Ispitivanje toksičnosti ifosfamida izaziva uobičajeni uzvodni regulator u jetri i bubrezima

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Hyoung-Yun Han, et al

sažetak:

Ifosfamid je alkilirajući agens, sintetički analog ciklofosfamida, koji se koristi za liječenje različitih čvrstih karcinoma. U ovoj studiji, toksičnost ifosfamida je procijenjena primjenom jedne i više doza intraperitonealne primjene kod pacova prema smjernicama dobre laboratorijske prakse, a praćen je dodatnim mikromrežnim eksperimentom kako bi se podržali toksikološki nalazi. Jedna doza ifosfamida (50 mg/kg) nije izazvala nikakve patološke promjene. U međuvremenu, opažena je teška renalna toksičnost u grupama koje su uzastopno davane 7 i 28 dana, sa značajnim povećanjem nivoa azota uree i kreatinina u krvi. U analizi tox-liste, geni povezani sa sintezom holesterola najviše su zahvaćeni u jetri, a geni povezani sa zatajenjem bubrega su pogođeni ububregnakon primjene ifosfamida. Štaviše, regulatorni faktor 7 interferona odabran je kao glavni uzvodni regulator koji se promijenio u obajetraibubreg, i otkriveno je da stupa u interakciju sa drugim ciljnim genima, kao što je ubikvitin specifična peptidaza 18, radikalni S-adenozil metionin domen koji sadrži 2 i interferonom stimulisani gen 15, što je dalje potvrđeno RT-PCR analizom u realnom vremenu. U zaključku, ponovo je potvrđena toksičnost ifosfamida na organe na bubrege i identificirani identično promijenjeni geni u obajetraibubreg. Potrebne su daljnje sveobuhvatne toksikogenomske studije kako bi se otkrio tačan odnos između gena izazvanih ifosfamidom i toksičnosti organa.

Ključne riječi:ifosfamid; hepatotoksičnost; nefrotoksičnost; intraperitonealna toksičnost

Cistanche je dobar za jetru i bubrege

1. Uvod

Ifosfamid je alkilirajući agens, sintetički analog ciklofosfamida, koji se koristi za liječenje različitih čvrstih karcinoma, uključujući sarkome i limfome. Ifosfamid je nespecifični lijek protiv raka u ćelijskom ciklusu koji ometa replikaciju DNK i proizvodnju RNK [1]. Iako se ifosfamid relativno dobro podnosi u usporedbi s drugim toksičnim alkilirajućim agensima, poznato je da je povezan s brojnim životno opasnim štetnim efektima koji ograničavaju njegovu kliničku upotrebu [2]. Glavne nuspojave ifosfamida uključuju tešku ozljedu bubrega koja je rezultat reaktivnih toksičnih vrsta iz ifosfamida, uključujući akutnebubreg povreda, intersticijski nefritis, hemoragični cistitis i Fanconijev sindrom [3]. U klinikama je prijavljena teška višeorganska toksičnost kod pacijenata koji su iskusili ranu renalnu toksičnost i ponovljeno zatajenje jednog organa uzrokovano visokim dozama ifosfamida što je dovelo do naknadnog zatajenja organa [4,5].

Toksični metabolit ifosfamida, akroleina i kloroacetaldehida, glavni je odgovorni faktor za toksičnost ifosfamida na organe. Prethodne studije su se uglavnom fokusirale na faktore koji utiču na konverziju ifosfamida u toksične metabolite, posebno citokrom P450 (CYP) [6]. Relativno obilje CYP3A4 i CYP3A5 u bubrezima dovodi do toksičnih promjena u ifosfamidu i izaziva nefrotoksičnost [7]. Akrolein je visoko reaktivni aldehid koji može aktivirati intracelularni reaktivni oksidativni put gena i oštetiti ćelijske organele. Kloroacetaldehid je prijavio supresiju aktivacije kompleksa I u mitohondrijskom respiratornom lancu što bi moglo dovesti do iscrpljivanja intracelularnog glutationa (GSH) i smrti ćelije [8].

Toksikološka studija više organa je korisnija u razumijevanju sistemskih efekata lijekova nego ciljanje specifičnih organa za studije toksičnosti. Jetra i bubrezi su glavni organi koji učestvuju u metabolizmu i izlučivanju lijekova, a ovi glavni organi su predisponirani na neželjene reakcije na lijekove; često slijedi toksičnost organa. Štaviše, integrativna toksikološka evaluacija može predstaviti različite patološke nalaze koji mogu pomoći u razumijevanju i predviđanju toksičnosti uzrokovane lijekovima u sistemu.

Mnoge studije su koristile profile ekspresije gena za predviđanje potencijalnih negativnih efekata hemikalija. Međutim, većina ranijih studija fokusirala se na procjenu toksičnosti jednog ciljanog organa, sa samo ograničenim patološkim simptomima [9]. Štaviše, u kombinaciji sa profilisanjem gena zasnovanim na mikromrežu, to će proizvesti sveobuhvatno razumevanje toksičnosti na nivou sistema koje može sprečiti potencijalnu toksičnost vezanu za lek [10]. U tom smislu, integrativni višeorganski toksikološki pristupi sa profilisanjem ekspresije gena korišćeni su u studijama modela predviđanja toksičnosti kako bi se prevazišli podaci o toksičnosti dobijeni procenom toksičnosti jednog organa, što je nedovoljno za razumevanje toksičnih mehanizama lekova u sistemu [11].

U ovoj studiji opisujemo toksičnost ifosfamida ububregijetranakon akutnog i ponovljenog izlaganja kod Sprague-Dawley (SD) pacova. Provedeni su testovi profiliranja ekspresije potpornog gena kako bi se otkrio zajednički ciljni gen koji je izmijenjen ifosfamidom u jetri ibubreg, što sugerira uvid u integrativnu toksičnost ifosfamida.

2. Rezultati

2.1. Studija toksičnosti pojedinačne doze

Nije uočena toksičnost u grupama ifosfamida od 12,5, 25 i 50 mg/kg—ne smrt, simptomi toksičnosti, promjene tjelesne težine ili histopatološki nalazi.

U međuvremenu, u hematološkoj studiji, relativni broj retikulocita (RET) i apsolutni broj neutrofila (NEUA) i limfocita (LYMA) smanjio se na način ovisan o dozi.

2.2. Jednonedeljna studija toksičnosti ponovljenih doza

Ukupna tjelesna težina se smanjila nakon 1 sedmice primjene ifosfamida, a srednje vrijednosti gubitka tjelesne težine u grupi od 100 mg/kg bile su veće od onih u grupi sa 75 mg/kg (Tabela 1). U međuvremenu, relativna težina organa se postepeno povećavala u grupama liječenim ifosfamidom (Tabela 2).

Jedna sedmica uzastopne IP primjene ifosfamida potisnula je hematološki indeks, uključujući RBC, HGB, HCT, MCV i PLT, na način ovisan o dozi (Tabela 3). Štaviše, BUN i CREA su porasli 1,2 puta u kontrolnoj grupi u poređenju sa grupom koja je primala ifosfamid (Tabela 4).Bubregpovredadodatno je potkrijepljena histopatološkom studijom.

Nisu uočeni histopatološki znaci u jetri miševa u grupama ifosfamida od 75 i 100 mg/kg (Slika 1A). U međuvremenu, thebubreziiz grupa ifosfamida od 75 i 100 mg/kg nađeno je da imaju minimalan do blagi stupanj patoloških promjena, uključujući tubulnu degeneraciju/dilataciju (1 umjerena u grupi od 100 mg/kg), nekrozu jedne ćelije, hiperplaziju urotela i fokalno krvarenje /zagušenje (tabela 5). Osim toga, uočeno je evidentno povećanje ekspresije KIM-1 u području bubrežnih tubula ububreggrupe od 100 mg/kg (Slika 1B).

2.3. Četverosedmična studija toksičnosti ponovljenih doza

Smrtnost je uočena u grupama koje su primale 50 (5/10) i 70 (10/10) mg/kg nakon 21 i 10 dana uzastopne primjene, respektivno. Štaviše, smanjena tjelesna težina sa povećanom relativnom težinom organa,jetra, ibubreg, u svim grupama liječenim ifosfamidom, podržava toksičnost ponovljene doze 4-nedjelje.

Preživjelim ispitanicima urađene su hematološke i biohemijske analize seruma. Nekoliko parametara krvi, uključujući RET, RBC, MONA, EOSA i LUCA, značajno su smanjeni nakon 4 sedmice primjene ifosfamida.

U poređenju sa kontrolnom grupom, biohemijske analize su pokazale statističke razlike nakon 4 nedelje primene ifosfamida. Na primjer, nivoi AST i CK su značajno povećani, a omjer A/G, GLU i GGT su smanjeni (p < 0.01)="" u="" grupi="" tretiranoj="" 50="" mg/kg,="" u="" poređenju="" sa="" kontrolnom.="">

2.4. Analiza ekspresije gena izazvana ifosfamidom

DEG-ovi izazvani ifosfamidom su identificirani u jetri ibubregtkiva (tabela 6). Za jetru, različito eksprimirani geni uključivali su 2672 gena pri dozi od 100 mg/kg TM/dan, 1283 gena su bila povećana, a 1389 gena je smanjena. U bubrezima, 401 gen je bio različito eksprimiran pri 100 mg/kg TM/dan – 149 gena je bilo pojačano, a 252 gena smanjeno. I u jetri i u bubrezima, broj gena smanjene regulacije bio je veći od broja gena koji su regulirani naviše. To bi moglo sugerirati da liječenje ifosfamidom inhibira ekspresiju gena.

Rezultati analize biološke funkcije su navedeni u Tabeli 7. Utvrđeno je da 1-sedmična primjena ifosfamida mijenja gene povezane s razvojem organa, uglavnom u jetri. Ububreg, potvrđeno je da su najviše pogođeni geni koji se odnose na lokalizaciju imunoloških stanica.

U kanonskoj analizi puta DEG-a, promjene u sintezi holesterola i genima vezanim za put prezentacije antigena su evidentne ujetraibubregtkiva (slika 2). Štaviše, LXE/RXR i signalizacija odgovora akutne faze bili su uobičajeni kanonski put reguliran odozgo ujetraibubreg, koji su bili uključeni u homeostazu lipida i signalizaciju upalnih citokina, respektivno.

U analizi jetrene toksikološke liste, najviše su pogođeni geni povezani sa sintezom holesterola, zatim pozitivni proteini odgovora akutne faze i panel akutnog zatajenja bubrega (Tabela 8). Nadalje, rezultati liste bubrega otkrili su da su geni povezani s bubrežnom insuficijencijom općenito pod utjecajem ifosfamida, uključujući reverzibilne biomarkere glomerulonefritisa i panel akutnog zatajenja bubrega.

Na osnovu IPA baze znanja, uobičajeni uzvodni regulator reguliše ekspresiju gena u jetri i bubrezima nakon tretmana ifosfamidom (Slika 3). IRF7 je bio glavni regulator koji se mijenjao i u jetri i u bubrezima i otkriveno je da stupa u interakciju s drugim ciljnim genima kao što su USP18, RSAD2 i ISG15. Nadalje, RT-PCR analiza u realnom vremenu potvrdila je ekspresiju IRF7, USP18, RSAD2 i ISG15. Iako je obim promjena u svakom genu bio različit između jetre i bubrega, ekspresija je potisnuta u tkivima jetre i bubrega nakon 1 sedmice primjene ifosfamida. RSAD2 i USP18 su uglavnom izmijenili gene liječenjem ifosfamidom u jetri, odnosno bubrezima.

3. Diskusija

U ovoj studiji, istražena je sveobuhvatna toksičnost ifosfamida na više organa s različitim dozama i terminima izloženosti IP putem kod pacova prema GLP standardu. U klinikama, ifosfamid može ispoljiti bimodalno antitumorsko djelovanje sa citotoksičnim i imunomodulatornim efektima u kombinaciji s adoptivnom imunoterapijom [12]. Poznato je da se ifosfamid uglavnom eliminira putem bubrega i oko 80 posto doze je u nepromijenjenom obliku, nefrotoksičnost je opšte poznata nuspojava ifosfamida, a metaboliti kao što su kloroacetaldehid i akrolein su odgovorni za njegovu kliničku upotrebu [13, 14].

U ovoj studiji, 1-sedmična ponovljena studija toksičnosti bila je pogodna za istraživanje toksičnosti organa izvedene iz ifosfamida. Jedna sedmica primjene ifosfamida potisnula je krvni indeks na način ovisan o dozi, što bi moglo odražavati tipičnu mijelosupresiju izvedenu iz ifosfamida. Uz nefrotoksičnost, nekoliko izvještaja je pokazalo da je mijelosupresija jedna od glavnih toksičnosti ifosfamida koja ograničava dozu, a leukopenija je općenito teža od trombocitopenije [15,16]. Nefrotoksičnost ifosfamida može dovesti do Fanconijevog sindroma, kod kojeg dolazi do oštećenja funkcije proksimalnih tubula što rezultira ireverzibilnim oštećenjem, a toksični metabolit akrolein izaziva urotoksičnost kod hemoragičnog cistitisa [17]. Ovo je u skladu sa rezultatima ove studije. U histopatološkoj studiji, bubrezi i jetra su pregledani kako bi se istražile patološke promjene uzrokovane ifosfamidom. I u grupama koje su primale ifosfamid od 75 i 100 mg/kg, otkrivena su velika područja tubularne degeneracije i dilatacije sa hiperplazijom urotela u području bubrežne karlice. Nadalje, ekspresija KIM-1, molekula oštećenja proksimalnog tubula bubrega, podržava prisustvo nefrotoksičnosti povezane s ifosfamidom. U međuvremenu, u jetri je uočena samo minimalna periportalna vakuolacija. Štaviše, iako su se vrijednosti AST i ALT smanjile na način ovisan o dozi, promjene su bile unutar referentnog raspona [18]. Dublje razloge za smanjenje nivoa jetrenih enzima trebat će dalje proučavati. Općenito je prihvaćeno da je ifosfamid alkilirajući agens koji je rijetko povezan s hepatotoksičnošću, a samo je nekoliko slučajeva zabilježeno da izaziva ozljedu jetre, posebno kada se kombinira s drugim kemoterapijskim lijekovima kao što je doksorubicin [19].

Nedavno je primetan napredak u podacima o ekspresiji gena u toksikologiji sa tehnologijama visoke propusnosti doveo do stvaranja dovoljno velikih skupova podataka u studijama toksičnosti, a učinjeni su mnogi pokušaji da se profil gena primeni na predviđanje hemijske toksičnosti [10,20]. U ovoj studiji je provedena analiza mikromreža kako bi se analizirao odgovor transkriptoma izazvan primjenom ifosfamida, a kao ciljni gen odabrani su DEG-ovi sa promjenom više od ili jednakim 1,5, a korišteni su biološka funkcija, kanonski put i analiza Tox liste. razumjeti funkciju gena izazvanih ifosfamidom. Urađena je dodatna analiza uzvodnog regulatora kako bi se procijenila mogućnost multiorganske toksičnosti u jetri i bubrezima.

U ovoj studiji odabrani su DEG-ovi promijenjeni 15-put, a smanjeni geni su bili nešto dominantniji od gena sa povećanom regulacijom u jetri (52 posto) i bubrezima (62 posto). Rezultati analize bioloških funkcija pokazali su da ifosfamid mijenja gene, s biološkim funkcijama koje se odnose na razvoj tkiva koje se obično opažaju i u jetri i u bubrezima.

Prethodna studija Snoubera et al. [21] je otkriveno da tretman ifosfamidom smanjuje Nrf-2 posredovane puteve oksidativnog odgovora na stres u mikrofluidnoj kulturi [21]. U skladu s prethodnim studijama, NRF2-posredovani put odgovora na oksidativni stres bio je značajno moduliran od strane vrhunskih mreža, što je potvrđeno i sadašnjim kanonskim putem i analizom tox liste. Sadašnji izmijenjeni Nrf-2 putevi oksidativnog odgovora na stres mogu biti usko povezani sa toksičnim metabolitom ifosfamida. Višestruki toksični metaboliti ifosfamida mogu reagirati s GSH, snažnim antioksidansom, stvarajući konjugate na različitim mjestima duž puta, a smanjenje razine GSH rezultira povećanom toksičnošću, što ukazuje na implikaciju oksidativnog stresa na toksičnost ifosfamida na organe [8,22 ]. U tom smislu, mesna i N-acetilcistein su korišteni za ublažavanje toksičnosti ifosfamida na organe. Mesna služi kao regionalni detoksifikator tako što se vezuje za toksični metabolit ifosfamida, uglavnom protiv akroleina, kroz Michaelov dodatak da bi se formirala manje štetna supstanca [23]. Osim toga, navodi se da N-acetilcistein ima antioksidativnu aktivnost i poboljšava gubitak GSH u uslovima oksidativnog stresa [24]. Potrebne su daljnje studije kako bi se razjasnio tačan odnos između antidota ifosfamida i puta reguliranog u nefrotoksičnim uvjetima. Možemo nagađati da bi poboljšanje toksičnosti ifosfamida pomoću mesna ili N-acetilcisteina moglo biti praćeno poboljšanim putevima oksidativnog odgovora na stres posredovani Nrf-2-.

U ovoj studiji, signali povezani sa upalom su obično bili pojačani i u jetri i u bubrezima, što se može prepoznati signalizacijom akutne faze u analizi kanonskog puta. Ovaj rezultat je ukazao na implikaciju upalne reakcije u patofiziologiji toksičnosti organa ifosfamida u oba tkiva, što je dodatno potkrijepljeno analizom uzvodnog regulatora. U analizi uzvodnog regulatora, geni povezani sa signalom IRF7 i interferonom (IFN), uključujući USP18, RSAD2 i ISG15, odabrani su kao uobičajeni uzvodni regulatori u jetri i bubrezima. IRF7 je limfoidno-specifičan faktor, koji je konstitutivno eksprimiran u citoplazmi imunoloških stanica, a također može biti induciran interferonom tipa I, virusnom infekcijom i vanjskim stimulansima u različitim stanicama [25]. Prethodna studija je objavila kontroverzna pro- ili antionkogena svojstva IRF7 u različitim tumorskim ćelijama, a promene u ekspresiji IRF7 bile su povezane sa oštećenjem DNK [26-28].

Pored njegove važne regulatorne uloge u IFN-u tipa I za antivirusne funkcije, za IRF7 je objavljeno da suzbija upalne odgovore putem TLR4 signalnog puta [29]. Štaviše, Stout-Delgado et al. [30] su izvijestili da starenje izazvano oksidativnim povećanjem smanjuje aktivnost IRF7, dok smanjenje stresa antioksidativnim agensima poboljšava aktivnost IRF7. U ovoj studiji, primjena ifosfamida potisnula je ekspresiju uzvodnih regulatora, a obrasci ekspresije su bili identični i u jetri i u bubrezima. Sadašnje promjene u ekspresiji IRF7 mogle bi se odnositi na inflamatornu reakciju i svojstvo ifosfamida citotoksičnog alkilirajućeg agensa, što bi moglo sugerirati IRF7 kao obećavajuću metu za toksičnost organa ifosfamida.

U ovoj studiji pronašli smo gen koji je bio identično inhibiran i u jetri i u bubrezima nakon primjene ifosfamida, ali je interpretacija njegovog toksikološkog značaja bila fokusirana samo na bubreg, što ograničava trenutno otkriće. Štaviše, daljnje potvrdne studije vezane za učinak komercijalno dostupnog antidota ifosfamida na trenutno izmijenjeni gen mogu podržati sadašnje nalaze.

U zaključku, ponovljena studija toksičnosti (1 tjedan) primjene ifosfamida je pokazala pristranu nefrotoksičnost, a ne hepatotoksičnost. Pored toga, sadašnji rezultati pružaju dokaze o hepatotoksičnosti i mehanizmu nefrotoksičnosti izazvane ifosfamidom koji uključuje inhibiciju IRF-7. Potrebne su daljnje toksikogenomske studije organa povezanih s imunitetom da bi se razjasnio sistemski toksikološki mehanizam ifosfamida i da bi se podržala veza između toksičnosti gena i organa.

4. Materijali i metode

4.1. Studija o životinjama

Osmonedeljni pacovi Sprague-Dawley (SD) bez patogena specifičnih za mužjake (n=140) su dobijeni od Orient Bio Inc. (Seongnam, Koreja). Životinje su pregledane i aklimatizovane na laboratorijske uslove životne sredine nedelju dana pre eksperimenta. Sve životinje su smještene u plastične kaveze u kontroliranim laboratorijskim uvjetima (temperatura, 23 ± 3 ◦C; vlažnost, 55 ± 10 posto; i 12/{10}} h ciklus svjetlo/mrak) sa laboratorijskom hranom i vodom ad libitum. Studiju na životinjama odobrio je Institucionalni komitet za njegu i upotrebu životinja Korejskog instituta za toksikologiju (Daejeon, Koreja), a sve procedure su obavljene u skladu sa Smjernicama za testiranje za procjenu sigurnosti lijekova Korejske uprave za hranu i lijekove. Studija na životinjama bila je podijeljena u tri dijela: studija toksičnosti uzastopne primjene pojedinačne doze (akutna) i ponovljene doze (1 tjedan i 4 tjedna). Četrdeset pacova je nasumično raspoređeno u četiri grupe (kontrolna, t1,t2 i t3) koristeći Path/Tox sistem (verzija. 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, SAD) u svakoj studiji toksičnosti.

4.2. Eksperiment o toksičnosti

Studija toksičnosti podijeljena je u tri dijela: studije toksičnosti pojedinačne doze (akutne) i dvije ponovljene doze (uzastopna doza od 1 tjedna ili 4 tjedna). Za svaku studiju toksičnosti, štakori su nasumično raspoređeni u adekvatne grupe (kontrola, doza 1, doza 2 i doza 3 za jednosedmične i 4-sedmične studije toksičnosti; kontrolna, doza 1 i doza 2 za 1- sedmična studija toksičnosti) korišćenjem sistema Path/Tox (verzija 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, SAD). U studiji toksičnosti, ifosfamid je davan intraperitonealnim (IP) putem, a kontrolna grupa je primala destilovanu vodu (DW). Doza ifosfamida korištena u studiji toksičnosti bila je sljedeća: studija akutne toksičnosti (12,5, 25 i 50 mg/kg), 1-nedjeljna studija toksičnosti (75 i 100 mg/kg t.t./dan) i {{19 }}sedmična studija toksičnosti (25, 50 i 70 mg/kg TM/dan). Opći klinički simptomi, tjelesna težina i smrtnost životinja bilježeni su svakodnevno tokom primjene, a sve životinje su žrtvovane 24 h nakon posljednje primjene ifosfamida. Uzorci krvi su sakupljeni i stavljeni u mikrocentrifužne epruvete i EDTA-K2 epruvete za biohemiju seruma i hematološku analizu. Tkivo jetre i bubrega fiksirano je u formaldehidu i podvrgnuto histopatološkoj analizi. Dodatna imunohistohemija, analiza mikromreža i RT-PCR u realnom vremenu obavljeni su na tkivima jetre i bubrega iz studije subakutne toksičnosti (100 mg/kg TM/dan).

4.3. Hematološka i biohemijska analiza seruma

Standardni hematološki testovi su obavljeni pomoću ADVIA 120 hematološkog sistema (Bayer, Fernwald, Njemačka). Korišteni su sljedeći pokazatelji: broj bijelih krvnih zrnaca (WBC), broj crvenih krvnih zrnaca (RBC), hematokrit (HCT), koncentracija hemoglobina, srednji korpuskularni volumen (MCV), srednji korpuskularni hemoglobin (MCH), broj trombocita (PLT), broj limfocita (LYM), monocita (MON), neutrofila (NEU), bazofila (BAS), eozinofila (EOS) i velikih neobojenih ćelija (LUC) i retikulocita (RET).

Biohemijski test je izveden pomoću automatskog analizatora (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Tokio, Japan) sa centrifugiranim serumom. Glavni biohemijski indikatori bili su alanin aminotransferaza (ALT), aspartat aminotransferaza (AST), alkalna fosfataza (ALP), azot u urinu (BUN), kreatinin (CREA), glukoza (GLU), ukupni holesterol (TCHO), odnos albumin/globulin (A/G), trigliceridi (TG), ukupni bilirubin (TB), gama-glutamil transferaza (GGT), fosfolipidi (PL), kalcijum, hlorid, neorganski natrijum, fosfor i kalijum.

4.4. Histopatološki i imunohistohemijski pregled

Tkiva ugrađena u parafin su isječena na 5-µm debljine, obojena hematoksilinom i eozinom (H&E) i pregledana mikroskopski.

Tkivo bubrega je podvrgnuto imunohistohemiji. Deparafinizirani i isprani dijelovi su prethodno inkubirani sa 10 posto kozjeg seruma kako bi se blokiralo nespecifično bojenje. Stakalca su zatim inkubirana preko noći sa primarnim anti-KIM1 antitelom (1:750; Santa Cruz, Kalifornija, SAD). Nakon uklanjanja primarnih antitela, preseci su obrađeni VECTASTAIN Elite ABC HRP kompletom (Vector Laboratories, Peterborough, UK), a KIM1 ekspresija je ispitana pod svetlosnim mikroskopom.

4.5. Microarray Analysis i Protein-Protein Interaction (PPI) analiza

Jetra i bubrezi iz grupe 1-sedmica (100 mg/kg) su homogenizirani, a ukupna RNK je ekstrahirana RNase mini kitom (Qiagen). Sinteza cDNK je postignuta korišćenjem kompleta za sintezu cDNA (Affymetrix, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) i podvrgnuta mikromrežnim i PPI analizama.

Analiza mikromreža je izvršena korištenjem Affymetrix GeneChip Rat {{0}}.0 sa GeneChip skenerom 3000 (Affymetrix Santa Clara, CA, USA) i rezultati su obrađeni korišćenjem softvera za analizu GeneSpring GX v13.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Diferencijalno izraženi geni (DEG), koji su se promijenili više od 15-puta nakon primjene ifosfamida, odabrani su korištenjem jednosmjerne analize varijanse (ANOVA) sa Tukeyjevim post hoc testom. Biološke funkcije i kanonski putevi odabranih DEG-ova analizirani su korištenjem softvera Ingenuity Pathway Analysis (IPA, ver. 9.0; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, SAD), a izvršena je analiza uzvodnog regulatora kako bi se identificirali uzvodni regulatori koji bi mogli biti odgovoran za DEG-ove koji nastaju zbog toksičnosti ifosfamida. Mrežna analiza DEG-ova dodatne protein-protein interakcije (PPI) izvedena je korištenjem softvera STRING (verzija 10), a interakcija je potvrđena kada je srednji skor pouzdanosti bio veći od 0,4. Interakcija proteina je približna vjerovatnoća da postoji predviđena veza između dva proteina u Kjoto Enciklopediji gena i genoma.

4.6. Kvantitativna RT-PCR studija u realnom vremenu

Ekspresija uobičajenih regulatornih gena u studiji mikromreža potvrđena je pomoću kvantitativne RT-PCR u realnom vremenu. Gene-specifični prajmeri su dobijeni od Bioneer-a (Daejeon, Koreja). Prajmerske sekvence su bile sljedeće: regulatorni faktor interferona 7 (IRF7): naprijed, 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 i obrnuto, 5-CACAAGGTCCACTAGAGATG-3; ubikvitin specifična peptidaza 18 (USP18): naprijed, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3 i obrnuto 5-GAACTGATTACCTCCCACTG-3; radikalni S-adenozil metionin domen koji sadrži 2(RSAD2): naprijed, 5-ACCAATCATCAGAGGTTGAC-3 i obrnuto, 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3; interferonom stimulisani gen 15 (ISG15): naprijed, 5-AAGTCTCCCAAGACCAATTC-3i obrnuto, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.

Ukupna RNK je reverzno transkribirana na cDNK korištenjem SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, CA, USA) i oligo-dT prajmera, prema uputama proizvođača. Nivoi ekspresije mRNA uzvodnih regulatorno povezanih gena analizirani su korištenjem StepOnePlus PCR sistema u realnom vremenu (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornija, SAD) sa anSYBR Green master mixom (Applied Biosystems), prema protokolu proizvođača. 18S ribosomalni RNA prajmer je korišćen kao interna kontrola, a rezultati su izraženi kao promena u nagibu u odnosu na normalnu kontrolnu grupu.

4.7. Statistička analiza

Podaci su statistički analizirani korištenjem višestrukih metoda poređenja. Kada Bartletov test nije pokazao značajna odstupanja od homogenosti varijanse, korištena je analiza varijanse (ANOVA) da se utvrdi da li se bilo koja od srednjih vrijednosti grupe razlikuje na nivou značajnosti p < {{0}}.05.="" dodatno,="" dunnettov="" test="" je="" korišten="" za="" određivanje="" razlika="" u="" podacima="" između="" kontrolne="" i="" tretirane="" grupe="" kada="" je="" utvrđeno="" da="" su="" podaci="" značajni="" iz="" anova="" testa.="" nadalje,="" kada="" su="" uočena="" značajna="" odstupanja="" od="" homogenosti="" varijanse="" iz="" bartlettovog="" testa,="" proveden="" je="" neparametarski="" test="" poređenja,="" kruskal–wallis="" (h)test,="" kako="" bi="" se="" utvrdilo="" da="" li="" se="" bilo="" koja="" od="" srednjih="" vrijednosti="" grupe="" razlikuje="" na="" p="">< 0,05.="" kada="" je="" uočena="" značajna="" razlika="" u="" kruskal-wallis="" (h)="" testu,="" dunn's="" rank="" subtest="" je="" sproveden="" da="" se="" kvantifikuju="" specifični="" parovi="" grupnih="" podataka="" koji="" su="" se="" značajno="" razlikovali="" od="" srednje="" vrednosti.="" fisherov="" egzaktni="" test="" je="" proveden="" kako="" bi="" se="" uporedili="" parovi="" podataka="" (uključujući="" prevalenciju="" i="" postotak).="" nivo="" vjerovatnoće="" je="" postavljen="" na="" 1="" ili="" 5="" posto.="" statističke="" analize="" su="" obavljene="" poređenjem="" podataka="" iz="" različitih="" tretiranih="" grupa="" sa="" onima="" iz="" kontrolne="" grupe="" koristeći="" path/tox="" (verzija="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="">

Izjava o dostupnosti podataka:

Podaci su sadržani u članku ili dodatnim materijalima.

Sukobi interesa:

Autori izjavljuju da nemaju suprotstavljene interese.

Reference

1. Palmerini, E.; Setola, E.; Grignani, G.; D'Ambrosio, L.; Comandone, A.; Righi, A.; Longhi, A.; Cesari, M.; Paioli, A.; Hakim, R.; et al. Visoka doza ifosfamida kod pacijenata sa relapsom i neresektabilnim osteosarkomom visokog stepena: retrospektivna serija. Ćelije 2020, 9, 2389. [CrossRef]
2. Klastersky, J. Nuspojave ifosfamida. Oncology 2003, 65, 7–10. [CrossRef]
3. Sprangers, B.; Lapman, S. Bolovi rasta ifosfamida. Clin. Kidney J. 2020, 13, 500–503. [CrossRef]
4. Elias, AD; Ayash, LJ; Wheeler, C.; Schwartz, G.; Tepler, I.; McCauley, M.; Mazanet, R.; Schnipper, L.; Frei, E., 3.; Antman, KH Visoka doza ifosfamida/karboplatina/etopozida sa autolognom podrškom za hematopoetske matične ćelije: sigurnost i budući pravci. Semin. Oncol. 1994, 21, 83–85. [PubMed]
5. Mollenkopf, A.; Du Bois, A.; Meerpohl, HG Sekvencijalni tok i prospektivno zbrinjavanje višeorganske toksičnosti izazvane ifosfamidom. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996, 56, 525–528. [CrossRef]
6. Aleksa, K.; Matsell, D.; Krausz, K.; Gelboin, H.; Ito, S.; Koren, G. