Policistična bolest bubrega

ali.ma@wecistanche.com

Dio Ⅱ: Organoidi bubrega nastali iz eritroidnih progenitorskih ćelija pacijenata sa autosomno dominantnom policističnom bolešću bubrega

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice i dr.

Pozadina:Bubregorganoidi su široko dobijeni iz komercijalno dostupnih induciranih pluripotentnih matičnih ćelija (iPSC); međutim, bio je veliki izazov efikasno proizvesti modele bubrežnih organoida od pacijenata sa autosomno dominantnim policističnimbubregbolest (ADPKD) koja rekapitulira i embriogenezu i mehanizme cistogeneze.

Click to cistanche nuspojave i koristi za bubrege

Metode: Krvni eritroidni progenitori (EP) iz dva ADPKD (autosomno dominantni policističnibubregbolesti) pacijenata i jednog zdravog donora (HC) korišten je kao komparativna kontrola za normalizaciju mnogih tehničkih koraka za reprogramiranje EP-a i za generiranje organoida. EP-ovi su reprogramirani epizomalnim vektorom u iPSC (inducirane pluripotentne matične ćelije), koje diferencirani su u bubrežne tubularne organoide, a zatim stimulirani forskolinom da izazovu stvaranje cista.

Rezultati: iPSC (indukovane pluripotentne matične ćelije) izvedene iz EP su pokazale sve karakteristike pluripotencije i bile su u stanju da se diferenciraju u sva tri zametna sloja. 3D tubularni organoidi su generisani iz pojedinačnih ćelija nakon 28 dana u Matrigelu. HC i ADPKD (autosomno dominantni policistični sindrombubregbolesti) organoidi nisu spontano formirali ciste, ali nakon stimulacije forskolinom, uočene su strukture slične cistama u ADPKD (autosomno dominantni policističnibubregbolest) organoidi, ali ne i u organoidima dobijenim od HC.

Zaključak: Nalazi ove studije su to pokazalibubregorganoidi su uspješno generirani iz krvnih EP ćelija ADPKD (autosomno dominantni policističnibubregbolesti) pacijenata i zdravog kontrolnog donora. Ovaj pristup treba da doprinese kao moćno oruđe za embrionbubregrazvojni model, koji je u stanju da rekapitulira vrlo rane patofiziološke mehanizme uključene u citogenezu.

KLIKNITE OVDJE DA SE DELITEⅠ

Diskusija

U ovoj studiji smo detaljno opisali postupak za generiranje organoida bubrega iz humanih iPSC-a (induciranih pluripotentnih matičnih stanica) dobivenih iz krvnih eritroidnih progenitor ćelija pacijenata sa ADPKD (autosomno dominantna bolest policističnih bubrega). Mnogi tipovi somatskih ćelija su uspešno reprogramirani u iPSC (indukovane pluripotentne matične ćelije), uključujući krvne ćelije [Z]. Ovdje smo se odlučili da koristimo krvne eritroidne progenitore kao početni tip ćelije iz više razloga, kao što su njihov genomski integritet, epigenetsko pamćenje i efikasno reprogramiranje [11,17,18]. Efikasnost kojom su eritroidni progenitori pretvoreni u iPSC bila je čak dva reda veličine bolja (7 posto -28 posto) od efikasnosti diferenciranih tipova krvnih stanica (0.0 2 posto -0.60 posto )ili fibroblasti (0.74 posto )[Z]. Uprkos maloj količini ovih ćelija u perifernoj krvi, one se lako mogu izolovati i proširiti in vitro kako bi se proizveo dovoljan broj za reprogramiranje. Jedan od najvažnijih izazova u uspostavljanju odgovarajućih iPSC-a je njihova genotipska i fenotipska varijabilnost [6], ali postoje neke tehničke strategije predložene da se takva varijabilnost zaobiđe ili smanji. U ovim eksperimentima koristili smo neintegrirajući epizomalni sistem za reprogramiranje koji ne zahtijeva integraciju genoma da bi se geni za reprogramiranje eksprimirali [10], omogućavajući manju imunogenost i čineći genetski stabilnije ćelije [19,20]. Štaviše, svi uzorci su izvedeni iz istog izvora, što pomaže da se minimizira epigenetska varijabilnost [12] pod pretpostavkom da diferencijacija početne ćelije može uticati na efikasnost krajnjih rezultata. Analize markera pluripotencije i sposobnosti iPSC-a (indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija) da se diferenciraju u sva tri zametna sloja upoređivane su jedna pored druge, a upoređene su i sa embrionalnom linijom ćelija H9, koja je korištena kao pozitivna kontrola. . Sva ova poređenja nisu pokazala značajne razlike između ADPKD (autosomno dominantna bolest policističnih bubrega) pacijenata, HC i H9 ćelija.

