Izolacija i kvantifikacija ginsenozida Rh23, novog anti-melanogenog spoja iz listova panax ginsenga

sažetak:

Novi ginsenozid, nazvan ginsenoside Rh23 (1) i 20-O- -D-glukopiranozil-3 ,6 , 12 ,20 ,25-pentahydroxydammar-23-en (2) izolovani su iz listova hidroponskog Panax ginsenga. Jedinjenja su izolirana različitim kolonskim kromatografijama i njihove strukture su određene na osnovu spektroskopskih metoda, uključujući masenu spektrometriju visoke rezolucije/vrijeme leta (HR-QTOF/MS), spektroskopiju nuklearne magnetne rezonance (NMR) i infracrvenu (IR) spektroskopiju . Da bi se utvrdilo antimelanogeno djelovanje, testirana je promjena sadržaja melanina u Melan-a stanicama tretiranim identificiranim jedinjenjima.

Dodatno, istražili smo inhibitorne efekte ginsenozida Rh23 na melanin na pigmentaciju u modelu zebrice in vivo. Jedinjenje 1 inhibira snažnu melanogenezu u melan-a ćelijama sa 37.0 posto inhibicije melanogeneze na 80 µM i također predstavlja inhibiciju pigmentacije tijela u modelu zebrice. Iako je spoj 2 pokazao nešto nižu inhibitornu aktivnost od spoja 1, također je pokazao značajno smanjenu melanogenezu u Melan-a stanicama i modelu zebrice. Ovi rezultati su pokazali da se jedinjenja izolovana iz hidroponskog P. ginsenga mogu koristiti kao nova jedinjenja za izbeljivanje kože kroz in vitro i in vivo sisteme. Nadalje, ova studija je pokazala korisnost spoja 1 baziranog na MS za kvantitativnu analizu. Ginsenoside Rh23 (1) je pronađen u količini od 0,31 mg/g u listovima hidroponskog P. ginsenga.

Za melanin smo otkrili da Cistanche može značajno smanjiti aktivnost tirozinaze, koja je glavni enzim koji ograničava brzinu u biosintezi melanina kože i koji je kompleks bakra i proteina. Može hidroksilirati tirozin, glavnu sirovinu za proizvodnju melanina u tijelu, kako bi proizveo L-dopu, a zatim oksidirao dopu u dopakinon. Dopakinon prolazi kroz niz metaboličkih procesa, preuređuje se i polimerizira, i na kraju se kombinujući s proteinima stvara niz pigmenata melanina koji uzrokuju smeđe boje. Melanin je najvažniji faktor u određivanju boje kože ljudskog tijela. Prekomjerna sinteza može uzrokovati stvaranje pigmentiranih kožnih bolesti kao što su pjege, kloazma, staračke pjege i melanom. Stoga se kroz istraživanje inhibicije aktivnosti tirozinaze mogu izdvojiti djelotvorni sastojci za inhibiciju pigmentacije kože, pa se može vidjeti da ukupni glikozidi Cistanche deserticola djeluju na inhibiciju pigmentacije kože i izbjeljivanje ljepote.

Kliknite proizvod za doziranje cistanche

Ključne riječi:

ginsenoside Rh23; Panax ginseng; NMR; UPLC-QTOF/MS; zebrafish; kvantitativna analiza.

1. Uvod

Panax ginseng CA Meyer je vrlo poznata tradicionalna ljekovita biljka u azijskim zemljama. Panax potiče od "panaceje", što znači lijek za sve bolesti. P. ginseng je višegodišnja zeljasta biljka koja pripada porodici Araliaceae [1]. Korijeni P. ginsenga stari od četiri do šest godina uglavnom se koriste u terapeutske svrhe. Cvjetovi cvjetaju u junu, a listovi imaju oblik nepca. P. ginseng se uglavnom uzgaja u istočnoj Aziji, uključujući Koreju, Kinu i Japan [2]. Do danas su objavljena mnoga istraživanja o hemijskim sastojcima korijena, listova i bobica ginsenga; izolovano je više od 100 vrsta ginsenozida. Prijavljene su različite bioaktivnosti P. ginsenga, kao što su poboljšanje imunomodulatorne aktivnosti, nutritivna fortifikacija, poboljšanje funkcije jetre, antidijabetes, antikancerogena, anti-apoptotička i antioksidativna aktivnost [3–10].

Trenutno, interes za poljoprivredne proizvode visokog kvaliteta koji se odnose na dobrobit postupno raste, što dovodi do hidroponskog uzgoja ginsenga. Hidroponska kultivacija ima prednosti jednostavnog procesa uzgoja i kraćeg perioda rasta od uzgoja tla. Hidroponskom ginsengu je potrebno samo 2-4 mjeseca u sistemu koji kontrolira temperaturu, bez pesticida je, vlažan, lagan, ima organske sastojke itd. [11]. Listovi ginsenga za uzgoj tla ne koriste se u medicinske svrhe i funkcionalno povrće, dok se listovi hidroponskog ginsenga mogu koristiti.

In a previous study, the contents and composition of ginsenosides in different parts, such as leaves, roots, and fruits of ginseng, were investigated after a short-term hydroponic system [12]. The total ginsenoside content of the ginseng leaves was found to be significantly higher at 15.30%, while the content of the ginseng roots was at 1.27%. Additionally, the contents of the major ginsenosides components produced in the ginseng leave cultured in the hydroponic system were observed in the order of Rg1 > Rd > Re > Rc > Rb2 > Rg2 >Rb1 > Rh1 > Rf [11]. Konačno, hidroponski uslovi doveli su do visokog sadržaja ginsenozida, a ukupan sadržaj ginsenozida u lišću bio je značajno veći nego u korijenu, što sugerira da bi listovi ginsenga mogli biti dobar izvor funkcionalnog povrća i ljekovitog bilja.

