Lamivudin poboljšava kognitivni pad kod SAMP8 miševa: Integracija in vivo farmakološke evaluacije i mrežne farmakologije

Abstract

Inhibitori reverzne transkriptaze kao što je lamivudin (3TC) igraju važnu ulogu uprotiv starenja, ali njihov uticaj naneurodegenerativne bolesti uzrokovane starenjemnisu jasne, posebno o funkcijamanervnog sistema kao što je spoznaja. U ovoj studiji, davali smo 3TC miševima 8 (SAMP8) sklonom starenju sa ubrzanim starenjem gastričnom perfuzijom (100 mg/kg) tokom 4 sedmice. Naši rezultati su pokazali da je 3TC značajno poboljšaostatus starenja SAMP8 miševa, posebno pad kognitivne sposobnosti procijenjen Morrisovim testom vodenog lavirinta. Da bi se dalje istražili molekularni mehanizmipoboljšanje statusa starenjaSAMP8 miševa pomoću 3TC, qPCR i metode bojenja tkiva korišteni su za proučavanje moždanih tkiva (tj. hipokampusa i korteksa) miševa, dok je analiza mrežne farmakologije primijenjena za istraživanje potencijalnih ciljeva 3TC. Rezultati su pokazali da se nivoi mRNA gena odnose na dugo interspergirani element-1, interferonski odgovor tipa 1, fenotip lučenja povezan sa starenjem iAlchajmerova bolestu hipokampusu i korteksu SAMP8 miševa bili su povećani zbogstarenje, ali ovaj trend je djelimično preokrenuo 3TC. Rezultati histoloških studija pokazali su da 3TC smanjuje smrt hipokampalnih neurona, dok rezultati mrežne farmakološke analize ukazuju da 3TC može imati svoj utjecaj kroz više puteva, uključujući signalizaciju estrogena i signalne puteve PI3K/Akt i neuroaktivne interakcije ligand-receptor, što smo potvrdili in vitro eksperimentima. Ovi nalazi pružaju dokaze o terapeutskom potencijalu 3TC u liječenju neurodegenerativnih bolesti.

KLJUČNE RIJEČIstarenje, kognitivna sposobnost, lamivudin, long isprepleteni element-1, neurodegenerativne bolesti

Kinesko bilje Cistanche Effect OnInhibitori reverzne transkriptaze protiv starenja

1|UVOD

Do danas su starenje i neurodegenerativne bolesti, kao nprAlchajmerova (AD) ili Parkinsonova bolestkoji su povezani sa starenjem, sve su u porastu zbog globalnih demografskih promjena.1,2 kognitivni pad predstavlja ozbiljnu prepreku postizanju dugog i zdravog života. Decenijama su uloženi značajni napori u potrazi za lijekovima koji se mogu koristiti za liječenje kognitivne degeneracije sa starenjem.3 Posljednjih godina, dugo isprepleteni element-1 (L1) dobija sve veću pažnju kao potencijalni roman cilj za proučavanje starenja.4 L1 pripada najrasprostranjenijoj porodici retrotranspozona bez dugih terminala sa ~500,000 kopija, koji čine ~17 posto ljudskog genoma. L1 gen se sastoji od operona sa dva otvorena okvira čitanja (ORF1 i ORF2), od kojih su oba potrebna za retrotranspoziciju.5–7 ORF1 kodira protein (ORF1p) sa aktivnostima reverzne transkriptaze koje mogu inhibirati analozi nukleozida, kao što su lamivudin (2'-3'-deoksi-3'-tiocitidin, 3TC).8