Razvijeno je nekoliko protokola za izazivanje diferencijacije iPSC-a (indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija) u organoide bubrega [13,21]. Na osnovu protokola koje su opisali Cruz et al. [6], dobili smo strukture sa karakteristikama proksimalnih tubula, uključujući ekspresiju NHE3 i AOP1. Pored toga, organoidi su eksprimirali NPHS2, što ukazuje na prisustvo ćelija sličnih podocitima.

Suprotno tome, AQP2 nije eksprimiran u ovim tubularnim organoidima. Ovaj nalaz je u skladu s prethodnim studijama koje ukazuju na nekoliko ograničenja u razvoju struktura izvedenih iz ureternog pupoljka (UB) in vitro, pri čemu razvoj UB zahtijeva posebne protokole, budući da je vremenski okvir za dodavanje specifičnog induktora vrlo ograničen [ 6,22,23].

U procesu generiranja bubrežnih organoida iz iPSC-a (inducirane pluripotentne matične ćelije), sva bubrežna embriogeneza se rekapitulira in vitro, u početku uključujući formiranje kavitiranih sferoida iz pojedinačnih ćelija [14]. Zaista, otkrili smo da nediferencirani iPSCss (inducirane pluripotentne matične ćelije) i kod pacijenata sa ADPKD (autosomno dominantna bolest policističnih bubrega) i kod zdrave kontrole formiraju sferoidne strukture slične epiblastima koje su morfološki slične. Iako sekvenciranje DNK gena PKD1 i PKD2 nije obavljeno u ovoj studiji, trenutni nalazi pokazuju da tip mutacije koju nose pacijenti nije imao utjecaja na tipičnu morfogenezu epiblasta. Dalja istraživanja su još uvijek potrebna kako bi se pravilnije procijenila ekspresija ključnih molekula uključenih u ovu fazu embrionalnog razvoja.

Prema protokolu koji su razvili Freedman et al. [14], primijetili smo da su se sferoidi ipak diferencirali u tubularne organoide 26 dana nakon indukcije diferencijacije, a vrijeme je bilo slično i za ADPKD (autosomno dominantna bolest policističnih bubrega) i HC (Slika ③). Ipak, uočili smo određene varijabilnosti u pogledu rasporeda izražavanja i nivoa markera diferencijacije. S druge strane, morfologija tubularnih struktura bila je slična i uporediva među uzorcima pacijenata sa ADPKD i HC. Nasuprot tome, koristeći iPSC (inducirane pluripotentne matične ćelije) koje potiču iz biopsije bubrega pacijenata sa ADPKD (autosomno dominantna bolest policističnih bubrega), grupa Cruz et al je otkrila veću varijabilnost u sposobnosti ovih ćelija da formiraju organoide[6]. Pored ogromne raznolikosti mutacija svojstvenih ovoj bolesti, ove razlike u efikasnosti dobijanja organoida mogu se objasniti i heterogenim tipovima ćelija prisutnim u uzorcima biopsije, za razliku od eritroidnih progenitora, koji čine homogeniju ćelijsku populaciju. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da uprkos varijabilnosti i razlikama u efikasnosti različitih iPSC klonova da formiraju organoide bubrega, dobijanje potonjeg od ADPKD (autosomno dominantna bolest policističnih bubrega) pacijenata može predstavljati jedinstven model za proučavanje višestrukih oblika fenotipskih manifestacija. ove bolesti. Štoviše, važno je napomenuti da ako postoji značajna varijabilnost mutacija u populaciji zahvaćenoj ADPKD, iPSC-ovi specifični za pacijenta (inducirane pluripotentne matične ćelije), budući da su potpuno imuno kompatibilni, mogli bi se koristiti za individualne regenerativne terapije u budućnosti. , osim što omogućava razvoj in vitro modela kako bi se provjerilo da li su vrlo rane fenotipske manifestacije također raznolike kao i klinička prezentacija.

