Izolacija ekstrakta iz simbiotičkog mikroorganizma mekog koralja Salinispora Arenicola koji djeluje citoprotektivno i protiv starenja 1. dio

Abstract: Ćelije su razvile visoko integrisan sistem odgovoran za stabilnost proteoma, odnosno proteostazna mreža (PN). Kako je gubitak proteostaze obilježje starenja i bolesti povezanih sa starenjem, aktivacija PN modula vjerovatno može produžiti zdravstveni raspon. Ovdje predstavljamo podatke o bioaktivnosti ekstrakta (SA223-S2BM) pročišćenog iz soja Salinispora arenicola TM223-S2 koji je izolovan iz mekog korala Scleronephthya lewinsohni; ovaj koral je sakupljen na dubini od 65 m iz mezofotskog ekosistema Crvenog mora EAPC (južni Eilat, Izrael). Tretman ljudskih ćelija sa SA223-S2BM aktiviranim proteostatskim modulima smanjio je oksidativno opterećenje i pružio zaštitu od oksidativnog i genotoksičnog stresa. Štaviše, SA223-S2BM je pojačao aktivnosti proteazoma i lizozomalnih katepsina kod muva Drosophila i pokazao zaštitne efekte kože, što je dokazano efikasnom inhibicijom enzima, elastaze i tirozinaze povezanih sa starenjem kože. Predlažemo da ekstrakt SA223-S2BM predstavlja vjerovatno obećavajući izvor za davanje prioriteta molekulima sa svojstvima protiv starenja.

Glikozid cistanche takođe može povećati aktivnost SOD u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, efikasno hvatajući različite reaktivne radikale kisika (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNK uzrokovanih od strane OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju jaku sposobnost uklanjanja slobodnih radikala, veću redukcijsku sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji sperme, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju spermatozoida. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i plućnim tkivima eksperimentalno starenja miševa uzrokovanih D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina. dobar učinak čišćenja na DPPH, produžava vrijeme hipoksije kod starijih miševa, poboljšava aktivnost SOD u serumu i odlaže fiziološku degeneraciju pluća kod eksperimentalno starenja miševa. i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH i sposobnost uklanjanja reaktivnih vrsta kisika i sprječavanja degradacije kolagena izazvane slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravljanja oštećenja anjona slobodnih radikala timina.

Kliknite na cistanches herba

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Ključne riječi: starenje; antioksidativni odgovori; morski mikroorganizmi; proteostazna mreža; Salinispora arenicola

1. Uvod

Starenje karakterizira vremenski ovisan pad funkcionalnog kapaciteta i otpornosti na stres, kao i povećani mortalitet i morbiditet [1]. Starenje nije samo pasivan proces, jer ga reguliraju evolucijski očuvani molekularni i ćelijski signalni događaji [2,3]. Organizmi su stalno izloženi izazovima kako unutarnjim (u vezi s metabolizmom) tako i vanjskim (iz ishrane ili okoliša) stresorima, što može dovesti do postepenog nakupljanja oštećenih biomolekula i na kraju ugroziti ćelijsku homeostazu [4,5]. Proteini su uključeni u sve ključne ćelijske funkcije i stoga je homeostaza proteoma (proteostaza) kritična za staničnu funkcionalnost i preživljavanje [6].

Integritet proteoma održava se proteostaznom mrežom (PN), koja se proteže na sve subcelularne odjeljke i regulirana je na ćelijskom, tkivnom i nivou organizma kako bi se osiguralo zdravlje i dugovječnost organizma [7]. Održavanje proteostaze zahtijeva da ćelije koordiniraju i regulišu funkcije sinteze, savijanja, sortiranja, transporta i degradacije svih polipeptida [8,9]. Ove ćelijske funkcije uglavnom provode tri glavne međusobno povezane grane PN, naime mreža molekularnih šaperona, ubikvitin-proteasom (UPP) i proteolitički putevi autofagije-lizozoma (ALP) [10,11].

Molekularni šaperoni osiguravaju pravilno savijanje proteina i održavanje konformacije, a također sarađuju sa putevima degradacije [12]. UPP je glavno mjesto kontrole kvalitete sinteze proteina i uključen je u recikliranje normalnih kratkoživih proteina i nereparativnih pogrešno savijenih ili nesavijenih proteina [6], dok je ALP odgovoran za prepoznavanje i uklanjanje proteinskih agregata i oštećenih organela [13]. Gubitak proteostaze je obilježje starenja [14], kao i glavni faktor rizika za mnoge ljudske patologije povezane sa starenjem, uključujući rak, dijabetes, kardiovaskularne poremećaje i neurodegenerativne bolesti [15]. Stoga se aktivacija PN smatra obećavajućim pristupom za odlaganje početka i/ili progresije starenja i bolesti povezanih sa starenjem [16–18].