Aktivni L1 može sintetizirati cDNK izvan hromatina, a zatim je ponovo umetnuti u genom kataliziran ORF1p, na kraju mijenjajući ekspresiju drugih gena i rezultirajući bolestima povezanim s genomskom nestabilnošću.9,10 Domaćin općenito inhibira prijenosnu aktivnost L1 kroz niz regulacija, kao što su epigenetska modifikacija i regulacija ograničavajućeg faktora domaćina.11,12 Transpozicija L1 generalno se dešava samo u zametnim ćelijama ili ćelijama raka, dok su nedavne studije pokazale da je L1 takođe veoma aktivan u centralnom nervnom sistemu ili ćelijama koje stare, iako osnovni neuronski mehanizmi L1 su nejasni.13 Studije su pokazale da faktori (npr. TREX1, RB1 i FOXA1) koji se odnose na mehanizam praćenja L1 nisu funkcionalni u ćelijskom starenju, što dovodi do aktivacije L1. TREX1 je 3' egzonukleaza koja razgrađuje strane invazivne DNK i njegov gubitak je povezan sa akumulacijom citoplazmatske L1 cDNA.14 Pokazalo se da se RB1 vezuje za elemente koji se ponavljaju, uključujući L1 elemente, i podstiče njihovu heterohromatinizaciju.15 A FOXA1 je regulirano naviše u senescentnim ćelijama13 i vezano za centralnu regiju L1 5' UTR. Aktivirani L1 dalje aktivira odgovor interferona tipa I (IFN-I), koji inducira upalu putem reverzne transkripcione cDNK i održava fenotip sekrecije povezan sa starenjem (SASP). Stoga, kao važan faktor aseptične upale uzrokovane starenjem, L1 se smatra važnom metom za liječenje bolesti povezanih sa starenjem. Kod starijih miševa tretiranih sa 3TC, akumulacija inflamatornih faktora je poboljšana inhibicijom ekstracelularne transkripcije L1 u mišićnom i drugim tkivima.16 Do danas, studije o efektima inhibitora reverzne transkriptaze na funkcije nervnog sistema su rijetke. Nedavno su hiljade varijanti genomske cDNK (gencDNA) pronađene u mozgu preminulih pacijenata sa AD, što je rezultat ponovnog umetanja karakterističnih varijanti spajanja RNK u genom.17 Ovaj fenomen se smatra važnim uzrokom AD. Faktori koji uzrokuju stvaranje gencDNK uključuju transkripciju, destrukciju DNK, reverznu transkriptazu i starenje.

Istraživanja su pokazala da je proces formiranja gencDNK blokiran upotrebom nukleozidnih inhibitora reverzne transkriptaze u ćelijskim linijama jajnika kineskog hrčka (CHO) sa aktivnostima endogene reverzne transkriptaze.19 Nadalje, pacijenti sa AIDS-om stariji od 65 godina koji su uzimali inhibitore reverzne transkriptaze dugo vremena rijetko se razvijao AD.20 Stoga spekulišemo da 3TC, kao inhibitor reverzne transkriptaze, može biti potencijalni lijek za liječenje kognitivnih oštećenja i neurodegenerativnih bolesti uzrokovanih starenjem. Pokazalo se da miševi sklone starenju 8 (SAMP8), kao model za proučavanje starenja ljudi i bolesti povezanih sa starenjem, pokazuju mnoge karakteristike za koje se zna da se javljaju u ranim fazama neurodegenerativnih bolesti, kao što su povećani oksidativni stres, neuroinflamacija i kognitivni pad.21 Stoga su u ovoj studiji SAMP8 miševi odabrani kao idealan životinjski model za neurodegenerativne bolesti uzrokovane starenjem. Fokusirali smo se na kognitivne efekte 3TC na prerano starenje miševa i molekularne puteve povezane sa starenjem, pružajući dokaze o ulozi inhibitora reverzne transkriptaze u liječenju neurodegenerativnih bolesti uzrokovanih starenjem. Dalje smo primijenili metod mrežne farmakologije da predvidimo ciljeve 3TC, konstruiramo mreže i analiziramo biološke funkcije i puteve povezane s 3TC.

2|EKSPERIMENTALNI DEO 2.1 |

Životinje 44-sedmično stari mužjaci SAMP8 i srodni miševi sa normalnim ubrzanim starenjem R1 (SAMR1) koje je obezbijedio Univerzitet tradicionalne kineske medicine Tianjin korišteni su nakon 1-sedmičnog perioda aklimatizacije. Eksperimentalni protokol na životinjama odobrio je Komitet za etiku životinja pokrajinske bolnice Shandong i izveden je na osnovu Vodiča za brigu i upotrebu laboratorijskih životinja Nacionalnog instituta za zdravlje (NIH). Miševi su držani u autoklaviranim kavezima i davani su sterilnom hranom i vodom. Telesna težina miševa je beležena svaki dan. Dijagram toka eksperimenata sprovedenih u ovoj studiji dat je na slici 1A. Po završetku eksperimenata, miševi su eutanazirani inhalacijom dietil etera.

2.2|Priprema i tretman 3TC

Lijekovi su svježe pripremljeni na dan svakog eksperimenta. 3TC kupljen od MCE (Šangaj, Kina) je otopljen u DMSO do konačne koncentracije od 2 mmol/L. Osnovni rastvor je zatim razrijeđen do radne koncentracije koristeći vodu za piće sa konačnom koncentracijom DMSO manjom od 0.1 posto. Formirane su tri grupe miševa: kontrolna grupa tretirana rastvorom vehikuluma (voda za piće), test grupa tretirana sa 3TC i grupa SAMR1 koja je primila vehikulum koji se koristi kao druga kontrolna grupa za starenje. Test grupa je oralno primala 3TC u dozi od 100 mg/kg dnevno. Svi miševi su hranjeni intragastričnom primjenom tokom 4 sedmice (Slika 1B).

SLIKA 1 Dizajn eksperimenta i efekti 3TC na poboljšanje relativnog gubitka težine zbog ocjenjivanja starenja i starenja. (A) Dijagram toka farmakoloških eksperimenata za proučavanje efekta 3TC na kognitivne sposobnosti SAMP8 miševa. (B) Šematski prikaz rasporeda eksperimenata na životinjama. (C) Konceptualni radni tok za predviđanje interakcija lijek-cilja pomoću Pharmmappera koji prikazuje, s lijeva na desno, molekularnu strukturu 3TC, 3D strukturni dijagram 3TC i farmakoforski model predviđen sa 3TC vezanjem za estrogenski receptor s najvišom normalizacijom fit scores. (D) Obrazac rasta tjelesne težine u svakoj grupi miševa. (E) Promjene u ocjenama prije i poslije tretmana 3TC. SAMR1 plus vozilo: 44-sedmično stari SAMR1 miševi tretirani vozilom 4 sedmice. SAMP8 plus vozilo: 44-sedmično stari SAMP8 miševi tretirani vozilom 4 sedmice. SAMP8 plus 3TC: 44-nedjeljni SAMP8 miševi tretirani 3TC 4 sedmice. Studentov t-test: *p < 0.05, **p < 0.01 i ***p < 0.001. ns: nema statističke značajnosti. Crne zvjezdice predstavljaju poređenje sa SAMR1 plus grupom vozila. Crvene zvjezdice predstavljaju poređenje sa grupom vozila SAMP8 plus. Plava linija označava SAMP8 plus 3TC grupu u dobi od 44 i 48 sedmica.

2.3|Sistem bodovanja

Stepen starenja kod miševa je procijenjen korištenjem prethodno opisanog sistema ocjenjivanja.22 Svaka kategorija rezultata sadrži pet nivoa, u rasponu od 0 do 4 s najvišim rezultatom ocjene koji ukazuje na najviši stepen starenja životinje . Bodovi za svaku kategoriju su odvojeno procijenjeni od strane četiri iskusna eksperimentatora koji su bili zaslijepljeni za uslove liječenja (Dopunska tabela S1).

.2.4|Morrisov test vodenog lavirinta

Studije Morrisovog vodenog lavirinta izvedene su prema Morrisovom protokolu, uključujući eksperiment orijentacijske navigacije i ispitivanje sonde.23 Vodeni labirint je bio kružni bazen (120 cm u prečniku opremljen platformom od 10 cm u prečniku) i ispunjen vodom na 25 ± 1 stepen. Miševi su obučeni da pronađu platformu ispod površine vode u roku od jedne minute. Ako miš nije pronašao platformu u roku od 60 s, vođen je do platforme i ostavljen je tamo 20 s. Svaki od miševa je treniran pet puta dnevno sa svakim odvojenim jedan od drugog za 15 minuta. U svakom ogledu, početna pozicija je bila drugačija, pseudoslučajnim redosledom. Šestog dana testiranja platforma je uklonjena i životinja je ušla u vodeni labirint iz tačke suprotne od kvadranta lavirinta gdje se platforma nalazila tokom treninga i dozvoljeno joj je da labirint istražuje 60 s. Put plivanja i vrijeme koje su miševi proveli u potrazi za lavirintom snimljeni su video kamerom i analizirani pomoću EthoVision XT (Noldus softver). Svaka grupa se sastojala od najmanje osam životinja.

