Fiksativ Karnovskyja sprječava pojavu artefakata kao vakuolacije nastale preradom tkiva u bubrezima tretiranim antisens oligonukleotidom Ⅱ

Makroskopski, nisu uočene abnormalne promjene. Dodatno, u hemiji krvi, bubrežni parametri (tj. BUN i CRE) nisu pokazali značajne promjene ni u jednoj grupi (Tabela 1).

Cistanche dodatak dodatak za podršku bubrežnoj funkciji PhGs75% Ech 30% Act 12%

Sažetak histopatoloških nalaza u bubrezima fiksiranim sa 10% NBF prikazan je u tabeli 2. Mikroskopski, bazofilne granule i vakuole u proksimalnim tubulima, posebno u segmentima S1 i S2, uočene su u oba ASO-1W i ASO-2W grupe za bubrege fiksirane sa 10% NBF (slika 1A). Ove promjene su bile ozbiljnije u ASO-2W grupi nego u ASO-1W grupi. Akumulacija bazofilnih granula uglavnom je uočena na rubu četkice proksimalnih tubula u obliku agregata i/ili punktatnih struktura. Kako se navodi da su bazofilne granule prisutne i unutar endosoma ili lizozoma i slobodno u citoplazmi proksimalnog tubularnog epitela14, ovi različiti oblici mogu odražavati njihovu akumuliranu površinu; to jest, agregati i punktuirane strukture mogu se akumulirati u lizosomima i citoplazmi, respektivno. Vakuole u proksimalnim tubulima bile su okruglog i grubog oblika, a većina je bila spojena sa susjednim vakuolama. Štaviše, neke od vakuola su sadržavale blijede bazofilne granule (slika 1E), što sugerira da su vakuole relevantne za akumulaciju ASO. Imunohistohemijski, LAMP-2 je bio pozitivan na površini membrane vakuola (sl. 1G i 1H). Rezultati su pokazali da je vakuolacija bila dilatacija lizosoma. Razlika u ozbiljnosti vakuolacije između ASO-1W i ASO{16}}W grupa može ukazivati ​​na razliku u broju ASO akumuliranih u lizosomima. Nagađamo da se količina ASO akumuliranih u lizosomima povećava s povećanjem vremena izlaganja ASO. Posljedično, lizozomska ekspanzija se pojavila kao vakuolacija zbog obrade tkiva.

Tabela 1. Podaci o hemiji krvi

Tabela 2. Histopatološki nalazi u bubrezima fiksirani sa 10% N

Iako je uočena umjerena vakuolacija, proksimalna tubularna degeneracija nije bila evidentna, a većina vakuoliranog epitela bila je negativna na KIM-1 u imunohistohemijskom bojenju (slika 1D). Nasuprot tome, za uzorke fiksirane u Karnovskyjevom fiksatoru, vakuole u proksimalnim tubulima su bile odsutne kod svih pojedinaca, dok su bazofilne granule često uočene (slika 1B). Bazofilne granule su bile izraženije od onih u uzorcima koji su bili podvrgnuti fiksaciji 10% NBF jer je ćelijska struktura bila dobro očuvana (slika 1F). U uzorcima podvrgnutim 4% PFA fiksaciji, uočene su vakuole i bazofilne granule; međutim, ozbiljnost vakuolacije bila je nešto niža od one u uzorcima podvrgnutim fiksaciji 10% NBF (slika 1C).

Oligonukleotidi su molekuli koji su vrlo topljivi u vodi i ekstrahiraju se iz tkiva tokom obrade zbog neuspjeha da se u potpunosti umreže ćelijske komponente.

Na osnovu ovih rezultata, zaključili smo da su vakuole u proksimalnim tubulima zahvaćene metodom fiksacije i da morfološke promjene uočene u tkivima podvrgnutim 10% NBF i 4% PFA fiksaciji mogu biti artefakti u području akumulacije ASO tokom obrade tkiva. Drugim riječima, vakuolacija može biti toksikološki beznačajna jer nije uočena tubularna degeneracija, povećana ekspresija KIM-1 ili abnormalne promjene bubrežnih parametara. Stoga predlažemo korištenje Karnovskyjevog fiksatora kao opcione metode fiksacije za precizno patološko ispitivanje bubrega kod životinja tretiranih ASO.

Zaključno, naši trenutni nalazi su otkrili moguću precjenu vakuolacije kada se koristi konvencionalna metoda fiksacije NBF. Karnovskyjev fiksativ može biti koristan alat za razlikovanje umjetnih vakuola od prave nefrotoksičnosti.

Slika 1. Reprezentativne mikrofotografije bubrega tretiranih antisens oligonukleotidom (ASO). Histopatološke promjene u grupi tretiranoj nukleinskom kiselinom koja sadrži antisense oligonukleotide (LNA-ASO) (ASO-2W) za 2-nedjelju (ASO-2W) za bubrege fiksirane sa (A) 10% neutralnim puferiranim rastvorom formaldehida (NBF), ( B) Karnovskyjev fiksativ, ili (C) 4% paraformaldehid fosfatni pufer (PFA). (D) Imunohistohemijsko bojenje za molekul povrede bubrega-1 (KIM-1) ​​od ASO-2W za bubrege fiksiran sa 10% NBF.Histopatološke promjene u 1-sedmičnoj grupi tretiranoj LNA-ASO (ASO-1W) za bubrege fiksirane sa (E) 10% NBF i (F) fiksatorom Karnovsky. Imunohistohemijsko bojenje za membranski protein 2 povezan sa lizozomima (LAMP-2) od (G) ASO-1W i (H) ASO-2W za bubrege fiksiran sa 10% NBF. (A) Bazofilne granule (crne strelice) i vakuole (crne vrhove strelica) su uočene u proksimalnim tubulima. Bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E). Bar{11}} μm. (B) Vakuole nisu uočene, ali su uočene bazofilne granule (crne strelice). H&E bojenje. Bar{12}} μm. (C) Uočene su bazofilne granule (crne strelice) i vakuole (crni vrhovi strelica). Međutim, ozbiljnost vakuolacije bila je niža od one u uzorcima podvrgnutim fiksaciji 10% NBF. H&E bojenje. Bar{14}} μm. (D) Većina vakuoliranih proksimalnih tubula je negativna na KIM-1. Bar{16}} μm. (E, F) Neke od vakuola uočenih u proksimalnim tubulima sadržavale su slabo bazofilne granule (zelene strelice). Bazofilne granule su jasno uočene, a ćelijska struktura je očuvana (zeleni vrhovi strelica). H&E bojenje. Šipke=20 μm. (G, H) Površina membrane vakuola je pozitivna na LAMP-2 (plave strelice). Šipke=20 mm.

Otkrivanje potencijalnog sukoba interesa: Autori izjavljuju da nemaju sukob interesa.

Priznanje: Autori su zahvalni Keisuke Yoshikawa i Tetsuya Ohta na njihovim ljubaznim savjetima.

Reference

1. Rinaldi C i Wood MJA. Antisens oligonukleotidi: sljedeća granica za liječenje neuroloških poremećaja. Nat Rev Neurol. 14: 9–21. 2018. [Medline] [CrossRef]

2. Uemura Y i Kobayashi K. Ciljanje mišjih alveolarnih makrofaga intratrahealnom primjenom zaključane nukleinske kiseline koja sadrži antisens oligonukleotide. Drug Deliv. 26: 803–811. 2019. [Medline] [CrossRef]

3. Bennett CF. Terapeutski antisens oligonukleotidi postaju punoljetni. Annu Rev Med. 70: 307–321. 2019. [Medline] [CrossRef]

4. Frazier KS. Antisens oligonukleotidne terapije: obećanje i izazovi iz perspektive toksikološkog patologa. Toxicol Pathol. 43: 78–89. 2015. [Medline] [CrossRef]

5. Engelhardt JA. Komparativna renalna toksikopatologija antisens oligonukleotida. Nukleinska kiselina Ther. 26: 199–209. 2016. [Medline] [CrossRef]

6. Frazier KS, Sobry C, Derr V, Adams MJ, Besten CD, De Kimpe S, Francis I, Gales TL, Haworth R, Maguire SR, Mirabile RC, Mullins D, Palate B, Doorten YPS, Ridings JE, Scicchitano MS , Silvano J i Woodfine J. Specifični inflamatorni odgovori kao primarna komponenta za razvoj glomerularnih lezija kod miševa i majmuna nakon kronične primjene druge generacije antisens oligonukleotida. Toxicol Pathol. 42: 923–935. 2014. [Medline] [CrossRef]

7. Sewing S, Gubler M, Gérard R, Avignon B, Mueller Y, Braendli-Baiocco A, Odin M i Moisan A. GalNAc konjugacija smanjuje citotoksičnost antisens oligonukleotidnih lijekova u bubrežnim tubularnim stanicama. Mol Ther nukleinske kiseline. 14: 67–79. 2019. [Medline] [CrossRef]

8. Kakiuchi-Kiyota S, Koza-Taylor PH, Mantena SR, Nelms LF, Enayetallah AE, Hollingshead BD, Burdick AD, Reed LA, Warneke JA, Whiteley LO, Ryan AM, i Mathialagan N. Poređenje profila jetrene transkripcije antisens oligonukleotidi ribonukleinske kiseline: dokaz različitih puteva koji doprinose neciljanoj toksičnosti kod miševa. Toxicol Sci. 138: 234–248. 2014. [Medline] [CrossRef]

9. Hagedorn PH, Yakimov V, Ottosen S, Kammler S, Nielsen NF, Høg AM, Hedtjärn M, Meldgaard M, Møller MR, Ørum H, Koch T, i Lindow M. Hepatotoksični potencijal terapijskih oligonukleotida može se predvidjeti iz njihove sekvence. i obrazac modifikacije. Nukleinska kiselina Ther. 23: 302–310. 2013. [Medline] [CrossRef]