KLRG1 označava podgrupe CD4 T ćelija koje infiltriraju tumor povezane s progresijom tumora i odgovorom na imunoterapiju

Abstract

Trenutne metode za otkrivanje biomarkera i identifikaciju cilja u imunoonkologiji oslanjaju se na statične snimke tumorskog imuniteta. Za detaljnu karakterizaciju vremenske prirode antitumorskih imunoloških odgovora, razvili smo 34-parametarsku spektralnu protočnu citometrijsku citometriju i izvršili analize visoke propusnosti u kritičnim kontekstima.

Iskoristili smo dva različita pretklinička modela koji rekapituliraju imunouređivanje raka (NPKC1) i odgovor na blokadu imunološke kontrolne tačke (ICB) (MC38), respektivno, i profilirali više relevantnih tkiva na i oko ključnih tačaka infleksije imunološkog nadzora i bijega i/ili ICB odgovora.

Ciljevi se odnose na važne biomolekule u ćelijama, kao što su proteini, enzimi i receptori. Prepoznavanje cilja je korištenje kemijskih i bioloških metoda za identifikaciju specifičnih svojstava i funkcija ovih biomolekula za primjenu u liječenju bolesti i razvoju lijekova.

Imunitet se odnosi na sposobnost tijela da se odupre invaziji stranih patogena i rastu endogenih abnormalnih ćelija. Srž imunog sistema su imunološke ćelije i molekuli, koji imaju bliske veze i interakcije sa svojim metama.

U liječenju bolesti i razvoju lijekova, odnos između identifikacije cilja i imuniteta je vrlo važan. Na primjer, mehanizam djelovanja mnogih lijekova je kroz prepoznavanje cilja, ciljanje na specifične proteine, enzime, receptore i druge molekule, utječući na njihove funkcije i regulišući transdukciju signala, kako bi se postigli terapeutski efekti. Ćelije i molekuli u imunološkom sistemu također mogu biti mete lijekova. Na primjer, lijekovi protiv raka postižu terapeutske efekte utječući na imunološki odgovor ćelija raka i regulišući apoptozu i proliferaciju ćelija.

Stoga, u razvoju lijekova i kliničkom liječenju, sveobuhvatno razmatranje identifikacije cilja i faktora imuniteta može dovesti do efikasnijeg razvoja lijeka i poboljšanog terapijskog efekta. Sa ove tačke gledišta, moramo poboljšati imunitet. Cistanche može poboljšati imunitet. Cistanche je bogat raznim antioksidativnim supstancama, kao što su vitamin C, vitamin C, karotenoidi, itd. Ovi sastojci mogu ukloniti slobodne radikale, smanjiti oksidativni stres i poboljšati imunitet. otpor sistema.

Click cistanche tubulosa ekstrakt u prahu

Analiza podataka vođena mašinskim učenjem otkrila je obrazac ekspresije KLRG1 koji je jedinstveno identifikovao intratumorske efektorske CD4 T ćelije koje se konstitutivno povezuju sa opterećenjem tumora u tumorskim modelima, i koje se gube u tumorima koji prolaze kroz regresiju kao odgovor na ICB. Slično, Helios-KLRG1 plus podskup regulatornih T ćelija koje infiltriraju tumor (Tregs) bio je povezan s progresijom tumora od imunološke ravnoteže do bijega i također je izgubljen u tumorima koji reaguju na ICB.

Studije validacije potvrdile su potpise KLRG1 u CD4 T ćelijama koje infiltriraju tumor kod ljudi povezane s progresijom bolesti kod raka bubrega. Ovi nalazi nominiraju populacije KLRG1 plus CD4 T ćelija kao podgrupe za dalja istraživanja imuniteta na rak i demonstriraju korisnost longitudinalnog spektralnog profiliranja toka kao pokretača dinamičkog otkrivanja biomarkera i/ili cilja.

Uvod

Imunoterapija je sada stub liječenja raka. Međutim, odgovori na većinu imunoterapeutskih agenasa ostaju rijetki, ograničeni na ograničen broj tipova tumora i teško ih je predvidjeti(1). Poboljšanje stope odgovora i razvoj biomarkera koji predviđaju odgovor su centralni ciljevi polja tumorske imunologije, ali to ostaje izazov.

Mnoštvo složenih višećelijskih interakcija može upravljati ishodom antitumorskog imunološkog odgovora kod svakog pacijenta. Stoga je uobičajeno da pojedinačni biomarkeri – ili terapijska modulacija pojedinačnih puteva – imaju tendenciju da budu korisni kod nekih, ali ne i kod većine pacijenata oboljelih od raka.

Na primjer, postoje tri biomarkera vezana za imunološki sustav koji su trenutno u širokoj kliničkoj upotrebi; (i) mutacijsko opterećenje tumora (TMB), mjereno direktno ili zaključeno putem prisustva mutacija koje onemogućuju popravku DNK (2-4), (ii) ekspresija PD-L1 imunohistohemijom (IHC)(5) i (iii) postojeći imunitet mjeren prisustvom CD8 T ćelija unutar i okolnih tumora, nazvan Immunoscore(6).

Iako je svaki značajno povezan s odgovorom na imunoterapiju u određenim kontekstima, osjetljivost i specifičnost ovih prediktora ostaju suboptimalni (7). Ovi unimodalni pristupi vjerovatno ne uspijevaju u potpunosti obuhvatiti složene mehanizme koji su u osnovi antitumorskog imuniteta, uključujući dinamičku prirodu takvih odgovora koji se javljaju u tkivima i tokom vremena.

Kao takva, primjena visoko multipleksiranih pristupa imunog profiliranja jedne ćelije za otkrivanje biomarkera i otkrivanje cilja na međutkivni, longitudinalni način može pružiti nijansirane imunološke fenotipove s većom prediktivnom i translacijskom korisnošću.

U tu svrhu razvili smo 34-parametarsku spektralnu protočnu citometrijsku ploču i visokodimenzionalnu analizu podataka za ispitivanje imunoloških fenotipova na nivou proteina povezanih s različitim fazama ciklusa imunouređivanja raka, uključujući imunološki bijeg i izrastanje tumora, i imunološku kontrolnu tačku blokada (ICB) odgovor na pretkliničkim modelima.

Profilirali smo modele MC38 tretirane NPK-C1 i ICB, analizirajući više tkiva (tumor, limfni čvorovi koji se dreniraju nasuprot nedreniranim limfnim čvorovima i krv) preko i oko ključnih tačaka fleksije u progresiji tumora. Ovo je olakšalo duboku karakterizaciju dinamike koja leži u osnovi prirodne i ICB-indukovane regresije tumora, prelaska u imunološku ravnotežu i kasniju tranziciju iz ravnoteže u nekontrolisano bijeg tumora. Studije validacije u humanim jednoćelijskim skupovima podataka o karcinomu bubrega potvrdile su translacijsku relevantnost ovih nalaza.

Materijali i metode

Miševi. Mužjaci i ženke miša C57BL/6J (stari 5-6 sedmica) kupljeni su od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Miševi su bili stari 6-8 sedmica u vrijeme upotrebe. Sve životinje su smještene u strogom skladu s propisima NIH-a i Američkog udruženja za njegu laboratorijskih životinja. Sve eksperimente i procedure za ovu studiju odobrio je Odbor za institucionalnu negu i upotrebu životinja Medicinskog centra Kolumbija (IACUC).

Cell Lines. NPK-C1 ćelijsku liniju (originalno LM7304) obezbijedio je dr. Cory AbateShen sa Univerziteta Columbia. Za više detalja pogledajte prethodne reference (8,9). NPK-C1 ćelije su održavane u R10, koji se sastojao od RPMI medijuma (Corning; Corning, NY) sa dodatkom 10% FBS (HyClone; Logan, UT), 100 U/mL penicilina i 100 mg/mL streptomicina (Gibco; Gaithersburg, MD). MC38 ćelije karcinoma debelog crijeva kupljene su od Kerafasta i uzgajane u D10 koji se sastoji od DMEM (Corning; Corning, NY) sa dodatkom 10 posto FBS, 100 U/mL penicilina i 100 mg/mL streptomicina (Gibco; Gaithersburg, MD).

Izazov tumora i terapijske injekcije. NPK-C1 ćelije na 70-90 procentima ušća ili MC38 ćelije na 50-75 posto konfluencije su sakupljene sa 0.05 posto tripsina (Gibco, Gaithersburg, MD), isprano sa PBS, izbrojan i resuspendiran pri 10x106 ćelija/mL u ledeno hladnom PBS-u. Dana 0, miševima starim 6-8 sedmica implantirani su na desni bok sa 1x106 NPK-C1 ili MC38 ćelija. Mjerenja tumora su snimana u X, Y i Z dimenzijama (najveći prečnik, najmanji prečnik i najveća visina, respektivno) svakih 2-3 dana digitalnom kaliperom, a zapremina tumora je izračunata množenjem X*Y*Z. Anti-PD-1 (RMP1- 14 IgG2a,κ) ili pacovsko IgG2a izotip antitijela (Bio X Cell; Liban, NH) razrijeđeno je u sterilnom PBS-u i primijenjeno intraperitonealnom (IP) injekcijom pri 200 ug/ mL po mišu 3, 6, 9 i 12 dana nakon implantacije MC38.

Tissue Harvesting. Nakon eutanazije miša, ~200 ul krvi je izolovano putem srčane punkcije pomoću igle šprica obložene 0,2 posto heparina (StemCell Technologies; Vancouver, BC) i stavljeno na led u epruvete koje sadrže 10 ul 0,5M EDTA (Corning; Corning, NY). Preponski limfni čvorovi koji dreniraju tumor i ne dreniraju su secirani i stavljeni u 48-ploče sa bunarima koje sadrže 150 ul R10 medija na ledu.

Tumori su sakupljeni, masirani i do 50 mg tumora je isečen na kockice i stavljen u medijum X-Vivo 15 (Lonza; Bazel, Švajcarska) u epruvete od 5 mL Eppendorf na ledu. DNaza (40 ul rastvora 20 mg/mL; Roche; Basel, Švajcarska) i kolagenaza D (125 ul rastvora 40 mg/mL; Roche; Bazel, Švajcarska) dodane su uzorcima tumora pre inkubacije na šejkeru na 37o C za 30 minuta. Reakcije digestije su ugašene vorteksiranjem (30 sekundi) i dodavanjem 5 mL R10 medija. Digestije tumora su filtrirane kroz filtere od 70 μm (Miltenyi; Bergisch Gladbach, GE) i peletirane. Uzorci krvi su lizirani eritrocitom sa dvije uzastopne 2-minutne inkubacije u 2mL ACK pufera (Quality Biological; Gaithersburg, MD) i gašenjem u R10 prije peletiranja. Limfni čvorovi su fizički razdvojeni pomoću klipa šprica od 1 mL u 48-pločici sa jažicom, a zatim su suspenzije filtrirane kroz 40-um filtere. Svi uzorci su stavljeni u ploče sa U-dnom 96-bunarice za bojenje.

Protočna citometrija. Uzorci su isprani sa PBS. Mrtve ćelije su obojene resuspendiranjem u 100 ul PBS plus Live/Dead Fixable Blue boje (1:500; Invitrogen; Waltham, MA). Ovo i svi daljnji koraci bojenja ili fiksacije izvedeni su 30 minuta na sobnoj temperaturi na šejkeru za ploče, zaštićenom od svjetlosti. Uzorci su isprani 2x sa PBS, zatim su resuspendovani u FACS (PBS plus 3 procenta FBS plus 1mM EDTA plus 10mM HEPES) sa dodatkom TruStain FcX (1:50; BioLegend; San Diego, CA) i TruStain monocit blokatorom (1:20; BioLegend; San Diego, CA) i stavljen na led.

Površinska antitijela pripremljena su u optimalnim razrjeđenjima (vidi Dodatnu tabelu S1) u FACS-u dopunjenom Brilliant Stain Plus puferom (BD; Franklin Lakes, NJ), a zatim su dodana uzorcima u otopini za blokiranje. Nakon bojenja, uzorci su isprani 2x puferom FACS i fiksirani u 100 ul FoxP3 Fixation/Permeabilization Kit pufera (eBioscience; San Diego, CA). Uzorci su dva puta isprani sa 1X puferom za permeabilizaciju (1X PW), a zatim obojeni u 1X PW plus intracelularna antitela. Uzorci su zatim dva puta isprani u 1X PW, a zatim fiksirani u 100 ul FluoroFix pufera (BioLegend: San Diego, CA), isprani dvaput sa FACS, zatim resuspendirani u 200 ul FACS i zapečaćeni u ploče sa 96 jažica za prikupljanje sljedećeg dana na Cytek Aurora 5-laserski citometar.

Istovremeno obojeni uzorci splenocita korišteni su za kontrolu pojedinačnih mrlja. Analiza i statistika. Eksperimenti uzdužnog profiliranja provedeni su po jednom za modele MC38 i NPK-C1. Ukupno je procijenjeno n=10-25 miševa po vremenskoj tački. Podaci protočne citometrije analizirani su u FlowJo v10.8.1 (BD; Franklin Lakes, NJ), a algoritmi visokodimenzionalnih dodataka UMAP i FlowSOM preuzeti su sa FlowJo Exchange-a. Do 30.000 živih CD45 plus ćelija koje infiltriraju tumor i do 15.000 živih CD45 plus ćelija iz krvi ili LN izvedenih ćelija po uzorku su spojene za analizu visoke dimenzije.

Sva redukcija dimenzionalnosti i grupisanje izvedeni su u FlowJo. Statističke analize su obavljene u GraphPad Prism v9.3.1. Pirsonova korelacija je korištena za generiranje koeficijenata korelacije, a neparni Studentovi T-testovi sa Welchovom korekcijom korišteni su za poređenje frekvencija klastera između grupa. Analitičke metode jedne ćelije su prethodno opisane (10,11).

KLRG1 regulon je ekstrahovan iz konsenzus metaVIPER KLRG1 regulona od Obradovića, et al(11). Da bismo izračunali potpis regulona KLRG1, uklopili smo model slučajne regresije šume sa regulonskim genima kao karakteristikama i KLRG1 kao metom, a zatim smo izračunali Gini ocenu važnosti gena regulona kako bismo odredili njihov uticaj na ekspresiju KLRG1. KLRG1 regulonski rezultat svake ćelije dat je ponderisanim zbrojem ekspresijskih mjera svih regulonskih gena u ćeliji sa ocjenama važnosti kao težine.

For more information:1950477648nn@gmail.com