Starenje kože karakteriziraju strukturne i funkcionalne promjene u (između ostalog) komponentama ekstracelularnog matriksa, kao što je elastin [19]. Elastaza je enzim uključen u razgradnju elastina, što rezultira razvojem bora i gubitkom elastičnosti [20]. Tirozinaza je ključni enzim u sintezi melanina, koji je odgovoran za pigmentaciju (između ostalog) ljudske kože [21,22]. Međutim, prekomjerna aktivacija tirozinaze povezana je s nekoliko kožnih poremećaja, kao što su hiperpigmentacija i melanom[22,23]. Stoga, inhibicija elastaze i tirozinaze predstavlja istaknuti pristup protiv starenja kože.

Prirodni proizvodi (NP) imaju dugu istoriju – dobro dokumentovanu, pre rođenja moderne nauke i tehnologije, u različitim kulturama – lečenja ljudskih bolesti [24–26]. Stoga, NP mogu poslužiti kao visoko obogaćeni početni materijali i skele za razvoj lijekova; zaista, više od polovine svih lijekova su ili NP-ovi, NP-ovi izvedeni ili NP-inspirirani [27-29]. Morski svijet, koji ima najveći biodiverzitet, uglavnom je neistražen i stoga može biti najveći resurs za otkrivanje novih NP-a [30]. Među organizmima koji žive u morskom okruženju, meki koralji su obećavajući dobavljači bioaktivnih NP-a i poznato je da ugošćuju mnoge različite mikroorganizme [31,32].

S obzirom na ove činjenice, trenutno provodimo opsežan skrining NP-a visoke propusnosti kako bismo identificirali bioaktivne molekule koji bi potencijalno mogli odgoditi ćelijsko starenje i/ili starenje in vivo. U ovdje predstavljenoj studiji ispitali smo metanolni ekstrakt, odnosno SA223-S2BM, soja Salinispora arenicola (S. arenicola) TM223-S2 primjenom in vitro testova, kao i na ćelijskoj bazi i in vivo bio-vođeni pristupi. S. arenicola TM223-S2 soj je izolovan iz mekog koralja Scleronephthya lewinsohni (S. Levinson) (prvobitno nazvanog Scleronephthya lewinsohni od strane Verseveldt i Benayahu, 1978), koji je održivo dobijen iz mezofotskog sistema Crvenog mora (EAPC) južni Eilat, Izrael) na dubini od 65 m. Ekstrakt metanola SA223-S2BM aktivirao je citoprotektivne mehanizme kako u ljudskim ćelijama tako iu muvama Drosophila melanogaster (D. melanogaster) i pokazao in vitro zaštitna svojstva kože. Stoga bi ekstrakt SA223-S2BM mogao biti izvor za vjerovatnu identifikaciju molekula s potencijalnim citoprotektivnim svojstvima i svojstvima protiv starenja.

2. Materijali i metode

2.1. SA223-Porijeklo i izolacija ekstrakta S2BM

2.1.1. Coral Collection

Meki koral S. Levinson sakupio je ROV H800 (ECA Robotics) kojim je upravljao Sam Rothberg R/V sa Međuuniverzitetskog instituta za morske nauke u Eilatu (IUI). Na licu mjesta, fotografiranje je obavljeno crno-bijelom kamerom pri slabom osvjetljenju VS300 (ECA Robotics) i 1CAM Alpha HD kamerom (SubC Imaging). Uzorci su dobijeni pomoću ROV kraka sa mezofotskog grebena Eilata, u blizini terminala za naftu (29◦300 47.0900 N, 34◦350 56.7100 E), na 65 m, 7. marta 2017. Mjesto sakupljanja karakterizira umjerena padina sa stjenovitim dijelovima okruženim pješčanim morskim dnom. Nakon sakupljanja, materijal je odmah zamrznut na -80 ◦C. Uzorak vaučera je sačuvan u 70 posto etanola za taksonomsku identifikaciju i deponovan u Steinhardt Museum of Natural History, Univerzitet u Tel Avivu (SMNHTAU_Co{16}}).

