 3 procenta (v/v) formaldehida u PBS-u 10 min na sobnoj temperaturi, a zatim inkubirane sa bojenjem rastvor koji sadrži 1 mg/mL 5-bromo-4-hloro-3-indolil-D galaktozida, 40 mM limunske kiseline-natrijum fosfata (pH 6,0), 5 mM kalijum fercijanida, 5 mM kalijum ferocijanida, 150 mM NaCl i 2 mM MgCl2 tokom 24 h na 37 ◦C. Plavo obojene ćelije su izbrojane u najmanje deset polja pri povećanju od 400 x i izražene kao postotak pozitivnih ćelija.

4.6. Mjerenje intracelularnih nivoa ROS

Fluorescentna sonda osjetljiva na oksidaciju CM-H2DCFDA korištena je za procjenu nivoa ROS. Ćelije su tretirane sa 5 µM CM-H2DCFDA 20 minuta na 37 ◦C u mraku,odvojen tripsinizacijom, a zatim ispran sa PBS. Intenzitet fluorescencije je odvraćaoiskopano pomoću Coulter Elite ESP Cell Sortera (Beckman Coulter Inc., Brea, Kalifornija, SAD). Thekapije za napredno i bočno raspršivanje su postavljene da isključe sve mrtve ćelije iz analize; najmanje10,000 događaja unutar kapije je prikupljeno po uzorku.

KSL13

4.7. Reverzna transkripcija (RT)-PCR

Ukupna RNK je ekstrahirana iz ćelija. RNK je reverzno transkribovana korišćenjem gen-specifičnih prajmera i reverzne transkriptaze (Takara Bio Inc., Japan), a rezultirajuća cDNK je PCR amplifikovana. Prajmeri koji se koriste za testove navedeni su u Dodatnoj tabeli S2. PCR proizvodi su razdvojeni na 1,5% agaroznom gelu. Kvantifikacija traka reverzne transkripcije-PCR izvedena je pomoću denzitometrije. - Nivoi aktinske RNK korišteni su za standardizaciju količine RNK u svakom uzorku.

4.8. Imunobloting

Proteini su odvojeni na 10 posto poliakrilamidnih gelova u prisustvu SDS i zatim prebačeni na nitrocelulozne membrane. Membrane su blokirane sa 5 posto (w/v) nemasnim, sušenim obranim mlijekom u TBST (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl i 0,05 posto Tween 20) tokom 2 sata a zatim inkubiran sa specifičnim antitelima u 1 procentu (w/v) nemasnom, osušenom obranom mleku 1 h. Membrane su tri puta isprane sa TBST, a zatim tretirane sa ECL sistemom da bi se razvili signali (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Kada se smatralo potrebnim, membrane su skinute puferom za skidanje (2 posto SDS, 100 mM -merkaptoetanola i 50 mM Tris-HCl (pH 7,0)) na 50 ◦C tokom 1 h uz lagano mućkanje, a zatim ponovo ispitane anti{{ 25}}aktinsko antitijelo kao unutrašnja kontrola opterećenja.

4.9. Statistička analiza

Jednosmjerna analiza testiranja varijanse podataka sprovedena je korištenjem programa SPSS paketa (IBM, Armonk, NY, USA). Rezultati su se smatrali značajnim ako je p-vrijednost bila<0.05. Duncan's multiple range test was conducted if the differences between the groups were identified as α = 0.05. 


Dodatni materijali: Sljedeće prateće informacije mogu se preuzeti na:

Doprinosi autora: Y.-SB je osmislio i dizajnirao eksperimente, YL je izveo eksperimente, a Y.-SB je napisao rad. Svi autori su pročitali i pristali na objavljenu verziju rukopisa.

Finansiranje: Ovo istraživanje je podržano od strane Programa osnovnih naučnih istraživanja, preko Nacionalne istraživačke fondacije Koreje (NRF) koju finansira Ministarstvo nauke, IKT i planiranja budućnosti (NRF-2019R1A2C1005219).

Izjava institucionalnog odbora za reviziju: Nije primjenjivo.

Izjava o informiranom pristanku: Nije primjenjivo.

Izjava o dostupnosti podataka: Nije primjenjivo.

Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.