Nekoliko poznatih spojeva za izbjeljivanje, kao što su arbutin i kojična kiselina, ispitano je u pogledu njihove djelotvornosti u smanjenju melanogeneze [13]. Nažalost, neophodno je pronaći sigurnija i efikasnija sredstva za izbjeljivanje kože, zbog kancerogenog potencijala kojične kiseline i sigurnosti i nuspojava arbutina [14]. Pri tome se kontinuirano velika pažnja posvećuje razvoju novih prirodnih proizvoda u kozmetičkoj industriji [15,16]. Nekoliko studija je izvijestilo o inhibiciji sinteze melanina iz P. ginsenga uzgojenog u tlu [17–20].

Međutim, ove studije su prijavljene s dobro poznatim spojevima, kao što su cimetna kiselina i fenolna jedinjenja, a aktivnost izbjeljivanja nije prijavljena na listovima hidroponskog P. ginsenga (HPGL). Naš tekući rad doveo je do izolacije manjih ginsenozida iz HPGL-a. Obično se ginsenozidi u manjim količinama ili u tragovima ne mogu otkriti pomoću HPLC. Inače, analitičko vrijeme je jako dugo, što nije pogodno za kvalifikaciju ginsenozida u začinima ginsenga [21,22]. Da bi se brzo kvantificirala nova jedinjenja, treba uspostaviti brzu i osjetljivu metodu, koja može temeljito otkriti količine novih jedinjenja u tragovima. U ovoj studiji, senzitivna tečna hromatografija ultravisokih performansi u kombinaciji sa kvadrupolnom/vremenskom masenom spektrometrijom (UPLC-QTOF-MS) je uspostavljena za kvantifikaciju novog jedinjenja.

Na osnovu navedenog opisa, u ovom radu je spektroskopskim metodama otkrivena izolacija i identifikacija novog jedinjenja, uključujući fizička svojstva i kvantifikaciju, a njihova antimelanogena aktivnost je ispitana kroz in vitro i in vivo sisteme.

2. Rezultati i diskusija

Listovi hidroponskog Panax ginsenga (HPGL) ekstrahovani su vodenim rastvorom MeOH i podeljeni u etil acetat (EtOAc), n-butanol (n-BuOH) i H2O frakcije. Ponovljene SiO2 i ODS kolonske hromatografije frakcije n-BuOH dale su jedan novi ginsenozid (1), a jedan rijedak ginsenozid (2) je izolovan iz EtOAc frakcije HPGL-a.

Jedinjenje 1, bijeli prah (metanol), pokazao je ljubičastu boju na TLC-u, prskanjem 10 posto H2SO4 i zagrijavanjem. Molekularna formula je određena kao C37H64O10 iz kvazi-molekularnog pika jona m/z 713,44723 [M plus COOH]− u negativnom QTOF/MS. IR spektar ukazuje na prisustvo hidroksilne grupe (3377 cm−1) i dvostruke veze (1647 cm−1). 1H-NMR spektar (tabela 1 i dodatni materijali) pokazao je dva signala protona olefin metina (δH 6.02, 5.64), tri signala oksigeniranih metinskih protona (δH 4.38, 4.03, 3.49), jedan metoksi protonski signal (18H), jedan signal metoksi protona (18H). singlet metil protonski signali (δH 1.94, 1.55, 1.43, 1.33, 1.31, 1.14, 1.04, 0.92), što ukazuje na to da jedinjenje 1 ima tetraciklički triterpenski dio koji uključuje jednu dvostruku vezu s trans konformacijom i tri hidroksilne grupe.

Dodatno, potvrđeno je da je jedinjenje 1 protopanaksatriol (PPT) tipa iz hemijskog pomaka signala metil protona na δH 1,94 (H-28). Hemijski pomak H-28 u protopanaksadiolnom (PPD) tipu se obično opaža na ca δH 1,30 [23]. Nadalje, signal protona hemiacetala (δH 5,15) i nekoliko signala oksigeniranih metina i metilen protona na δH 4,45–3,95 uočeni su kao signali ostatka šećera. Iz konstante spajanja signala anomera protona (J=7.6 Hz), i hemiacetalni proton i H-2 ostatka šećera bili su u aksijalnom rasporedu. Kombinacijom gore navedenih podataka zaključeno je da je spoj 1 protopanaksatriol aminoglikozid. 13C-NMR spektar je pokazao 37 ugljikovih signala zbog triterpena, metoksi i heksoze. Dva olefinska metinska ugljika (δC 138,5 (C-24), 126,8 (C-23)), jedan oksigenirani kvaternarni ugljik (δC 74,9 (C-25)), tri oksigenirana metinska ugljika (δC 78,5 (C-3), 7{{90}}.3 (C-12), 67,7 (C-6)), jedan metoksi ugljenik (δC 50,2 ( 25-OCH3)), i osam metilnih ugljenika (δC 31,9 (C-28), 26,3 (C-27), 26,1 (C-26), 23,0 (C{{ 57}}), 17.6 (C-18), 17.4 (C-19), 17.3 (C-30), 16.4 (C-29)) signali su uočeni za aglikonski deo. NMR podaci za jedinjenje 1 bili su slični onima za jedinjenje 2, osim za hemijski pomak za oksigenirani kvaternarni ugljik, tj. C-25. Dodatno, šećer je identificiran kao -glukopiranoza iz ugljičnih signala hemiacetala (δC 98,3, (C-10)), četiri oksigenirana metina (δC 78,9 (C-30), 78,2 (C{{82) }}), 75,2 (C-20), 71,6 (C-40)) i jedan oksigenirani metilen (δC 63,0 (C-60)). U spektrima gradijentne heteronuklearne korelacije višestrukih veza (gHMBC), uočena je korelacija dugog dometa između anomernog protonskog signala (δH 5,15 (H-10)) i oksigeniranog kvaternarnog ugljičnog signala aglikona (δC 83,0 (C -20)), što ukazuje da je -glukopiranoza povezana sa hidroksilom C-20 (Slika 1).