2.1.2. Izolacija i identifikacija soja

S. arenicola TM223-S2 je izolovan iz uzorka od 1 mL S. Levinsona. Sakupljeni uzorak mekog koralja samljeven je u sterilnoj morskoj vodi i zagrijavan na 50 ◦C 1 h. Rezultirajuća suspenzija je serijski razrijeđena, postavljena na agar mediju za selektivnu izolaciju i inkubirana na 28 ◦C najmanje 6 sedmica. Izoliran je soj Salinispora, a kolonija je pročišćena na morskom bujon agaru (MBA) (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD) i konzervirana na -20 ◦C u 10-postotnom rastvoru glicerola.

2.1.3. Phylogeny Investigation

Filogena analiza je izvršena korištenjem fragmenta gena 16S rRNA amplificiranog iz genomske DNK S. arenicola TM223-S2. Genomska DNK soja TM223-S2 je izolirana korištenjem DNeasy kompleta za krv i tkivo (Qiagen), prema uputama proizvođača. 16S ribosomalni RNA fragment je amplificiran PCR-om korištenjem prajmera 16S F 27, AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG (Tm: 56,3 ◦C) i 16S R 1492, TAC GG(CT) TAC CTT GTT ACG ACT T ( Tm: 57,5 ​​◦C). Amplikoni su sekvencionirani Sangerovim sekvenciranjem i sekvence su poređane sa bazom podataka 16S ribosomalne RNK iz projekta Targeted Loci NCBI koristeći MUSCLE. Poravnanje je ručno pregledano, a praznine su uklonjene. Evolucijska historija je zaključena korištenjem metode maksimalne vjerovatnoće i Tamura-Nei modela [33] sa 1000 ponavljanja. Početno stablo za heurističku pretragu dobijeno je automatski primjenom susjednog spoja i BioNJ algoritama na matricu udaljenosti u paru procijenjenih korištenjem pristupa najveće kompozitne vjerovatnoće (MCL), a zatim odabirom topologije sa superiornom vrijednošću log vjerovatnoće. Evolucione analize su sprovedene u MEGA X verziji 10.1.7 [34].

2.1.4. Uslovi uzgoja

S. S. arenicola TM{0}}S2 spore su konzervirane na -20 ◦C u 10 posto glicerola. Prije kultivacije, soj je oživljavan 15 dana na Petrijevoj ploči od 15 cm koja je sadržavala MB (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD) dopunjen sa 2 posto agara (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA , SAD). Sterilna morska voda (4 × 10 mL) je izlivena na površinu ploče, a spore i micelij su izvučeni sa ploče blagim grebanjem površine skalpelom kako bi se stvorio inokulum. Fermentacija u tečnom stanju (LSF) je sprovedena u Erlenmajer tikvici od 2 L tokom 20 dana na 28 ◦C i 130 rpm mešanja. Amberlite XAD16 smola (30 g/L) (Amberlite XAD16HP N, Certis, Lenntech, Delfgauw, Holandija) dodata je prije sterilizacije kako bi se omogućilo in situ hvatanje mikrobnih metabolita. Pet mililitara inokuluma korišteno je za inokulaciju 1 L na MB koji sadrži 30 g Amberlite XAD16 smole. Fermentacija u agarnom stanju zajedno sa ekstrakcijom u čvrstoj fazi (SPE) [35] izvedena je na MB medijumu (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD) sa dodatkom 2% agara (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD) preko 20 dana na 28 ◦C. Sterilizovani Amberlit XAD16 (35 g) pomešan sa 35 mL inokuluma je homogeno raspoređen na površinu Petri ploče od 1 MB agar (25 cm × 25 cm).

Za LSF, smola XAD16 je odvojena od bujonske kulture filtriranjem i isprana vodom prije nego što je eluirana etil acetatom (100 mL), a zatim metanolom (100 mL). Eluati su koncentrirani do suva u vakuumu i rastvoreni u DMSO pri koncentraciji od 10 mg/mL. Dobijeni ekstrakt, SA223-S2LAE (ekstrahovan etil acetatom), korišten je za biološke procjene.

Za SPE, smola XAD16 je dobijena pažljivim grebanjem površine agar ploče. Regenerisana smola je isprana vodom da bi se eliminisala biomasa pre nego što je eluirana etil acetatom (100 mL), a zatim metanolom (100 mL). Eluati su koncentrirani do suva u vakuumu i rastvoreni u DMSO pri koncentraciji od 10 mg/mL. Dobijeni ekstrakti, SA223-S2BAE (ekstrahovani etilacetatom) i SA223-S2BM (ekstrahovani metanolom), korišteni su za biološke evaluacije.