Reference

1. Ulitsky, I.; Bartel, DP lincRNA: Genomika, evolucija i mehanizmi. Cell 2013, 154, 26–46. [CrossRef] [PubMed]

2. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nat. Rev. Genet. 2011, 12, 861–874. [CrossRef] [PubMed]

3. Quinn, JJ; Chang, HY Jedinstvene karakteristike duge nekodirajuće biogeneze i funkcije RNK. Nat. Rev. Genet. 2016, 17, 47–62. [CrossRef] [PubMed]

4. Mancini-Dinardo, D.; Steele, SJ; Levorse, JM; Ingram, RS; Tilghman, SM Elongacija Kcnq1ot1 transkripta je potrebna za genomsko utiskivanje susjednih gena. Genes Dev. 2006, 20, 1268–1282. [CrossRef] [PubMed]

5. Pandey, RR; Mondal, T.; Mohammad, F.; Enroth, S.; Redrup, L.; Komorowski, J.; Nagano, T.; Mancini-Dinardo, D.; Kanduri, C. Kcnq1ot1 antisense nekodirajuća RNK posreduje utišavanje transkripcije specifično za lozu kroz regulaciju na nivou hromatina. Mol. Cell 2008, 32, 232–246. [CrossRef]

6. Kanduri, C. Kcnq1ot1: Regulatorna RNA hromatina. Semin. Cell. Dev. Biol. 2011, 22, 343–350. [CrossRef]

7. Yang, F.; Qin, Y.; Lv, J.; Wang, Y.; Che, H.; Chen, X.; Jiang, Y.; Li, A.; Sun, X.; Yue, E.; et al. Utišavanje duge nekodirajuće RNK Kcnq1ot1 ublažava piroptozu i fibrozu kod dijabetičke kardiomiopatije. Cell Death Dis. 2018, 9, 1000. [CrossRef]

8. Yu, S.; Yu, M.; On, X.; Wen, L.; Bu, Z.; Feng, J. KCNQ1OT1 promovira autofagiju regulacijom miR-200a/FOXO3/ATG7 puta u cerebralnom ishemijskom moždanom udaru. Aging Cell 2019, 18, e12940. [CrossRef]

9. Yu, XH; Deng, WY; Chen, JJ; Xu, XD; Liu, XX; Chen, L.; Shi, MW; Liu, QX; Tao, M.; Ren, K. LncRNA kcnq1ot1 promoviše akumulaciju lipida i ubrzava aterosklerozu kroz funkcioniranje kao ceRNA kroz os miR-452-3p/HDAC3/ABCA1. Cell Death Dis. 2020, 11, 1043. [CrossRef]

10. Cagle, P.; Qi, Q.; Niture, S.; Kumar, D. KCNQ1OT1: Onkogena duga nekodirajuća RNA. Biomolecules 2021,

11, 1602. [Unakrsna referenca] 11. Wang, JL; Wei, X.; Wang, AG; Bai, Y.; Wu, XJ KCNQ1OT1 reguliše osteogenu diferencijaciju hBMSC po osi miR-320a/Smad5. EUR. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2020, 24, 2843–2854. [PubMed]

12. Chen, L.; Xiong, Y.; Yan, C.; Zhou, W.; Endo, Y.; Xue, H.; Hu, Y.; Hu, L.; Leng, X.; Liu, J.; et al. LncRNA KCNQ1OT1 ubrzava zacjeljivanje prijeloma putem modulacije miR-701-3p/FGFR3 ose. FASEB J. 2020, 34, 5208–5222. [CrossRef] [PubMed]

13. Chen, Y.; Zhang, Z.; Zhu, D.; Zhao, W.; Li, F. Knockdown KCNQ1OT1 ublažava hipertrofiju srca kroz modulaciju miR-2054/AKT3 ose. J. Thorac. Dis. 2020, 12, 4771–4780. [CrossRef] [PubMed]

14. Childs, BG; Durik, M.; Baker, DJ; van Deursen, JM Ćelijsko starenje kod starenja i bolesti povezanih sa starenjem: od mehanizama do terapije. Nat. Med. 2015, 21, 1424–1435. [CrossRef]

15. McHugh, D.; Gil, J. Starenje i starenje: uzroci, posljedice i terapijski putevi. J. Cell Biol. 2018, 217, 65–77. [CrossRef]

16. Ryu, SW; Woo, JH; Kim, YH; Lee, YS; Park, JW; Bae, YS Smanjenje regulacije protein kinaze CKII je povezano sa ćelijskim starenjem. FEBS Lett. 2006, 580, 988–994. [CrossRef]

Pitajte za više:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950



Moglo bi vam se i svidjeti