Laccase-medijatorski sistem koji koristi prirodni posrednik kao sredstvo za izbjeljivanje za dekolorizaciju melanina, dio 1

sažetak: U ovoj studiji razvijen je sistem lakaza-medijator (LMS) koji koristi prirodni medijator kao sredstvo za izbjeljivanje za dekolorizaciju melanina. Korišteno je sedam prirodnih medijatora za zamjenu sintetičkih medijatora i uspješno prevladavanje niskog redoks potencijala lakaze i ograničenog pristupa melanina aktivnom mjestu lakaze. Aktivnost dekolorizacije melanina lakaza iz Trametes versicolor (lacT) i Myceliophthora thermophila (lacM) značajno je poboljšana upotrebom prirodnih medijatora uključujući acetosiringon, siringaldehid i acetovanilon, koji su pokazali nisku citotoksičnost. Metoksi i ketonske grupe prirodnih medijatora igraju važnu ulogu u dekolorizaciji melanina. Konstante specifičnosti lacT i lacM za dekolorizaciju melanina povećane su za 247 i 334, respektivno, kada je acetosiringon korišten kao medijator. LMS pomoću čipke i acetosiringona također može obezbojiti melanin prisutan u celuloznom hidrogel filmu, koji oponaša stanje kože. Nadalje, LMS može obezbojiti ne samo sintetičke analoge eumelanina pripremljene oksidacijom tirozina, već i prirodni melanin koji proizvode stanice melanoma.

Prema relevantnim studijama,cistancheje uobičajena biljka koja je poznata kao "čudotvorna biljka koja produžava život". Njegova glavna komponenta jecistanozid, koji ima različite efekte kao nprantioksidans, protuupalno, iunapređenje imunološke funkcije. Mehanizam između cistanche iizbjeljivanje koželeži u antioksidativnom dejstvu cistancheaglikozidi. Melaninu ljudskoj koži nastaje oksidacijom tirozina koju kataliziratirozinaza, a reakcija oksidacije zahtijeva učešće kisika, pa radikali bez kisika u tijelu postaju važan faktor koji utiče na proizvodnju melanina. Cistanche sadržicistanozid, koji je antioksidans i može smanjiti stvaranje slobodnih radikala u tijeluinhibiranje proizvodnje melanina.

Kliknite na Rou Cong Rong prednosti za izbjeljivanje

Za više informacija:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Uvod

Lakaze (EC 1.10.3.2, benzendiol: oksidoreduktaze dioksigena) su proteini sa više bakra koji kataliziraju oksidaciju različitih fenolnih i nefenolnih spojeva putem radikalno kataliziranog mehanizma reakcije redukcijom molekularnog kisika [1,2]. Lakaze su korištene kao biokatalizatori za procese biorazgradnje, kao što su bioremedijacija boja [3,4], farmaceutski proizvodi [5,6], herbicidi [7] i delignifikacija [8–10]. Lakaze su također korištene za katalizaciju polimerizacije prekursora boja i organskih spojeva [11]. Konkretno, njihova atraktivna svojstva, kao što su niska specifičnost supstrata, korištenje kisika kao konačnog akceptora elektrona, stvaranje vode kao nusproizvoda i nepotreba (ili ne proizvodnja) peroksida, čine ih zanimljivima u biotehnološkim i polja životne sredine [1,11,12].

Četiri jona bakra na aktivnom mestu uključena su u katalitičku aktivnost lakaze. "Plavi" bakar (T1 mjesto) oksidira supstrat, a trinuklearni klaster bakra (T2/T3) prima elektrone sa T1 mjesta kako bi smanjio molekularni kisik [1,12,13]. Konkretno, redoks potencijal T1 mjesta Cu se smatra glavnim faktorom u određivanju katalitičke sposobnosti lakaza [14]. Lakaze posjeduju relativno nizak redoks potencijal (0.4–0.8 V) u poređenju sa ligninolitičkim peroksidazama (preko 1 V) kao što su mangan peroksidaza i lignin peroksidaza. Lakaze ne mogu direktno oksidirati nefenolne supstrate sa redoks potencijalom iznad 1,3 V [13,14]. Stoga, da bi se prevazišla ograničenja lakaze, lakaza-medijatorski sistemi (LMS) koji koriste mala molekularna jedinjenja, kao što je 2,20 -azinobis(3- etilbenztiazolin-6-sulfonat) (ABTS), { {24}}Predloženi su hidroksi benzotriazol (HOBt), violurska kiselina (VLA), N-hidroksi ftalimid (HPI), N-hidroksi acetanilid (NHA) i TEMPO, koji djeluju kao redoks medijatori [15–17].