2.2. Aktivnosti inhibicije elastaze i tirozinaze

Inhibicijska aktivnost na elastazu prioritetnog ekstrakta procijenjena je korištenjem elastaze iz svinjskog pankreasa (PPE) tipa IV (Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka) i supstrata N-sukcinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida (Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka), kao što je prethodno opisano [36]. Utvrđen je kapacitet ekstrakta da inhibira katalitičko djelovanje tirozinaze u oksidaciji L-DOPA u dopahrom, kao što je ranije objavljeno [37].

2.3. Ćelijske linije, uslovi ćelijske kulture i test vitalnosti ćelije

Ljudski fibroblasti kožice (BJ ćelije) kupljeni su od Američke zbirke kultura tkiva (ATCC), dok su humani besmrtni keratinociti (HaCaT ćelije) dobijeni od Elabscience, Inc. Obje ćelijske linije su uzgajane u Dulbecco-ovom modificiranom orlovom mediju (DMEM) (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD) suplementirane sa 10 posto (v/v) fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 1 posto (v/v) neesencijalnih aminokiselina i održavane su u uvjetima od 5 posto CO2, 95 posto vlažnost i 37 ◦C. U svim primijenjenim eksperimentalnim postupcima, ćelije su subkulturirane korištenjem otopine tripsin/EDTA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD). Efekat ekstrakta SA223-S2BM na vitalnost ćelija procenjen je korišćenjem MTT testa, kao što je ranije objavljeno [38]. Tretman ćelija vodonik peroksidom (H2O2) i doksorubicinom (DXR) izveden je kako je opisano u legendama slika; H2O2 i DXR su dobijeni od Merck KGaA (Darmstadt, Njemačka).

2.4. Linije drozofile i test dugovječnosti

U ovoj studiji koristili smo soj Drosophila w1118 nabavljen od Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington, IN, SAD). Muhe su održavane na 25 ◦C i 60 posto vlažnosti na ciklusu svjetla od 12 sati: 12 sati u mraku. U svim prikazanim eksperimentima analizirana su samo somatska tkiva (glava i grudni koš) muva, budući da reproduktivna tkiva pokazuju izrazitu regulaciju proteostatskih mehanizama i brzine starenja u odnosu na somatska tkiva [39].

Dugovječnost muva je analizirana kao što je opisano prije [40] korištenjem ženki i mužjaka (jednak broj po spolu) koje su uzgajane u bočicama koje sadrže (ili ne) proučavani ekstrakt. Muhe su prebačene u bočice sa svježom hranom svaka dva dana, a smrtnost je bilježena svakodnevno. Za krivulje preživljavanja i statističku analizu korišteni su Kaplan–Meierova procedura i log-rank (Mantel–Cox) test; značajnost je prihvaćena na p < 0,05.

2.5. Mjerenje vrsta reaktivnog kisika (ROS)

Ćelije ili tkiva muha su inkubirana sa CM-H2DCFDA bojom (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD) u koncentraciji od 10 µM u PBS-u 30 minuta u mraku (37 ◦C i 25 ◦C, respektivno). Nakon uklanjanja boje, ćelije ili tkiva muha su inkubirane sa PBS-om 15 minuta u mraku (37 ◦C i 25 ◦C, respektivno), lizirane u puferu za lizu [150 mM NaCl, 1 posto (v/v) NP{{ 11}}, 50 mM Tris, pH 8,0] i zatim centrifugiran na 14,000 g 15 min (4 ◦C). Nakon toga, sadržaj proteina je mjeren Bradfordovim testom (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, Kalifornija, SAD), a proizvedena fluorescencija je mjerena u Spark® multimode čitaču mikroploča (Tecan Trading AG, Männedorf, Švicarska) pri ekscitaciji i talasne dužine emisije od 490 i 540 nm, respektivno. Vodikov peroksid (H2O2) je korišten kao pozitivna kontrola, jer je široko poznato da uzrokuje oksidativna oštećenja/stres [41].