2.5|Ekstrakcija RNK i kvantitativni PCR

Ukupna RNK je ekstrahirana iz hipokampalnog i kortikalnog tkiva miševa nakon tretmana TRIzol reagensom (Invitrogen) prema protokolu proizvođača. Svaki uzorak RNK (1 ug) je reverzno transkribovan da se generiše cDNK korišćenjem kompleta za reverznu transkripciju cDNA (Takara), a zatim PCR-amplifikovan korišćenjem TaKaRa Taq kompleta (Takara). Setovi prajmera opisani su u Dodatnoj tabeli S2.

2.6|Priprema tkiva

Životinje su anestezirane dietil eterom, a njihovi mozgovi su sakupljeni nakon transkardijalne perfuzije sa fosfatnim puferom (PBS) i 4-postotnom otopinom paraformaldehida. Moždano tkivo je uklonjeno i fiksirano u paraformaldehidu više od 2 dana. Fiksni mozgovi su ugrađeni u parafin sa tkivom hipokampusa isečenim na debljini od 5 μm.

2.7|Bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E).

Morfologija mozga je analizirana metodama bojenja hematoksilinom i eozinom (H&E). Parafinski dijelovi tkiva hipokampusa su devoskani i dehidrirani gradijentom alkohola niza koncentracija. HE bojenje je izvedeno korištenjem H&E kompleta za bojenje (Solarbio) prema uputama proizvođača. Nakon potapanja u etanol i ksilen, sekcije su montirane smolom i posmatrane pod svjetlosnim mikroskopom (Olympus).

2.8|Nissl bojenje

Metoda Nissl bojenja (Biyuntian) korištena je za otkrivanje neuronske ozljede na dijelovima tkiva hipokampusa. Sekcije su inkubirane sa Nissl bojom 30 minuta i isprane sa 95% etanolom. Obojene ćelije su izbrojane i fotografisane pod svetlosnim mikroskopom (Olympus). Ćelije su brojane na tri nasumično odabrana polja koja se ne preklapaju u svakom stakalcu hipokampalnog tkiva sa indeksom preživljavanja definisanim kao broj preživjelih neurona/ukupan broj neurona.

2.9|TUNEL bojenje

Sekcije hipokampalnog tkiva su inkubirane sa rastvorom proteinaze K tokom 15 minuta, nakon čega je usledila inkubacija sa TUNEL reakcionom smešom (Beyotime). Nakon tri puta ispiranja sa PBS-om, sekcije su montirane otopinom za montažu koja sadrži nuklearnu boju DAPI i promatrane pomoću konvencionalnog fluorescentnog mikroskopa ili konfokalnog laserskog fluorescentnog mikroskopa.

2.10|Izgradnja ciljne baze podataka 3TC

Ciljna baza podataka 3TC-a je konstruisana na osnovu dvije baze podataka. Prvo, potencijalne mete 3TC su identificirane korištenjem reverzne farmakodinamičke genske mape zasnovane na Pharmmapper bazi podataka (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/results/20081 6062539.html). Sve hemijske komponente su konvertovane u format '.mol2' od strane Chembiodraw-a i učitane u Pharmmapper bazu podataka (Slika 1C). Molekuli sa ocjenom normaliziranog uklapanja većim od 4.0 identificirani su kao potencijalni ciljevi 3TC. Drugo, ChEMBL baza podataka (https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_re port_card/CHEMBL141/) korištena je za ispitivanje bioloških aktivnosti meta ili jedinjenja. Proteini za koje je potvrđeno da potiču od Homo sapiensa identificirani su kao potencijalne mete 3TC.

2.11|Analiza interakcije ciljnog proteina i izgradnja mreže

The target proteins screened were integrated for the protein-protein interaction (PPI) analysis using String 9.1 (http://string-db.org/) with the protein network interaction diagrams generated. Protein interactions with a confidence score >0.4 su odabrani u dizajniranoj postavci nakon eliminacije duplikata.

Da bi se sveobuhvatno istražili molekularni mehanizmi 3TC-a, PPI mreže su konstruirane korištenjem softvera Cytoscape verzije 3.6.0.(http://www.cytoscape.org/). Analiza stepena čvorova je izvršena sa Centiscape 2.2 (http:// apps.cytoscape.org/apps/centiscape) da bi se skrinirali geni čvorišta u mrežama sa vrijednošću centralnosti bliskosti, vrijednosti centralnosti između i vrijednosti centralnosti stepena postavljene na {{6 }}.2, 450 i 50, respektivno.