Osim toga, korelacija između signala metoksi protona (δH 3,18 (25-OCH3)) i oksigeniranog kvaternarnog ugljičnog signala (δc 74,9 (C-25)) ukazuje da je metoksi povezan sa C{{ 7}} (Slika 1). Na osnovu gornjih podataka, utvrđeno je da je hemijska struktura 1 20-O- -D-glukopiranozil-3 ,6 ,12 ,20 -tetrahidroksi-25- metoksidammar{18}}en, i nazvan kao ginsenoside Rh23. Jedinjenje 2 je identifikovano kao 20-O- -D-glukopiranozil-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentahidroksidammar-23-en iz poređenja NMR i MS podaci sa onima navedenim u literaturi [23,24] (Slika 1). Jedinjenja 1 i 2 su po prvi put izolovana iz HPGL.

Utvrđeno je da je čistoća ginsenozida Rh23 veća od 99 procenata normalizacijom površina pikova otkrivenih UPLC analizom. Budući da je UPLC-OTOF/MS dokazano pogodan alat za identifikaciju ginsenozida Rh23, odvajanje sastojaka u HPGL ekstraktu izvedeno je pomoću UPLC-OTOF/MS u načinu rada negativnih jona. Slika 2 prikazuje tipičan totalni ionski hromatogram (TIC) ginsenozida Rh23 i ekstrakta sa detekcijom mase.

Dobivena je linearna kalibraciona kriva za ginsenozid Rh23 pri različitim nivoima koncentracije. Karakteristike kalibracionih dijagrama sumirane su u tabeli 2. Kao što se vidi u tabeli, ginsenozid Rh23 pokazuje odlične koeficijente korelacije. Broj detektora (relativna površina pika) bio je linearno zavisan od koncentracije uzorka u rasponu od 0.02–0.8 µg/mL za ginsenozid Rh23. LOD ginsenozida Rh23 bio je 0.002 ppm. LOQ ginsenozida Rh23 utvrđen je na 0,005 ppm pomoću UPLC-QTOF/MS u načinu rada negativnih jona. Količina ginsenozida Rh23 u HPGL dobijenom metodom validacije (Tabela 2) iznosila je 0,319 mg/g.

Da bi se utvrdilo antimelanogeno djelovanje, proučavana je promjena sadržaja melanina u melan-a stanicama tretiranim pročišćenim i identificiranim spojevima. Melan-a ćelije su tretirane 72 h sa jedinjenjima 1 i 2 u koncentracijama u rasponu od 0 do 80 µM, a vitalnost ćelija je procijenjena pomoću CCK-8 kompleta za analizu vitalnosti ćelija. Vijabilnost ćelija jedinjenja 1 i 2 pri koncentraciji od 80 µM za melan-a ćeliju bila je preko 98,1 procenata i 97,8 procenata, respektivno (podaci nisu prikazani). Ovi rezultati su pokazali da spojevi 1 i 2 imaju necitotoksičnu prirodu. Efekat antimelanogenih aktivnosti jedinjenja prikazan je na slici 3. Inhibicija sinteze melanina jedinjenja 1 pri 20, 40 i 80 µM bila je 8,4 procenata, 15,6 procenata i 37,0 procenata u poređenju sa kontrolom. Jedinjenje 2 pokazalo je nešto nižu inhibitornu aktivnost od jedinjenja 1 na 7,6 procenata, 12,8 procenata i 17,8 procenata na 20, 40 i 80 µM, respektivno. Oba spoja inhibiraju sintezu melanina na način ovisan o dozi.

Značajno je da je jedinjenje 1 pokazalo najveću inhibitornu aktivnost melanina, 37.0 posto pri koncentraciji od 80 µM. Navodno, ekstrakt radix ginsenga pri 0-1000 µg/mL nije pokazao nikakvu značajnu inhibiciju melanina [19], a cimetova kiselina, sredstvo za izbjeljivanje koje se uglavnom nalazi u P. ginsengu, pokazalo je 29 posto inhibiciju sinteze melanina pri 675 µM [20]. U poređenju sa ekstraktom radix ginsenga i cimetnom kiselinom, jedinjenje 1 pokazalo je moćnu inhibitornu aktivnost sinteze melanina, pa čak i 1.2-putu veću inhibitornu aktivnost sinteze melanina pri osam puta nižoj koncentraciji u poređenju sa kumarnom kiselinom [ 17,20].

Zebra je veoma povoljan modelski organizam kralježnjaka zbog sličnih sistema organa i genskih sekvenci kao kod ljudi [25]. Nadalje, sve se više pažnje posvećuje upotrebi embriona zebrice jer se oni smatraju zamjenskom metodom za eksperimente na životinjama [26]. Zebra ribe imaju pigmente melanina na površini, što omogućava jednostavno promatranje procesa pigmentacije bez komplikovanih eksperimentalnih procedura [27].

