Suplementacija gvožđa odgađa starenje i produžava ćelijski životni vek kroz potenciranje mitohondrijske funkcije

Ključne riječi:željezo;hronološko starenje; produženje životnog vijeka ćelija; mitohondrije; AMPK; Saccharomyces cerevisiae

Kliknite ovdje da biste dobili informacije o Cistanche for Anti-Aging

1. Uvod

Thestarenje stanovništvadramatično raste širom svijeta [1–3]. Starenjeje najveći faktor rizika za nekoliko kroničnih bolesti uključujući rak, neurodegeneraciju, bolesti srca, dijabetes, kognitivna oštećenja i pad imunološkog sistema [4–8]. Postupno smanjenje metaboličkih funkcija povećava osjetljivost na starosne patologije kod starije populacije, što utječe na zdravlje do kraja života. Nedavna istraživanja na različitim organizmima, od jednoćelijskog kvasca do sistema životinjskih modela, pokazala su da se mehanizmi starenja čuvaju i kontroliraju pomoću visoko međusobno povezane i funkcionalno redundantne mreže interakcije gena i proteina u ćelijskom metabolizmu [9–11]. Kvasac koji pupiSaccharomyces cerevisiaeje moćan model organizma za proučavanje biologije starenja jer su mnogi njegovi ćelijski procesi sačuvani kod ljudi. Kvasac ima kratak životni vijek i podložan je probiru visoke propusnosti u različitim uvjetima okoline [9–12]. Kvasac se intenzivno koristi za proučavanje replikacijskog i hronološkog starenja ljudi analizom njegovog replikativnog životnog vijeka (RLS) i hronološkog životnog vijeka (CLS) [13–15]. RLS analizira koliko puta se matična ćelija dijeli kako bi formirala kćeri, što je replikativni model ljudskog starenja za mitotičke ćelije kao što su matične ćelije. CLS je vremensko trajanje u kojem je ćelija koja se ne dijeli u stacionarnoj fazi, hronološki model ljudskog starenja za postmitotske ćelije kao što su neuroni. Tekući napori u istraživanju biologije starenja pokazali su da je odlaganje starenja izvodljivo moduliranjem bioloških procesa starenja [11,16]. Trenutno, najperspektivnije intervencije protiv starenja su rapamicin i metformin [11,16]. Rapamicin inhibira visoko očuvan metabolički regulator protein kinaze rapamicinskog kompleksa 1 (TORC1). Metformin povećava aktivnost protein kinaze aktivirane adenozin monofosfatom (AMPK). TORC1 potiče ćelijske anaboličke procese kao što je sinteza proteina, nukleotida i lipida [17,18]. S druge strane, TORC1 inhibira katabolički proces, uključujući oksidativnu fosforilaciju i autofagiju. Međutim, AMPK ima suprotne metaboličke funkcije jer potencira kataboličke procese i inhibira anaboličke procese [19]. U uslovima ograničenim nutrijentima, AMPK se aktivira i inhibira TORC1. Rezultirajući metabolički odgovor povećava proizvodnju ćelijske energije indukcijom kataboličkih procesa koji se usklađuju sa smanjenjem iskorištenja ATP-a u anaboličkim procesima [19–21]. Rapamicin i metformin su u kliničkim ispitivanjima za njihovu upotrebu kao terapeutika protiv starenja [16,22]. Gvožđe je važan nutrijent i neophodan za gotovo sve organizme, uključujući i ljude [23–26]. Ima ključnu ulogu u ćelijskom metabolizmu i djeluje kao kofaktor za nekoliko enzimskih reakcija. Budući da je ćelijski metabolizam glavna determinanta starenja, a željezo je ključno za nekoliko različitih metaboličkih funkcija, istražili smo učinak dodatka željeza na starenje. Ispitivali smo efekat dodatka gvožđa na CLS kvasca. Otkrili smo da suplementacija gvožđa odgađa starenje i produžava životni vek ćelija. Nadalje smo otkrili da je mehanizam protiv starenja suplementacije gvožđem kroz poboljšanje mitohondrijalnih funkcija. Otkrili smo da suplementacija željezom poboljšava mitohondrijalne funkcije i spašava kratki životni vijek mutanta AMPK.

2. Materijali i metode

2.1. Sojevi kvasca i brisanje gena

PrototrofniSaccharomyces cerevisiaeCEN.PK soj divljeg tipa korišten je u svim eksperimentima kako bi se izbjegli efekti auksotrofije aminokiselina na rast i preživljavanje stanica [27,28]. Soj nokaut gena generiran je PCR-posredovanom homolognom rekombinacijom pri čemu je cijeli lokus zamijenjen pojačanim selekcijskim markerom koji sadrži uzvodne i nizvodne bočne sekvence ciljnog gena [29]. PCR je potvrdio stabilnu integraciju amplificiranog selekcionog markera.2.2. Srednji sastav i hemikalijeBogati medij YPD sadržavao je 1 posto ekstrakta kvasca, 2 posto peptona i 2 posto glukoze, YPD agar (2,5 posto Bacto agar), a SD medij je sadržavao 6,7 g/L dušične baze kvasca s amonijum sulfatom bez aminokiselina (Difco) i 2 posto glukoze. FeSO4.7H2O, FeCl3, CaSO4.2H2O, MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, MgCl2.6H2O, i BPS su kupljeni od Sigme, a njihov osnovni rastvor pripremljen je u vodi. Antimicin A (Sigma, St. Louis, MO, SAD), DiOC6(3) (3,30 -Diheksiloksakarbocijanin jodid) (Invitrogen™, Waltham, MA, SAD) i MitoTracker™ Deep Red (Invitrogen™) rastvor pripremljen je u dimetil sulfoksidu (Sigma). Konačna koncentracija DMSO nije prelazila 1 posto ni u jednom testu.

2.3. Uslovi rasta kvasca

Sojevi divljeg tipa i delecijski sojevi su izvučeni iz zamrznutih zaliha glicerola na YPDagar podloga na 30◦C. Ćelije kvasca su uzgajane u SD mediju preko noći na 30◦C satrese pri 220 o/min. Ćelijske kulture uzgajane preko noći razrijeđene su do OD600nm~0,2 u svježem SD mediju da se započne test rasta u pločici ili tikvici sa ili bez njih.hemikalije i inkubirane na 30◦C. Rast ćelija (OD600nm) mjeren je na različitimvremenske tačke pomoću čitača mikroploče ili spektrofotometra.

2.4. Analiza hronološkog starenja

Kronološko starenje je određeno mjerenjem hronološkog životnog vijeka (CLS) stanica kvasca, kao što je ranije objavljeno uz male modifikacije [30,31]. CLS eksperiment je izveden na ploči sa {{0}}jažicom. Kultura ćelija preko noći je razrijeđena do OD600nm~0,2 u svježem SD mediju i prebačena u ploču s 96-jažicom koja sadrži različite koncentracije hemikalija i inkubirana na 30◦C. Ćelije su uzgajane do stacionarne faze koja se smatrala prvim danom (100 posto preživljavanja ćelija) za CLS analizu. Opstanak ćelija kvasca je kvantifikovan u različitim starosnim vremenskim tačkama testom rasta. Hronološki stare ćelije (3µL) u različitim starosnim vremenskim tačkama prebačeni su na drugu 96-ploču sa jažicom. YPD srednji (200µL) je dodan u 96-ploču i inkubiran 24 h na 30◦C. Izrastanje ćelija je izmereno apsorbancijom (OD600nm) korišćenjem čitača mikroploče. Preživljavanje ćelija za različite starosne tačke je kvantificirano u odnosu na 1. dan (smatra se 100 posto preživljavanja ćelija) koristeći formulu za izračunavanje: postotak preživljavanja=[Izrastanje OD600nm (starosna tačka)/Izrastanje OD600nm (1.dan)]× 100 2.5. Test otpornosti na oksidacijuĆelije kvasca su uzgajane do stacionarne faze (72 h) u SD mediju. Nakon toga, ćelije su isprane i razrijeđene do OD600nm~0,2 u YPD mediju sa različitim koncentracijama H2O2 i narasla sa 30◦C. Otpornost na oksidativni stres je analizirana poređenjem rasta ćelija H2O2-tretiranih ćelija sa netretiranom kontrolom.

2.6. Ekstrakcija RNK, sinteza cDNK i kvantitativno

PCR u realnom vremenuUkupna RNK je ekstrahovana iz ćelija korišćenjem RNeasy mini kita (Qiagen, Hilden, Nemačka) prema protokolu proizvođača mehaničkog prekida. Koncentracija i kvalitet RNK određivani su spektrofotometrom (NanoDrop 2000 Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Tipično, 1µg ukupna RNK je reverzno transkribovana u cDNK pomoću QuantiTect kompleta za reverznu transkripciju (Qiagen). Tokom sinteze cDNK, također su izvedene dvije negativne kontrole uključujući bez reverzne transkriptaze i RNA šablona. Sav RT-PCR izveden je u konačnom volumenu od 20µL koji sadrži 20 ng cDNK pomoću SYBR Fast Universal qPCR kompleta (Kapa Biosystems, Boston, MA, SAD) i analiziran korištenjem Quant Studio 6 Flex sistema (Applied Biosystems, Waltham, MA, SAD). RT-PCR uslov je bio jedno zadržavanje na {95◦C, 180 s}, nakon čega slijedi 40 ciklusa od {95◦C, 1 s} i {60◦C, 20 s} koraka. Nakon amplifikacije, napravljena je kriva topljenja kako bi se potvrdila PCR specifičnost i odsustvo dimera prajmera. Kvantitativna zastupljenost svakog gena određena je u odnosu na ACT1 transkript domaćinstva. Relativna ekspresija gena između kontrolnog i tretiranog stanja izračunata je pomoću 2−∆∆Ctmetoda [32]. Spisak prajmera koji se koriste za RT-PCR dat je u Dodatnoj tabeli S1.

2.7. Analiza potencijala i strukture mitohondrijske membrane

Kulture kvasca su isprane sa 1× PBS (fiziološka otopina puferirana fosfatom) i inkubiranasa DiOC6(3) (100 nM) 30 minuta u mraku. Nakon inkubacije, ćelije su isprane iresuspendirano u 1× PBS. Očitavanje fluorescencije (ekscitacija na 482 nm, emisija na 504 nm)uzoraka je izmjereno čitačem mikropločica. Intenzitet fluorescencije svakog od njihuzorak je normalizovan sa OD600nm. Za analizu mitohondrijalne strukture korištene su ćelijeoprano sa 1× PBS i inkubiran sa MitoTracker tamno crvenim (100 nM) 30 minuta umračno. Uzorci su vizualizirani FL fluorescentnim mikroskopom na 100× uvećanjea slike su obrađene softverom ImageJ.

2.8. ATP analiza

150 µL 5 posto trihloroctene kiseline, i lizirano staklenim perlama na Precellys® 24 homogenizator(Bertin Technologies, Montiny Le Bretonne, Francuska). Nivo ATP-a je mjeren pomoću kompleta reagensa Enliten luciferin/luciferaze (Promega, Madison, WI, SAD) u luminometru(Biotek, Winusky, VT, SAD). Koncentracija proteina je procijenjena Bradfordovim reagensom(Bio-rad, Hercules, Kalifornija, SAD). Nivo ATP-a u uzorcima je normalizovan na ukupni proteinkoncentracija.

2.9. Statistička analiza

3. Rezultati

3.1. Suplementacija gvožđa produžava ćelijski životni vek kvasca

Istraživali smo učinak željezo(II) sulfata (FeSO4) suplementacija o hronološkom životnom vijeku (CLS) kvasca u 96-ploči sa bunarima. Prvo, ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama FeSO4 u sintetički definisanoj (SD) podlozi, a rast je analiziran u različitim vremenskim tačkama (16 h, 24 h i 48 h). Rast ćelija dostigao je zasićenje otprilike 24 h nakon inkubacije sa FeSO4 koncentracije (dodatna slika S1a,b). Zatim smo odredili CLS ćelija inkubiranih sa različitim koncentracijama FeSO4. Smatrali smo 48 h stacionarnu fazu ćelijske kulture kao dan 1 za CLS analizu. Vijabilnost ostarjelih ćelija u različitim tačkama je normalizirana sa 1. danom (100 posto održiva) i ucrtana na grafikon preživljavanja. Otkrili smo da različite koncentracije FeSO4 dodatak u mediju produžio je CLS kvasca (Slike1a i S1c). Također smo testirali željezo(III) hlorid (FeCl3) i pronašao sličan rezultat kao i FeSO4 (brojke1b i S2a). Da razjasnimo da li je FeSO4 i FeCl3 soli, njihove komponente Gvožđe(II) i Gvožđe(III), odnosno sulfat i hlorid proširuju CLS, ispitivali smo ostale soli koje sadrže sulfate i hloride. Ćelije kvasca su inkubirane sa CaSO4, MgSO4, CaCl2, iMgCl2 uključujući FeSO4, i FeCl3 u SD mediju. Rast ćelija inkubiranih sa različitim solima dostigao je zasićenje nakon 24 h (dodatna slika S2b). Zatim smo izmjerili preživljavanje i otkrili da osim FeSO4 i FeCl3, druge soli koje sadrže sulfate ili kloride nisu produžile životni vijek kvasca (slika1c). Ovi rezultati su otkrili da željezo, ali ne sulfat i hlorid, produžavaju CLS kvasca. Za dalju validaciju, iscrpili smo željezo i analizirali CLS kvasca. Bathophe nantrolindisulfonska kiselina (BPS) je specifično jedinjenje kelatora željeza koje sekvestrira željezo i dovodi do nedostatka željeza u stanicama [33]. Ćelije kvasca su inkubirane sa gvožđem i različitim koncentracijama BPS u SD medijumu. Rast ćelija različitih koncentracija dostigao je zasićenje nakon 24 h (dodatna slika S2c). Dalje smo izmjerili preživljavanje stanica i otkrili da dodatak BPS-a smanjuje životni vijek stanica obogaćenih željezom (Slika1d). Sve u svemu, ovi rezultati su potvrdili da suplementacija gvožđa produžava životni vek kvasca.

Slika 1.Dodatak gvožđu produžava hronološki životni vek kvasca. Prototrofni soj kvasca je inkubiran u različitim hemijskim uslovima u sintetički definisanom (SD) mediju i uzgajan u {{0}}pločama na 30 ◦C. Ćelije uzgojene u stacionarnu fazu uzete su u obzir za Dan 1 (100 posto preživljavanja ćelija) za analizu hronološkog životnog vijeka (CLS). Preživljavanje ćelija je kvantifikovano u različitim starosnim vremenskim tačkama testom rasta. (a) CLS ćelija dopunjenih različitim koncentracijama FeSO4. (b) CLS ćelija dopunjenih različitim koncentracijama FeSO4 i FeCl3. (c) CLS ćelija sa dodatkom 100 µM FeSO4, FeCl3, CaSO4, MgSO4, CaCl2 i MgCl2. (d) CLS ćelija sa dodatkom 100 µM FeSO4 u prisustvu različitih koncentracija BPS. Statistička značajnost (* p < 0,05) određena je Studentovim t-testom.