Ovi posrednici dopuštaju oksidaciju glomaznih spojeva različitim putevima oksidacije. Lakaza-ABTS sistem oksidira supstrate stvaranjem katjonskog ABTS radikala putem mehanizma prijenosa elektrona (ET). LMS s HOBt, VLA, HPI ili NHA proizvode nitroksilne radikale putem mehanizma prijenosa atoma vodika (HAT) [1,12,17]. Nadalje, medijatori kao što je TEMPO i njegovi analozi reaguju putem jonskih puteva stvarajući oksoamonijum ione [1,12,18]. Upotreba ovih medijatora može oksidirati širok spektar spojeva u različitim primjenama, kao što su razgradnja boja [3,4], razgradnja lijeka [5,6] i degradacija lignina [8–10]. Ipak, primjena sintetičkih medijatora u industrijskim poljima je ograničena zbog njihove potencijalne toksičnosti, visoke cijene i efekta inaktivacije enzima. Nedavno su proučavane fenolne molekule izvedene iz lignina kao prirodni posrednici (npr. siringaldehid, acetosiringon, vanilin, acetovanilon, metil vanilat, ferulična kiselina, sinapinska kiselina, p-kumarinska kiselina, itd.) kako bi zamijenili sintetičke medijatore [1,12] . Prednosti prirodnih medijatora su niska cijena i niska toksičnost jer se dobivaju iz prirodnih i obnovljivih izvora [19].

Melanin je grupa prirodnih pigmenata proizvedenih melanogenezom oksidativnom polimerizacijom tirozina od strane melanocita. Prirodni melanin se može klasificirati u pet kategorija: eumelanin, feomelanin, sav melanin, feomelanin i neuromelanin [20]. Nedavno su proučavane različite medicinske i elektrohemijske primjene koje koriste melanin ili prekursore melanina [20,21]. Boja ljudske kože je uglavnom određena prisustvom melanina. U kozmetičkoj industriji, direktna depigmentacija melanina pomoću enzima je predložena za razvoj sredstava za izbjeljivanje kože. Nekoliko peroksidaza je proučavano da obezboje melanin. Woo et al. pokazala je da se sintetički melanin može direktno obezbojiti lignin peroksidazom iz P. chrysosporium [22]. Grupe Keneko i Mohorciˇc su također prijavile enzimsku dekolorizaciju melanina pomoću mangan peroksidaze izolirane iz gljivica (Sporotrichum pruinose i Phlebia radiata) [23,24]. Kim et al. objavili su da sirove mješavine enzima koje sadrže mangan peroksidazu, lignin peroksidazu i lakazu pokazuju aktivnost depigmentacije melanina [25]. Kada peroksidaze obezboje melanin, potreban im je vodikov peroksid (H2O2) kao kofaktor koji može iritirati kožu. Dakle, da bi se smanjila upotreba H2O2, glukoza oksidaza ili lakaza je uvedena u sistem kombinacije enzima [26,27]. Lakaze mogu obezbojiti melanin bez upotrebe vodikovog peroksida. Khammuang i Sarnthima su izvijestili da je lakaza iz Lentinus polycarpous Lév pokazala aktivnost dekolorizacije melanina koristeći ABTS, vanilin i vanilinsku kiselinu kao medijatore [28].