Nestimulisani organoidi izvedeni od pacijenata sa HCor ADPKD (autosomno dominantna bolest policističnih bubrega) nisu spontano formirali ciste. Tipična morfologija cista i ekspresija markera cistogeneze nisu bili detektovani ni u jednom uzorku, čak i produžavajući diferencijaciju organoida u kulturi do navršenih 35 dana. Dokazano je da samo proliferacija ćelija ne proizvodi ciste[24]. Štaviše, potreban je treći nezavisni događaj (poznat kao treći pogodak) da bi se ubrzalo formiranje i rast cista in vivo [23]. Suprotno tome, formiranje cista izazvano forskolinom se dogodilo u organoidima pacijenata sa ADPKD, ali ne i kod onih iz HC. Treba napomenuti, iako su prisutne, ciste su uočene u niskom procentu u uzorcima ADPKD čak iu prisustvu forskolina, kao što su također primijetili Freedman et al. [14] u organoidima formiranim iz CRISPR/Cas9 modela ADPKD bolesti. Mogu se postaviti neke hipoteze kako bi se objasnila niska učestalost cista koja se nalazi u ovom modelu. 1)Organoidi uzgojeni u 3D suspenzijskom miljeu pokazali su mnogo veću efikasnost cistogeneze u poređenju sa adherentnim organoidima [6], što ukazuje da je mikrookruženje direktno implicirano u cistogenezi.2) Eksperimentalni protokol korišten u ovoj studiji formirao je organoide proksimalnih tubula, ali ne distalni dijelovi nefrona [23]. Iako svi segmenti nefrona mogu poticati ciste uključujući proksimalne tubule [25], čini se da su oni koji potiču iz sabirnih kanala veći i u većem broju od onih iz drugih segmenata [26], 3) Konačno, nedavno je pokazano da porijeklo cista može biti povezano sa prisustvom višestrukih mutacija PKD1 koje određuju ozbiljnost bolesti i da je formiranje cista u sabirnim kanalima povezano sa težinom bolesti [27, 28].

U zaključku, sadašnji nalazi su pokazali da je moguće generirati organoide s trodimenzionalnim strukturama sličnim arhitekturi progenitor bubrega koristeći iPSC (inducirane pluripotentne matične ćelije) reprogramirane iz eritroidnih progenitora koji su se lako izolirali od ADPKD (autosomno dominantna bolest policističnih bubrega) pacijenata i da su ovi organoidi u stanju da formiraju ciste pod forskolinom stimulacijom. Ova obećavajuća metodologija otkriva metodu za povećanje razumijevanja vrlo ranih genetskih, fenotipskih i fizioloških koraka u formiranju cista u okruženju ADPKD (autosomno dominantna bolest policističnih bubrega).

Reference

1. Chebib FT, Torres VE: Autosomno dominantna bolest policističnih bubrega: osnovni nastavni plan i program 2016. AmJ Kidney Dis, 67:792-810, 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.2015.07.0653PMID:265

2. WatnickTJ, Torres VE, Gandolph MA, Qian F, Onuchic LF, Klinger KW, et al: Somatska mutacija u pojedinačnim cistama jetre podržava model cistogeneze s dva pogotka kod autosomno dominantne policistične bolesti bubrega. Mol Cell,2:{{ 3}}, 1998 https://doi.orq/10.1016/s1097-2765(00)80135-5 PMID:9734362

3. Pei Y, WatnickT, He N, WangK, Liang Y, Parfrey P, et al.: Somatske PKD2 mutacije u pojedinačnim cistama bubrega i jetre podržavaju model cistogeneze "dva pogotka" kod autosomno dominantne policistične bolesti bubrega tipa 2. JAm Soc Nephrol, 10;1524-1529.1999 https://doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID:10405208

4. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG: Kritični razvojni prekidač definira kinetiku formiranja ciste bubrega nakon gubitka Pkd1.Nat Med, 13: 1490-1495,2007 https:/ l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720

5. TakakuraA, Contrino L, Zhou X, Bonventre JV, Sun Y, Humphreys BD, et al: Povreda bubrega je treći hit koji promoviše brzi razvoj policistične bolesti bubrega kod odraslih. Hum Mol Genet,18:2523-2531,2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421

6. Cruz NM. Song X, Czerniecki SM, Gulieva RE, Churchill AJ, Kim YK, et al: Organoidna cistogeneza otkriva kritičnu ulogu mikrookruženja u humanoj policističnoj bolesti bubrega. Nat Mater,16:1112-1119, 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID:28967916

7. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S: Indukcija pluripotentnih matičnih ćelija iz kultura fibroblasta. Nat Protoc,2:3081-3089,2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007.418 PMID:18079707

8. Freedman BS, Lam AQ, SundsbakJL, Latino R, Su X, Koon SJ, et al: Reducirani cilijarni policistin-2 u induciranim pluripotentnim matičnim ćelijama pacijenata s policističnom bolešću bubrega sa mutacijama PKD1. J Am Soc Nephrol,24:1571-1586,2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID:24009235

9. Chen HY, Tan HK, Loh YH: Derivacija pluripotentnih matičnih ćelija bez transgena iz jedne kapi krvi. Curr Protoc Stem Cell Biol, 38:4A.9.{5}}A.9.10,2016https: //doi.or/10.1002/CPSC.12 PMID:27532818

10. YuJ, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin Il, et al.: Ljudske inducirane pluripotentne matične ćelije bez vektorskih i transgenskih sekvenci.Science, 324:797-801,2009 https: //doi.org/10.1126/science. 1172482 PMID:19325077

11. EminliS, Foudi A, Stadtfeld M, Maherali N, Ahfeldt T, Mostoslavsky G, et al: Faza diferencijacije određuje potencijal hematopoetskih ćelija za reprogramiranje u indukovane pluripotentne matične ćelije. Nat Genet, 41: 968-976, 2009 https://doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214

12. Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, Resar LM, et al.: Efikasna derivacija ljudskih iPS ćelija neintegrišućim plazmidom iz krvnih ćelija sa jedinstvenim epigenetskim i genskim ekspresijskim potpisima. Cel/Res,21:518-529, 2011 https://doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID:21243013

13. Schutgens F, Verhaar MC, Rookmaaker MB: Organoidi bubrega izvedeni iz pluripotentnih matičnih ćelija: in vitro tehnologija slična in vivo. Eur J Pharmacol,790:12-20, 2016 https://ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06.059 PMID: 27375081

14. Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V, et al: Modeliranje bubrežne bolesti sa CRISPR mutantnim bubrežnim organoidima izvedenim iz humanih pluripotentnih epiblastnih sferoida. Nat Commun, 6:8715, 2015 https://doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500

15. Pei Y. ObaiiJ. Dupuis A. Paterson AD. Magistroni R. Dicks E, et al; Jedinstveni kriterijumi za ultrazvučnu dijagnozu ADPKD (autosomno dominantna bolest policističnih bubrega). JAm Soc Nephrol, 20:205-212,2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID:18945943

16. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, Nishiyama A, Matsumura M, Wataya T, et al: ROCK inhibitor omogućava preživljavanje disociranih ljudskih embrionalnih matičnih ćelija. Nat Biotechnol, 25:681-686,2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971

17. Hochedlinger K, Jaenisch R: Nuklearno reprogramiranje i pluripotencija.Nature,441:1061-1067,2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240

18. Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A, UtikalJ, Cowan C, Hochedlinger K: Sistem visoke efikasnosti za stvaranje i proučavanje pluripotentnih matičnih ćelija izazvanih ljudima. Celica/ Matična ćelija. 3:340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420