Stoga smo istraživali efekte spoja 1 na inhibiciju melanina na pigmentaciju zebrice. Koristili smo PTU (N-feniltioureu; inhibitor tirozinaze koji sadrži sumpor) kao pozitivnu kontrolu (slika 4B), koja se široko koristi u istraživanjima zebrica [28,29]. Kao što je prikazano na slici 4C, D, 40 i 80 µM tretman sa jedinjenjem 1 proizveo je izvanrednu inhibiciju pigmentacije tijela zebrice, što je značajno smanjilo ukupan sadržaj melanina u poređenju sa kontrolnim nosačem (Slika 4A).

U ovoj studiji izolovali smo novi ginsenozid Rh23 (1) iz hidroponskih listova P. ginsenga. Do sada je prijavljeno više od 100 ginsenozida iz vrsta ginsenga. Međutim, 25-hidroksilirani ginsenozidi se rijetko javljaju u prirodi, uključujući i biljke ginsenga. Osim toga, aktivnost izbjeljivanja nije prijavljena. Inhibiciona aktivnost ginsenozida Rh23 pokazala je 37 posto pri koncentraciji od 80 uN bez ćelijske citotoksičnosti u melan-a ćelijama, dok ginsenozid Rh23 nije uočavao in vitro aktivnost tirozinaze gljive (podaci nisu prikazani). Nedavno se pokazalo da ekstrakti ili pročišćeni ginsenozidi iz korijena i listova ginsenga široko posjeduju antioksidativna svojstva (30,31), dok voda ili organski ekstrakt ginsenga pokazuju aktivnosti čišćenja prema DPPH, superoksidnom anionu i hidroksil radikalu (32). Stoga, naš novi ginsenozid Rh23 izolovan iz listova hidroponskog ginsenga P. ginsenga može imati smanjenu regulaciju tirozinaze zbog svog antioksidativnog svojstva. Međutim, njegova uloga melanogeneze još nije istražena. Stoga je u daljem istraživanju potrebno utvrditi precizne mehanizme djelovanja ginsenozida Rh23 na regulaciju sinteze melanina.

3. Eksperimentalno

3.1. Generale

Za kolonsku hromatografiju korištene su smole Kieselgel 60 i LiChroprep RP-18 (Merck, Darmstadt, Njemačka). Kieselgel 60 F254 (Merck) i RP-18 F254S (Merck) korišteni su kao čvrste faze za TLC eksperiment. Detekcija mrlja na TLC ploči je obavljena posmatranjem pod UV lampom (Spectroline, model ENF-240 C/F, Spectronics Corp., New York, NY, USA) ili prskanjem 10% vodenog H2SO4 na razvijeni ploča nakon čega slijedi zagrijavanje. Optičke rotacije su mjerene pomoću JASCO P{10}} digitalnog polarimetra (Tokio, Japan). Tačke topljenja su dobijene pomoću Fisher-Johns Melting Point Apparatus (Fisher science company, Pittsburgh, PA, USA) sa mikroskopom. Ultraljubičasti spektri su mjereni na Shimadzu modelu UV-1601 spektrofotometru (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan). IR spektri su dobijeni sa Perkin Elmer Spectrum One FT-IR spektrometra (Buckinghamshire, UK). NMR spektri su snimljeni na spektrometru Varian Inova AS 400 (400 MHz, Varian, Palo Alto, Kalifornija, SAD). UPLC-QTOF/MS analiza je izvedena korištenjem Waters Xevo G2-S serije (Waters Corp., Milford, MA, SAD) koja radi u načinu rada negativnih jona.

3.2. Biljni materijali

Hydroponic Panax ginseng uzgajan je u stakleniku Odsjeka za istraživanje biljnih kultura koje se nalazi u Eumseongu, u provinciji Chungbuk, prema protokolu "vodiča za standardnu ​​kultivaciju ginsenga GAP" [11,33] koji je razvila Administracija za ruralni razvoj, Republika Koreja. Jednogodišnji korijen sadnica ginsenga težine 0.8 do 1 g kupljeni su od Odjela za istraživanje biljnih kultura, Nacionalnog instituta za hortikulturu i biljne nauke (NIHHS), Uprave za ruralni razvoj (RDA) i pohranjeni u komori na niskoj temperaturi (1–2 ◦C) prije upotrebe. Korijeni sadnica ginsenga su presađeni u hranljive kupke i uzgajani u hidroponskom sistemu. Nakon tri mjeseca kulture, hidroponski ginseng je izvučen za berbu. Sakupljene hidroponske biljke ginsenga oprane su vodom i razvrstane u listove i korijene, koje su zatim sušene 72 h u zamrzivaču (FD8512, Ilshin Biobase Co., Yangju, Koreja). Uzorak vaučera (NIHHS14-03) deponovan je u herbarijum Odjela za istraživanje biljnih usjeva, NIHHS, RDA, Eumseong, Republika Koreja.

3.3. Ekstrakcija i izolacija

Osušeni i u prahu listovi hidroponskog P. ginsenga (HPGL, 6 kg) ekstrahovani su sa 80% MeOH (30 L × 3) na sobnoj temperaturi tokom 24 h. Ekstrakti su filtrirani kroz filter papir i upareni pod sniženim pritiskom na 45 ◦C da bi se dobilo 1,4 kg ekstrakta. Ekstrakt je izliven u H2O (3L) i ekstrahovan sa EtOAc (3 L × 3) i n-BuOH (2,6 L × 3), sukcesivno. Svaki sloj je koncentrisan pod sniženim pritiskom da bi se dobile frakcije EtOAc (75 g), n-BuOH (470 g) i H2O (855 g).