2. Materijali i metode

2.1. Materijali

2.2. Dekolorizacija melanina pomoću LMS-a

Zasićeni rastvor melanina (1,4 mg/mL) pripremljen je otapanjem 3 mg sintetičkog melanina u 1,3 mL 10 mM NaOH. Otopina je centrifugirana na 8500 rpm 5 minuta da se ukloni neotopljeni melanin, a supernatant je razrijeđen sa 0.1 M fosfatnim puferom limunske kiseline (pH 3, 4, 5, 5.5, 6 ili 7) i koristi se kao rješenje supstrata za LMS. Koncentracija melanina u rastvoru supstrata bila je 63 µg/mL i spektrofotometrijski je potvrđena na 475 nm. 0.8 mL rastvora supstrata melanina je pomešano sa 0.1 mL rastvora medijatora (0-1 mM) u Eppendorf epruveti od 1.5 mL. Reakcija dekolorizacije melanina je pokrenuta dodavanjem 0,1 mL rastvora lakaze (15,8 µg (0,6 U) lacT ili 19,2 µg (1,8 U) lacM u mešavinu melanina i medijatora na 25 ◦C u vodenoj kupelji koja se trese na 120 rpm. . Nakon reakcije, reakciona smjesa je centrifugirana, a apsorbancija supernatanta je mjerena na 475 nm. Prinos dekolorizacije ( posto ) izračunat je korištenjem sljedeće jednadžbe:

Dekolorizacija ( procenat ) {{0}} (A0 − At)/A0 × 100, (1)

2.3. Kinetička studija dekolorizacije melanina od strane LMS-a

2.4. Citotoksičnost prirodnih medijatora

Ćelijska linija melanoma B16F10 (Korea Cell Line Bank, Seul, Koreja) korištena je za određivanje citotoksičnosti prirodnih medijatora za LMS. Za mjerenje citotoksičnosti medijatora izveden je neutralni crveni (NR) test [29]. NR mjeri održivost lizosoma živih ćelija. Ćelije melanoma sa koncentracijom od 3 × 104 ćelije su raspoređene u svaku jažicu ploče 96-. Nakon 24 h kultivacije, ćelije su tretirane prirodnim medijatorima (1, 2, 5, 10, 22 i 46 mM). Nakon dodatne kultivacije tokom 2 dana, ćelije su tretirane sa 50 µg/mL rastvora NR rastvorenog u DMEM i inkubirane 3 h. Nakon uklanjanja supernatanta usisavanjem, za ekstrakciju boje korištena je otopina NR desorb (1 posto glacijalne octene kiseline, 49 posto etanola i 50 posto destilovane vode). Nakon procesa ekstrakcije, promjena apsorpcije je mjerena na 540 nm.

2.5. Priprema i dekolorizacija melanin/celuloznog hidrogel filma

Da bi se izmjerila aktivnost dekolorizacije LMS-a za melanin/celulozni film, pripremljeni hidrogel film je izrezan u lim veličine 1 × 2 cm. Hidrogel film je uronjen u 4 mL 0.1 M fosfatnog pufera limunske kiseline (pH 5,5); zatim je puferu dodato 0.5 mL 1 mM acetosiringona i 0.5 mL rastvora čipke (2.5 U). Reakcija dekolorizacije je izvedena u vodenom kupatilu uz mućkanje na 120 pm i 25 ◦C tokom 3 h. Nakon reakcije, film je ispran destilovanom vodom i pričvršćen na unutrašnju stranu kivete kako bi se izmjerila promjena spektra u rasponu od 400-800 nm pomoću UV/Vis spektrofotometra. Kontrolne reakcije bez lacM-a ili medijatora također su provedene pod istim uvjetima. Oslobađanje melanina iz filma ili promjena boje melanin/celuloznog filma nije otkriveno u uvjetima reakcije. Nadalje, kolorimetrom (KONICA MI NOLTA, Tokio, Japan) zabilježena je i promjena parametara boje (vrijednosti L*, a* i b*) melanin/celuloznog filma nakon reakcije dekolorizacije pomoću LMS. Vrijednosti ∆L (metrička razlika u svjetlini), ∆E (ukupna razlika u boji), YI (indeks žutilosti) i WI (indeks bjeline) dobivene su korištenjem sljedećih jednadžbi [30–32]:

2.6. Priprema prirodnog melanina

Prirodni melanin je dobijen iz ćelija melanoma B16F10. Ćelije su tretirane hormonom koji stimuliše alfa-melanocite da bi proizveo melanin. Nakon 4 dana inkubacije, ćelije su uhvaćene upotrebom tripsina-EDTA i obrađene sonikacijom 10 minuta. Supernatant je dobijen centrifugiranjem na 8000 rpm tokom 10 minuta, a zatim je podešen na pH 1,5 upotrebom 6 M HCl. Rastvor je kuvan na 100 ◦C tokom 4 h da bi se hidrolizovale zaostale proteinske frakcije. Rastvor koji sadrži prirodni melanin je ispran acetonom, zatim hloroformom i etanolom, a zatim ispran dejonizovanom vodom da bi se eliminisali ostaci, kao što su ćelije, komponente medija i proteinske frakcije [33,34]. Svi procesi pranja izvedeni su više od dva puta. Konačno, prirodni melanin je dobiven sušenjem zamrzavanjem i korišten kao supstrat za LMS.

3. Rezultati i diskusija

3.1. Efekat medijatora na dekolorizaciju melanina pomoću LMS-a

Učinak različitih medijatora na reakciju dekolorizacije melanina pomoću LMS-a istražen je korištenjem dvije lakaze iz T. versicolor (lacT) i M. thermophila (lacM) (slika 1).Kada je lacT korišten bez posrednika za dekolorizaciju melanina, prinos dekolorizacije je bio samo 1 posto nakon 5 h reakcije. Kada je HOBt korišten kao medijator za lacT, prinos dekolorizacije je neznatno povećan na 2 posto nakon 5 h reakcije. Upotreba različitih sintetičkih medijatora, kao što su HOBt, ABTS, VLA i TEMPO, u oksidaciji fenolnih ili nefenolnih spojeva kataliziranoj lakazom značajno je povećala brzinu reakcije [10,15]. Kada je pristup ciljnih jedinjenja aktivnom mestu lakaze ograničen njihovom steričkom smetnjom, posrednički radikali formirani lakazom mogu efikasno oksidirati ciljna jedinjenja putem elektrona ili mehanizma prenosa atoma vodonika [12]. HOBt je jedan od najčešće korištenih sintetičkih medijatora u LMS-u zbog svog visokog redoks potencijala (1,1 V) [6]. Međutim, HOBt nije dobar kozmetički sastojak zbog svoje potencijalne toksičnosti za ćelije i sposobnosti da inaktivira lakazu. Stoga smo odabrali sedam prirodnih medijatora, acetosiringon, siringaldehid, p-kumarinsku kiselinu, vanilin, vanilinsku kiselinu, vanilil alkohol i acetovanilon, za reakciju dekolorizacije melanina pomoću LMS-a. Zanimljivo je da svi prirodni posrednici deluju kao efikasniji posrednici od HOBt za dekolorizaciju melanina zbog nedostatka. Kada su korišteni acetosiringon, siringaldehid i p-kumarinska kiselina, prinosi dekolorizacije su bili 28 posto, 22 posto, odnosno 18 posto, nakon 5 sati reakcije. Ovi rezultati pokazuju korisnost prirodnih medijatora za reakciju dekolorizacije melanina pomoću LMS-a. Medijatori u LMS-u se oksidiraju u posredničke radikale pomoću lakaze, a posrednički radikali induciraju oksidaciju i dekolorizaciju melanina. Kada je nedostatak korišten bez posrednika za dekolorizaciju melanina tokom dovoljnog vremena reakcije, koje je moglo doći do ravnotežnog stanja, prinos dekolorizacije je bio 7 posto nakon 24 h reakcije. Prirodni posrednici, osim vanilinske kiseline, djeluju kao efikasniji medijatori od HOBt za dekolorizaciju melanina lakT-om nakon 24 h reakcije. Prinos dekolorizacije nakon 24 h reakcije uz upotrebu vanilinske kiseline kao medijatora bio je niži od prinosa nakon 5 h reakcije. Ovo može biti uzrokovano niskom stabilnošću oksidiranog radikalnog oblika vanilinske kiseline. Kada su korišteni acetosiringon, siringaldehid i acetovanilon, prinosi dekolorizacije su bili 34 posto, 30 posto, odnosno 31 posto, nakon reakcije od 24 sata. p-kumarinska kiselina je bila efikasnija u povećanju početne brzine reakcije od acetovanilona, ​​dok je acetovanilon inducirao veći prinos obezbojavanja u ravnotežnom stanju od p-kumarinske kiseline.