2.12|Obogaćivanje i skrining signalnih puteva za 3TC

Analiza obogaćivanja genske ontologije (GO) sa biološkim procesima, ćelijskim komponentama i molekularnim funkcijama potencijalnih ciljeva je sprovedena za označavanje bioloških funkcija na osnovu DAVID baze podataka o bioinformatici (https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp). Metabolički putevi KEGG-a su označeni na osnovu Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) baza podataka koristeći internetski KEGG Automatic Annotation Server (http://www.genome.jp/kegg/)

2.13|Vezivanje 3TC za predviđene ciljeve

Datoteke SDF strukture spoja 3TC dobijene su od strane Pubchem web stranice (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). SDF fajl je transformisan u PDB fajl pomoću softvera OpenBabel2.3.2, a receptorski proteini ADRB2 (PDBID:3KJ6), AKT1 (PDBID:4EKL) i EGFR (PDBID:6S9C) su dobijeni iz baze podataka Protein Data Bank (www.wwpdb). .org). Softver PYMOL2.3.4 je korišten za uklanjanje vode i liganada iz receptorskih proteina. Studija spajanja obavljena je korištenjem AutoDock Vina (1.1.2), koji je open-source softver za molekularno spajanje koji je razvio Scripps. Softver alata je korišten za modifikaciju četiri receptorska proteina, a naredba Grid Box pod Grid programom je korištena za otvaranje alata Grid Option za analizu svakog proteina receptora. Rešetkasti razmak je postavljen na 1, a središte džepa je postavljeno kao središte mjesta vezivanja.

2.14|Ćelijska kultura i tretman

Neuronske ćelijske linije hipokampusa miša HT22 kupljene su od Shanghai Cell Biotechnology Company. HT22 ćelije su uzgajane u DMEM sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS). Ćelije su posađene u 6-ploče sa bunarima 1 dan prije eksperimentalnog tretmana. Starenje ćelija indukovano je formaldehidom (FA), kupljenim od Sigma-Aldrich, kao što je prethodno opisano.24 HT22 ćelije su podeljene u tri grupe, uključujući FA grupu tretiranu sa 30 µmol/L FA tokom 24 h, FA/3TC grupa tretirana sa 30 µmol/L FA i 50 µmol/L 3TC, a kontrolna grupa uzgajana bez FA ili 3TC.

2.15|Imunofluorescencija i mikroskopija

Medijum je uklonjen, a ćelije su fiksirane korišćenjem 2-postotnog rastvora paraformaldehida 1 h na sobnoj temperaturi. Eksperiment imunofluorescencije je izveden kao što je prethodno opisano.25 Antitijela korištena u ovoj studiji uključivala su anti LINE-1 ORF1p antitijelo (1:1000; Sigma-Aldrich) sa Alexa Fluor 594 sekundarnim antitijelom (1:1000; Invitrogen) . Ćelije su inkubirane sa DAPI (1:500 razrjeđenje; Thermo Fisher Scientific) 1 min da bi se označila jezgra. Nakon dodavanja sredstva za montažu protiv fluorescencije, ćelije su posmatrane konfokalnim mikroskopom (Nikon). 2.16|Western blot analiza

Ekspresije EGFR, p-AKT1 (aktivan Akt1: fosforiliran na S473) i ADRB2 mjerene su Western blot analizom. Ukupni proteini su prikupljeni iz ćelija nakon različitih tretmana. Western blot je izveden kao što je prethodno opisano.26 Antitela korišćena u ovoj studiji uključivala su anti-EGFR antitelo (1:500; Sigma-Aldrich), anti-pAKT1 antitelo (1:1000; Sigma-Aldrich) i anti-ADRB2 antitelo (1:200; Sigma-Aldrich) sa sekundarnim antitelom protiv zeca (1:1,000; Invitrogen). Nakon pranja, mrlje su razvijene pomoću ECL Western blot sistema za detekciju (Amersham, Aylesbury, UK).

2.17|Analiza podataka i statistika

Svaki eksperiment je ponovljen najmanje tri puta i smatran je validnim, a ispitivanja su pokazala slične rezultate. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Značajna razlika je određena bilo Studentovim t-testom sa p < 0.05.

Pitajte za više:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950