Frakcija n-BuOH (HPGLB, 130 g) nanesena je na kolonu silika gela (φ 13 × 17 cm) i eluirana sa CHCl3–MeOH–H2O (8:3:1, 9{{42} } L → 6:4:1, 110 L) da se dobije 20 razlomka (HPGLB1 do HPGLB20). Frakcije HPGLB3 i HPGLB4 su kombinovane (18,9 g, Ve/Vt=0.05–0.12), i dalje frakcionisane preko kolone silika gela (φ 8 × 15 cm, CHCl3–MeOH–H2O=12:3:1, 14 L) da se dobije 14 frakcija (HPGLB3-1 do HPGLB3-14). Frakcije HPGLB3-4 i HPGLB3-5 su kombinovane (1,27 g, Ve/Vt {{40}}.09–0,16), i dalje frakcionisane preko ODS kolone (φ 4 × 7 cm, MeOH–H2O=2:1, 2,6 L) da bi se dobilo devet frakcija (HPGLB3-4-1 do HPGLB3-4-9). Frakcija HPGLB3-4-3 (119,4 mg, Ve/Vt=0.14–0,26) je dalje frakcionisana preko ODS kolone (φ 2,5 × 7 cm, MeOH–H2O=1:1, 1 L) da se dobije devet frakcija (HPGLB3-4-3-1 do HPGLB3-4-3-9) uključujući jedinjenje 1 (HPGLB3-4-3-7, 10,5 mg, Ve/Vt=0.42–0,55, TLC Rf=0.40 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.50 (Kieselgel 60 F254, CHCl3–MeOH–H2O {{90} }:3:1)). Frakcije HPGLB5 do HPGLB7 su kombinovane (24,0 g, Ve/Vt=0.12–0,22), i dalje frakcionisane preko kolone silika gela (φ 7 × 12 cm, CHCl3–MeOH–H2O=10: 3:1, 10 L → 6:4:1, 9 L) da se dobije 16 frakcija (HPGLB5-1 do HPGLB5-16). Frakcija HPGLB5-6 (323,1 mg, Ve/Vt=0.28–0,31) je dalje frakcionisana preko ODS kolone (φ 3 × 14 cm, MeOH–H2O=3:2, 1,2 L → 3:1, 1,5 L) da se dobije deset frakcija (HPGLB5-6-1 do HPGLB5-6-10) uključujući jedinjenje 2 (HPGLB5-6-5, 10,1 mg, Ve/Vt=0 .21–0.23, TLC Rf=0.50 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.45 (Kieselgel 60 F254, CHCl3– MeOH–H2O=7:3:1)).

3.4. Spektroskopski podaci

Jedinjenje 1. Bijeli prah, t.t.: 138–140 ◦C; [ ] 25 D plus 17,4◦ (c=0.39, MeOH); IR (CaF2 prozor): 3377, 2932, 1382 cm−1; negativan QTOF/MS m/z 713,44723 [M plus COOH]− (izračunato za C37H64O10, 668,4499); 1H- i 13C-NMR podaci, pogledajte tabelu 1.

Jedinjenje 2. Bijeli prah, t.t.: 133–136 ◦C; [ ] 25 D plus 20,2◦ (c=0.50, MeOH); IR (CaF2 prozor): 3359, 2929, 1384 cm−1; negativan QTOF/MS m/z 699,48311 [M plus COOH]− (izračunato za C36H62O10, 654,4323); 1H- i 13C-NMR podaci, vidi tabelu 1.

3.5. Kvantitativna analiza novog jedinjenja 1 upotrebom UPLC-QTOF/MS

Standardni osnovni rastvor jedinjenja 1 je pripremljen otapanjem po 1.00 mg u 1 mL metanola da bi se dobila koncentracija od 100 mg/mL i držan na 4 ◦C. Standardna matična otopina (1) je razrijeđena metanolom kako bi se dobile otopine za kalibraciju u rasponu od 0.{{10}}2–0.8 µg/mL, respektivno. Jedan gram HPGL ekstrakta je tačno izvagan i otopljen u fiksnim količinama (10 mL) metanola, filtriran kroz 0.20 mm filter papir i ohlađen na 4 ◦C . UPLC je izveden korišćenjem Waters ACQUITY H-klase UPLC (Waters Corp., Milford, MA, SAD) sa ACQUITY BEH C18 kolonom (2,1 × 100 mm, 1,7 µm). Mobilne faze su se sastojale od vode (A) sa 0,1 posto mravlje kiseline (v/v) i acetonitrila (B) sa 0,1 posto mravlje kiseline (v/v). Gradijent eluiranja bio je sljedeći: 0–4 min, B 10–30 posto; 4–15 min, B 30–60 posto; 15–16 min, B 60–100 posto; 16–19 min, B 100–10 posto . Brzina protoka je bila 0,45 mL/min, a volumen injekcije je bio 2 µL za svaki ciklus.

Zatim je izvršena HR-MS analiza koristeći Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Corp., Milford, MA, SAD) koji radi u načinu rada negativnih jona. Maseni spektrometri su izvodili naizmjenična skeniranja visoke i niske energije poznata kao MSE način akvizicije. Precizna merenja mase su dobijena korišćenjem automatizovanog sistema za isporuku kalibracije koji sadrži leucin enkefalin, m/z 554.262 (ESI neg. mod) kao internu referencu. Optimalni radni parametri postavljeni su kao što je prikazano u tabeli 3.

3.6. Cell Culture

Melan-a melanociti su visoko pigmentirana, besmrtna, normalna mišja melanocitna ćelijska linija izvedena iz C57BL/6 miševa. Ćelije melan-a korištene u ovoj studiji dobijene su od dr. Dorothy Bennett (St. George's Hospital, London, UK). Ćelije su uzgajane na 37 ◦C u atmosferi od 95 posto zraka, 10 posto CO2 u mediju RPMI 1640 dopunjenom do konačne koncentracije sa 10 posto toplinom inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma, 1 posto penicilina/streptomicina i 200 nM PMA. Vijabilnost ćelija je određena CCK-8 kompletom za brojanje ćelija-8 (Dojindo Lab., Kumamoto, Japan).