Učinak medijatora na reakciju dekolorizacije pomoću LMS-a korištenjem lacM-a također je bio vrlo sličan onom dobivenom LMS-om korištenjem lacT-a. Kada se čipka koristila bez posrednika za dekolorizaciju melanina, prinos dekolorizacije je bio samo 2 posto nakon 5 h reakcije. HOBt kao medijator za lacM nije povećao prinos dekolorizacije tokom 5 h reakcije. Svi prirodni posrednici, osim p-kumarinske kiseline i vanilina, djelovali su kao efikasni posrednici dekolorizacije melanina lakM-om. Kada su korišteni acetosiringon i siringaldehid, prinosi dekolorizacije su bili 25 posto, odnosno 22 posto, nakon 5 h reakcije. p-kumarinska kiselina i vanilin su korišteni kao efikasni posrednici za svaki, ali nisu mogli efikasno povećati stopu dekolorizacije u LMS-u koristeći čipku. Ovo može biti uzrokovano nižom specifičnošću supstrata lacM-a za p-kumarinsku kiselinu i vanilin. Prinosi dekolorizacije nakon 24 h reakcije lakM sa p-kumarinskom kiselinom i vanilinom bili su slični onima dobijenim lakTom. Ovo ukazuje na to da oksidirani oblici p-kumarinske kiseline i vanilina mogu efikasno obezbojiti melanin, iako je njihova stopa oksidacije pomoću lacM-a bila mnogo niža od one pomoću lakT-a. Kada se lacM bez medijatora koristi za dekolorizaciju melanina tokom dovoljnog vremena reakcije, prinos dekolorizacije je bio 5 posto nakon 24 h reakcije. Prirodni posrednici, osim vanilinske kiseline, također djeluju kao efikasniji medijatori od HOBt-a za dekolorizaciju melanina lakM-om nakon 24 h reakcije. Kada su acetosiringon, siringaldehid i acetovanilon korišteni kao posrednici za lakM, prinosi dekolorizacije su bili 34 posto, 28 posto, odnosno 31 posto, nakon 24 sata reakcije. Kada je vanilna kiselina korištena kao posrednik i za lakT i za lakM, pokazala je najniži prinos obezbojavanja. Ovo može biti uzrokovano niskom stabilnošću oksidiranog radikalnog oblika vanilinske kiseline. Khammuang i Sarnthima su izvijestili da se vanilin i vanilinska kiselina mogu koristiti kao posrednici za dekolorizaciju melanina korištenjem lakaze iz Lentinus polycarpous [28]. Međutim, pokazali su mnogo nižu aktivnost dekolorizacije melanina od acetosiringona kada su korišteni kao posrednici za lakT i čipku.