2.6. Ekstrakcija RNK, sinteza cDNK i kvantitativna PCR analiza u realnom vremenu (Q-RT-PCR)

Ukupna RNK je ekstrahovana iz ćelija korišćenjem RNAiso plus (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) i kvantifikovana sa BioSpec-nano spektrofotometrom (Shimadzu Inc., Kjoto, Japan). Nakon toga, 1 µg RNK je pretvoren u cDNK pomoću FastGene Scriptase II cDNA kompleta (NIPPON Genetics, Düren, Njemačka). Za izvođenje kvantitativnih PCR analiza u realnom vremenu korišteni su 5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix (Solis BioDyne, Tartu, Estonija) i PikoRealTM PCR sistem u realnom vremenu (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD). Specifični prajmeri za proučavane ljudske gene bili su kao što je opisano ranije [42]. HMBS gen je korišten kao normalizator.

2.7. Imunobloting analiza i mjerenje aktivnosti proteasoma i katepsina

Imunobloting studije su sprovedene kao što je prethodno opisano [43]. Primarna i sekundarna antitijela konjugirana s peroksidazom rena su primijenjena 1 h na sobnoj temperaturi i imunoblotovi su razvijeni korištenjem kompleta reagensa za poboljšanu hemiluminiscenciju (ClarityTM Western ECL Substrate, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, Kalifornija, SAD). Kvantitacija imunoblotova izvršena je skenirajućom denzitometrijom i softverom ImageJ [44].

Enzimske aktivnosti proteasoma i katepsina u ćelijama ili tkivima muha mjerene su na VersaFluor™ fluorometarskom sistemu (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, Kalifornija, SAD) koristeći Suc-LLVY-AMC (aktivnost slična himotripsinu, CT-L) i Z-FR-AMC fluoropeptidi (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, SAD), kao što je prethodno opisano [42,45,46]. 6-bromoindirubin-30 -oksim (6BIO) je korišten kao pozitivna kontrola, jer je poznato da aktivira UPP i u ljudskim ćelijama i u mušicama Drosophila [42,47]; lijek Rapamycin, korišten je kao pozitivna kontrola za indukciju ALP i katepsina [48].

2.8. Korišćena antitela

Primarna antitijela protiv 5 (sc-55009) proteazomske podjedinice, NQO1 (sc-16464), Beclin 1 (BECN1) (sc-11427), Clusterin (CLU) (sc{{7} }), HSP27 (sc-13132), HSP70 (sc-59570) i GAPDH (sc-25778), kao i sekundarna antitijela konjugirana s peroksidazom hrena, kupljena su od Santa Cruza Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, SAD). Primarna antitela protiv 53BP1 (4937), fosfo-histona H2A.XSer139 (H2A.X) (9718) i fosfora-p53Ser15 (9286) dobijena su od Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, SAD). Antitelo protiv SQSTM1/p62 (BML-PW9860) kupljeno je od Enzo Life Science, Inc. (Farmingdale, NY, SAD).

2.9. Statističke analize

Eksperimenti su izvedeni barem u duplikatu. Za statističke analize korišten je MS Excel. Statistička značajnost je procijenjena korištenjem Studentovog t-testa (t-test). Tačke podataka odgovaraju srednjoj vrednosti nezavisnih eksperimenata, a trake greške označavaju standardnu ​​devijaciju (SD); značajnost na p < 0.05 ili p < 0,01 je na grafikonima označena jednom ili dvije zvjezdice, respektivno.

3. Rezultati

3.1. Identifikacija aktinomiceta povezanog s mekim koralom S. Levinson

Ciljani soj mikroba izolovan je iz koralja S. Levinson, koji je meki koralj endem za Crveno more. Kolonije ovog koralja se obično nalaze na dubokim lokacijama, kako u ekosistemima gornjih mezofotskih koraljnih grebena (30-60 m), tako iu ekosistemima nižih mezofotskih koraljnih grebena (60-105 m) [49]. Štoviše, to je azooksantelat meki koralj koji svoje energetske potrebe ostvaruje hranjenjem filterom i stoga se nalazi u staništima izloženim jakim strujama vode.

Filogenetskom analizom zasnovanom na sekvenci 16S rRNA utvrđeno je da izolat TM223-S2 pripada rodu Salinispora (Slika 1).