3.7. Melanin Assay

Melan-a ćelije su tretirane jedinjenjima 72 h, a zatim su ćelije rastvorene u 1 N NaOH na 60 ◦C tokom 30 min. Zatim su lizati izmjereni na 450 nm pomoću spektrofotometra. Podaci su normalizovani na sadržaj proteina u ćelijskim lizatima. Ćelijski lizati su naknadno obrađeni za određivanje koncentracije proteina korišćenjem kompleta za analizu proteina BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, SAD).

3.8. Poreklo i održavanje roditeljskih riba

Odrasle zebrice nabavljene su od komercijalnog distributera, a 10-15 riba držano je u akrilnom rezervoaru od 5 L pod sljedećim uvjetima: 28,5 ◦C, sa ciklusom svjetlo/mrak od 14/10 h. Zebrice su hranjene tri puta dnevno, šest dana u sedmici, hranom u pahuljicama TetraMin dopunjenom živim škampima (Artemia salina). Embrioni su dobijeni prirodnim mriješćenjem koje je indukovano ujutro paljenjem svjetla. Sakupljanje embriona je završeno u roku od 30 minuta. Svi eksperimentalni protokoli i procedure su odobreni i sprovedeni u skladu sa odobrenim smjernicama i propisima Etičkog komiteta za životinje Chungnam National University (CNU-00866).

3.9. Tretman spojevima i procjena na temelju fenotipa

Sinhronizirani embrioni su sakupljeni i poređani pipetom (7-9 embriona po jažici u 24-pločama koje sadrže 1 mL embrionske podloge). Testirana jedinjenja su rastvorena u 0.1 procenat DMSO i zatim dodata u medijum embriona od devet do 72 h nakon oplodnje (hpf) (63 h izloženosti). Pod stereomikroskopom uočeni su efekti na pigmentaciju zebrice. Svakodnevno je vršeno povremeno mešanje, kao i zamena medijuma kako bi se obezbedila ravnomerna raspodela jedinjenja. U svim eksperimentima, 0.2 mM 1-fenil-2-tiourea (PTU) je korišten za stvaranje prozirne zebrice bez miješanja u razvojni proces [33] i smatran je standardnom pozitivnom kontrolom. Procjene pigmentacije tijela zasnovane na fenotipu su dehorionirane pincetom, anestezirano u otopini trikain metansulfonata (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD), montirano u 3 posto metilceluloze na 35 mm tanjiri (SPL Lifesciences, Pocheon, Koreja), i fotografisano pod stereomikroskopom MZ16 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Njemačka).

4. Zaključak

U ovoj studiji, ginsenozid Rh23 (1) je izolovan iz hidrofoničnih listova Panax ginsenga zajedno sa 20-O- -D-glukopiranozilom-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentahidroksidammar{10}}en (2). Općenito smo bili uspješni u našem pokušaju da dobijemo hipopigmentarni efekat spojeva iz hidroponskog P. ginsenga. Ginsenoside Rh23 i 20-O- -D-glukopiranozil-3 ,6 ,12 ,20 ,25-pentahidroksidammar23-en imaju inhibitorne aktivnosti na biosintezu melanina bez citotoksičnih efekata u melan-a ćeliji. Dodatno, ginsenozid Rh23 je poboljšao depigmentaciju zebrice kao alternativni životinjski model. Smanjenje sadržaja melanina i pigmentacije u tijelu mogu imati potencijal za djelovanje izbjeljivanja, a necitotoksični učinak je povoljnija točka jer je sigurnost primarni faktor za izbjeljivanje u kozmetičkim proizvodima.

Stoga, na osnovu naših trenutnih rezultata, važno je da se nova hidrofonska jedinjenja P. ginsenga mogu koristiti kao potencijalno efikasno sredstvo za osvjetljavanje kože. Dalja istraživanja će razjasniti precizne mehanizme djelovanja ginsenozida Rh23 na regulaciju sinteze melanina i odnos između strukturnih karakteristika ginsenozida Rh23 i melanogeneze, kako bi se utvrdilo da li je to potencijalno sredstvo za izbjeljivanje za kozmetičku industriju. Prednosti hibridne Q-TOF masene spektrometrije uključuju ne samo sposobnost detekcije kvaliteta i osjetljivost, već i precizno mjerenje, što olakšava strukturalno razjašnjavanje. Može se koristiti za kvalitativno i kvantitativno određivanje sporednih ili novih spojeva, što pomaže u poboljšanju kontrole kvaliteta začina ginsenga.

Dodatni materijali:

1H-NMR i 13C-NMR spektri 1 dostupni su u Dodatnim materijalima.

Priznanja:

Ovaj rad je obavljen uz podršku "Programa zajedničkog istraživanja za poljoprivrednu nauku i razvoj tehnologije" (PJ01136203), Uprave za ruralni razvoj, Republika Koreja. Zahvaljujemo Cheol-Hee Kim (Chungnam National University) na dijeljenju objekta za zebrice.

Doprinosi autora:

DYL i N.-IB su osmislili i dizajnirali eksperimente; H.-GK i Y.-GL izolovali su jedinjenja; DYL je razjasnio strukture; I.-BJ doprinio pripremi biljnog materijala; JHK je izvršio biološki test i pomogao u pripremi rukopisa; JWL i B.-RC su izvršili NMR i UPLC-QTOF/MS uzoraka; G.-SK je pomogao reviziju rukopisa; i DYL je napisao rad i rukovodio istraživačkim projektom. Svi autori su pročitali i odobrili konačni rukopis.

Sukobi interesa:

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa. Sponzori osnivači nisu imali nikakvu ulogu u dizajnu studije; prikupljanje, analize ili tumačenje podataka; pisanje rukopisa; ili odluku o objavljivanju rezultata.

Reference

1. Ben, EW; Michael, W. Ljekovito bilje svijeta. In Shinilbooks; Timber Press Inc.: Portland, OR, SAD, 2007.

2. Park, JD; Rhee, DK; Lee, YH Biološke aktivnosti i hemija saponina iz Panax ginsenga CA Meyer. Phytochemistry 2005, 4, 159–175. [CrossRef]

3. Kwon, SJ; Chung, DK Efekat jačanja imuniteta od planinskog ginsenga, planinskog ginsenga i Panax ginsenga. J. Orient. Neuropsihijatrija 2004, 15, 89–101.

4. Gillis, CN Panax ginseng farmakologija: Veza sa dušičnim oksidom? Biochem. Pharmacol. 1997, 54, 1–8. [CrossRef]

5. Kang, KS; Yamabe, N.; Kim, HY; Yokozawa, T. Efekat metanolnog ekstrakta ginsenga na oštećenje jetre izazvano lipopolisaharidom kod pacova. Phytomedicine 2007, 14, 840–845. [CrossRef] [PubMed]

6. Jiang, S.; Ren, D.; Li, J.; Yuan, G.; Li, H.; Xu, G.; Han, X.; Du, P.; An, L. Učinci spoja K na hiperglikemiju i inzulinsku rezistenciju kod pacova sa dijabetes melitusom tipa 2. Fioterapia 2014, 95, 58–64. [CrossRef] [PubMed]

7. Kim, HS; Lee, EH; Ko, SR; Choi, KJ; Park, JH; Im, DS Efekti ginsenozida Rg3 i Rh2 na proliferaciju ćelija raka prostate. Arch. Pharm. Res. 2004, 27, 429–435. [CrossRef] [PubMed]

8. Nocerino, E.; Amato, M.; Izzo, AA Afrodizijačka i adaptogena svojstva ginsenga. Fitoterapia 2000, 71, S1–S5. [CrossRef]

9. Keum, YS; Park, KK; Lee, JM; Chun, KS; Park, JH; Lee, SK; Kwon, HJ; Surh, YJ Antioksidativno i antitumorsko djelovanje metanolnog ekstrakta termički obrađenog ginsenga. Cancer Lett. 2000, 150, 41–48. [CrossRef]

10. Kim, GS; Lee, SE; Ne, HJ; Kwon, H.; Lee, SW; Kim, SY; Kim, YB Efekti prirodnih bioaktivnih proizvoda na rast i sadržaj ginsenozida Panax ginsenga uzgajanog u aeroponskom sistemu. J. Ginseng Res. 2012, 36, 430–441. [CrossRef] [PubMed]

11. Choi, SY; Cho, CW; Lee, YM; Kim, SS; Lee, SH; Kim, KT Poređenje sadržaja ginsenozida i fenolnih sastojaka u listovima, plodovima i korijenima ginsenga uzgojenog u hidroponi. J. Ginseng Res. 2012, 36, 425–429. [CrossRef] [PubMed]

12. Matsuda, H.; Nakamura, S.; Kubo, M. Studije lijekova za zanoktice iz prirodnih izvora. II. Inhibicijski efekti biljaka Prunus na biosintezu melanina. Biol. Pharm. Bik. 1994, 17, 1417–1420. [CrossRef] [PubMed]

13. Duncan, CL; Foster, EM Utjecaj natrijum nitrita, natrijum hlorida i natrijum nitrata na klijanje i izrastanje anaerobnih spora. Appl. Microbiol. 1968, 16, 406–411. [PubMed]

14. Shimizu, K.; Yasutake, S.; Kondo, R. Novi stilbene s inhibitornom aktivnošću tirozinaze iz Chlorophora se ističe. Chem. Pharm. Bik. 2003, 51, 318–319. [CrossRef] [PubMed]

15. Park, SH; Kim, DS; Kim, WG; Ryoo, IJ; Lee, DH; Huh, CH; Youn, SW; Yoo, ID; Park, KC Terrin: Novi inhibitor melanogeneze i njegov mehanizam. Cell. Mol. Život 2004, 61, 2878–2885. [CrossRef] [PubMed]

16. Kong, YH; Jo, YO; Cho, CW; Sin, DW; Park, SJ; Rho, JH; Choi, SY Inhibicijski efekti cimetne kiseline na biosintezu melanina u koži. Biol. Pharm. Bik. 2008, 31, 946–948. [CrossRef] [PubMed]

17. Hwang, EY; Choi, SY Kvantitativna analiza fenolnih spojeva u različitim dijelovima Panax ginsenga CA Meyer i njegov inhibitorni učinak na biosintezu melanina. Korean J. Med. Crop Sci. 2006, 14, 148–152.

18. Im, SJ; Kim, KN; Yun, YG; Lee, JC; Mun, YJ; Kim, JH; Woo, WH Utjecaj radix ginsenga i radix trichosanthis na melanogenezu. Biol. Pharm. Bik. 2003, 26, 849–853. [CrossRef] [PubMed]

19. Hwang, EY; Kong, YH; Lee, YC; Kim, YC; Yoo, KM; Jo, YO Poređenje sadržaja fenolnih spojeva između bijelog i crvenog ginsenga i njihovog inhibitornog djelovanja na biosintezu melanina. J. Ginseng Res. 2006, 30, 82–87.

20. Zhang, YC; Pi, ZF; Liu, CM; Song, FR; Liu, ZQ; Liu, SY Analiza niskopolarnih ginsenozida u parenom Panax ginsengu na visokoj temperaturi pomoću HPLC-ESI-MS/MS. Chem. Res. Brada. Univ. 2012, 28, 31–36.

21. Xie, YY; Luo, D.; Cheng, YJ; Ma, JF; Wang, YM; Liang, QL; Luo, GA Hemijske transformacije izazvane parom i holistička procena kvaliteta crvenog ginsenga dobijenog od Panax ginsenga korišćenjem višekomponentnog otiska prsta za kvantifikaciju zasnovanog na HPLC-ESI-MS/MSn. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 8213–8224. [CrossRef] [PubMed]

22. Liu, GY; Li, XW; Wang, NB; Zhou, HY; Wei, W.; Gui, MY; Yang, B.; Jin, YR Tri nova triterpenska saponina tipa dammarana iz listova Panax ginseng CA Meyer. J. Asian Nat. Prod. Res. 2010, 12, 865–873. [CrossRef] [PubMed]

23. Xing, Q.; Liang, T.; Shen, G.; Wang, X.; Jin, Y.; Liang, X. Sveobuhvatni HILIC x RPLC sa detekcijom masene spektrometrije za analizu saponina u Panax notoginseng. Analyst 2012, 137, 2239–2249. [CrossRef] [PubMed]

24. Love, DR; Pichler, FB; Dodd, A.; Copp, BR; Greenwood, DR Tehnologija za ekran visoke propusnosti: sadašnjost i budućnost pomoću zebrice. Curr. Opin. Biotechnol. 2004, 15, 564–571. [CrossRef] [PubMed]

25. Uwe, S.; Stefan, S.; Pobert, G.; Petra, G.; Henner, H.; Sepand, R.; Axel, S.; Ingrid, S.; Carsten, W.; Hilda, W.; et al. Embrioni zebrice kao alternativa eksperimentima na životinjama – Komentar definicije početka zaštićenog životnog stadija u propisima o dobrobiti životinja. Reprod. Toxicol. 2012, 33, 128–132.

26. Chio, TY; Kim, JH; Ko, DH; Kim, CH; Hwang, JS; Ahn, S.; Kim, SY; Kim, CD; Lee, JH; Yoo, TJ Zebrafish kao novi model za skrining melanogenih regulatornih jedinjenja zasnovan na fenotipu. Pigment Cell Res. 2007, 20, 120–127. [CrossRef] [PubMed]

27. Elsalini, OA; Rohr, KB Phenylthiourea remeti funkciju štitne žlijezde u razvoju zebrice. Dev. Genes Evol. 2003, 212, 593–598. [PubMed]

28. Lee, DY; Cha, BJ; Lee, YS; Kim, GS; Ne, HJ; Kim, SY; Kang, HC; Kim, JH; Baek, NI Potencijal manjih ginsenozida izolovanih iz listova Panax ginsenga kao inhibitora melanogeneze. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 1677–1690. [CrossRef] [PubMed]

29. Li, J.; Huang, M.; Teoh, H.; Čovječe, RY Panax quinquefolium saponini štite lipoproteine ​​niske gustine od oksidacije. Life Sci. 1999, 64, 53–62. [CrossRef]

30. Li, TSC; Mazza, G.; Cottrell, AC; Gao, L. Ginsenosides u korijenu i lišću američkog ginsenga. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 717–720. [CrossRef]

31. Jung, CH; Seog, HM; Choi, IW; Park, MW; Cho, HY Antioksidativna svojstva različitih ekstrakata rastvarača iz listova divljeg ginsenga. LWT 2006, 39, 266–274. [CrossRef]

32. Nacionalni institut za nauku o usjevima. Ginseng GAP standardna smjernica za uzgoj; Nacionalni institut za nauku o usjevima, Uprava za ruralni razvoj: Suwon, Koreja, 2009.

33. Karlsson, J.; Von Hofsten, J.; Olsson, PE Generisanje transparentne zebrice: Rafinirana metoda za poboljšanje detekcije ekspresije gena tokom embrionalnog razvoja. Mar. Biotechnol. 2001, 3, 522–527. [CrossRef] [PubMed]

Dostupnost uzorka:

Uzorci jedinjenja 1 i 2 dostupni su od autora.

Dae Young Lee 1 ID , Hyoung-Geun Kim 2 , Yeong-Geun Lee 2 , Jin Hee Kim 3 , Jae Won Lee 1 ID , Bo-Ram Choi 1 , In-Bae Jang 1 , Geum-Soog Kim 1 i Nam-In Baek 2,*

1 Odeljenje za istraživanje biljnih kultura, Nacionalni institut za hortikulturu i biljne nauke, RDA, Eumseong 27709, Koreja; dylee0809@gmail.com (DYL); jaewon3@gmail.com (JWL); bmcbr@korea.kr (B.-RC); ikanet@korea.kr (I.-BJ); kimgs0725@korea.kr (G.-SK)

2 Odsjek za biotehnologiju orijentalne medicine, Univerzitet Kyung Hee, Yongin 17104, Koreja; zwang05@naver.com (H.-GK); lyg629@nate.com (Y.-GL)

3 College of Herbal Bio-industry, Daegu Haany University, Gyeongsan 38610, Korea; gonogo1@nate.com

Primljeno: 28. novembra 2017.; Prihvaćeno: 26. januara 2018.; Objavljeno: 29. januara 2018

For more information:1950477648nn@gmail.com