Ovi rezultati pokazuju da su prirodni medijatori efikasniji za dekolorizaciju melanina pomoću LMS-a nego HOBt. HOBt se smatra efikasnim sintetičkim medijatorom za lakazu zbog njegovog visokog redoks potencijala i katalitičke uloge N OH grupe HOBt [5]. Efikasnost medijatora za oksidaciju ciljnih supstrata u velikoj meri zavisi od sposobnosti formiranja stabilnih radikala, kao i od sterične smetnje uzrokovane glomaznim alkil supstituentima, a ne o redoks potencijalu medijatora [19,35]. Niska stabilnost oksidiranog intermedijera HOBt utvrđena je cikličkom voltametrijom [6]. Stoga, nizak prinos dekolorizacije pomoću LMS-a koji koristi HOBt može biti uzrokovan niskom stabilnošću HOBt-a u reakcionim uslovima lakaze. Iako je redoks potencijal siringaldehida bio niži od HOBt-a, siringaldehid je pokazao relativno veću stabilnost od HOBt-a [6].

Kao što je prikazano na slici 2, prirodni medijatori korišteni u ovom radu imaju različite supstituente (npr. hidroksil, metoksi, karboksil, keton ili aldehid) na različitim pozicijama na benzenskom prstenu [12,19]. Medijatori s dvije metoksi grupe (acetosiringon i siringaldehid) pokazali su veće stope dekolorizacije od onih s jednom metoksi grupom. Brzina dekolorizacije dobivena p-kumarnom kiselinom bez metoksi grupe ovisila je o vrsti lakaze. P-kumarinska kiselina sa lacT pokazala je veću stopu obezbojenja od onih sa jednom metoksi grupom, dok je p-kumarinska kiselina sa lacM pokazala najnižu stopu obezbojenja u reakciji od 5 sati. Fillat et al. također su pokazali slične rezultate za dekolorizaciju fleksografskih boja gljivičnim lakazama s prirodnim medijatorima [36]. Fenolni prirodni medijatori (acetosiringon, metil šprica i siringaldehid) sa dva metoksi supstituenta u prstenu su oksidirani lakazom brže od p-kumarinske kiseline bez metoksi grupe. Ovo ukazuje da metoksi grupe igraju važniju ulogu kao donori elektrona od dvostruke veze bočnog lanca p-kumarinske kiseline. Kada su upoređivani medijatori s jednom metoksi grupom, prinos dekolorizacije se povećao sljedećim redoslijedom: acetovanilon > vanilin > vanilin alkohol > vanilna kiselina. Acetovanilon, koji ima ketonsku grupu, pokazao je veću stopu dekolorizacije i prinos od medijatora sa aldehidnim, hidroksilnim i karboksilnim grupama. Acetosiringon sa ketonskom grupom je takođe pokazao veću stopu dekolorizacije i prinos od siringaldehida sa aldehidnom grupom.

U narednim eksperimentima, acetosiringon, siringaldehid i acetovanilon, koji su pokazali visoku sposobnost dekolorizacije melanina, odabrani su kao posrednici za LMS za dekolorizaciju melanina. Utjecaj medijatora na reakciju dekolorizacije pomoću LMS-a je istražen tokom vremena (slika S1). Reakcija dekolorizacije upotrebom lakT-a sa acetosiringonom, siringaldehidom i acetovanilonom rezultirala je prinosom dekolorizacije od 21%, 18% i 1% nakon 1 h reakcije. Reakcija dekolorizacije upotrebom lacM-a sa acetosiringonom i siringaldehidom rezultirala je prinosom dekolorizacije od 19%, odnosno 18% nakon 1 h reakcije. Obje lakaze su pokazale slične profile reakcije kada je korišten isti medijator. Acetosiringon i siringaldehid značajno su pojačali stopu dekolorizacije tokom početne reakcije. Ovi rezultati pokazuju da su acetosiringon i siringaldehid koji sadrže dimetoksi grupe bili efikasniji u povećanju početne brzine dekolorizacije pomoću LMS-a nego acetovanilon koji sadrži jednu metoksi grupu. Fillat et al. također su objavili da metoksi grupe u prstenastim strukturama medijatora djeluju kao akceleratori za oksidaciju supstrata [36]. S druge strane, prinos dekolorizacije nakon 24 h reakcije acetovanilonom bio je sličan onome sa siringaldehidom, iako je acetovanilon umjereno povećao brzinu reakcije.

Za više informacija: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501