Budući da se S. arenicola može razlikovati od S. Pacifica i S. tropica na osnovu sekvence 16S rRNA [50], ovaj izolat smo nazvali S. arenicola TM223-S2 s pristupnim brojem Genbank MW446171. Soj je kultivisan kako je navedeno u odjeljku o materijalima i metodama i ekstrahiran etilacetatom i metanolom. Preliminarno biološko ispitivanje pokazalo je da ekstrakt iz tečne kulture, SA223-S2BAE, i ekstrakt etil acetata iz čvrste kulture, SA223-S2LAE, nemaju značajnu biološku aktivnost (Slika S1). Stoga je u ovoj studiji korišten samo metanolni ekstrakt iz čvrste kulture povezane s ekstrakcijom u čvrstoj fazi, SA223-S2BM.

3.2. Ekstrakt SA223-S2BM ne pokazuje toksičnost u ljudskim ćelijama i aktivira ključne komponente PN

Prvo smo ispitali efekat SA223-S2BM na održivost normalnih fibroblasta BJ kože i humanih besmrtnih HaCaT keratinocita izvođenjem MTT testa toksičnosti. U tu svrhu, ćelije su inkubirane 24 h uz povećanje koncentracije ekstrakta i, kao što je prikazano na slici 2A1, A2, ekstrakt ne ispoljava citotoksični učinak ni na jednu od dvije ispitivane stanične linije u koncentracijama do 10 µg/mL. ; pri višim koncentracijama (iznad 10 µg/mL), ekstrakt smanjuje vitalnost stanica uglavnom u HaCaT stanicama.

Zatim smo proučavali učinak ekstrakta na ćelijske puteve, koji osiguravaju proteomsku stabilnost ćelije. Uočili smo da je kratkotrajna (24 h) izloženost BJ fibroblasta ispitivanom ekstraktu značajno inducirala ekspresiju gena proteasoma PSMB7 (u koncentraciji od 10 µg/mL), dok je paralelno imala tendenciju povećanja ekspresije PSMB6 gen u istoj koncentraciji (slika 2B1). Osim toga, ekstrakt je inducirao ekspresiju 20S proteasomskog gena, PSMB6, i 19S proteasomskog gena, RPN11 u koncentraciji od 1 µg/mL u HaCaT ćelijama (Slika 2B2). Nadalje, tretman BJ fibroblasta ekstraktom tokom 24 sata doveo je do blage indukcije nivoa ekspresije 20S 5 proteazomske podjedinice u koncentraciji od 1 µg/mL (slika 2C). U prilog našim nalazima, izlaganje ekstraktu značajno je povećalo aktivnost proteasoma nalik kimotripsinu kako u BJ fibroblastima tako i u HaCaT keratinocitima nakon 24 h inkubacije (Slika 2D1, D2); različiti rezultati ispitivanih koncentracija ekstrakta među BJ i HaCaT ćelijama mogu se pripisati efektima specifičnim za tip ćelije.

Dodatno, Q-RT-PCR analize ekspresije su otkrile da tretman BJ fibroblasta ekstraktom u trajanju od 24 sata izaziva nivoe ekspresije gena povezanih sa ALP, nazvanih CTSB, CTSL, CTSD i SQSTM1, u koncentraciji od 10 µg/mL ( Slika 3A1). Nadalje, primijetili smo da je izlaganje HaCaT ćelija ekstraktu tokom 24 sata dovelo do indukcije nivoa ekspresije gena uključenih u ALP funkcionalnost (CTSB, CTSL, CTSD i SQSTM1) (Slika 3A2).

U skladu sa ovim nalazima, uočili smo povećanje regulacije proteina BECN1 i SQSTM1/p62 povezanih s autofagijom nakon izlaganja BJ fibroblasta ekstraktu u koncentraciji od 1 µg/mL (Slika 3B1); povećani nivoi ekspresije proteina BECN1 i SQSTM1/p62 takođe su primećeni u HaCaT keratinocitima u obe proučavane koncentracije (Slika 3B2). U skladu s tim, otkrili smo da ekstrakt pojačava enzimsku aktivnost lizozomalnih katepsina u BJ i HaCaT ćelijama (Slika 3C1, C2); opet, različiti rezultati ispitivanih koncentracija ekstrakta među BJ i HaCaT ćelijama mogu se pripisati efektima specifičnim za tip ćelije.

Nadalje, ispitali smo učinak ekstrakta na nivoe ekspresije ključnih molekularnih pratilaca. Dakle, imunobloting analize su otkrile da je ekstrakt inducirao nivoe ekspresije molekularnih šaperona CLU (u obje proučavane koncentracije) u BJ ćelijama (slika 3D1), kao i HSP27 (1 µg/mL) i HSP70 (u obje proučavane koncentracije) u HaCaT ćelijama (slika 3D2).

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】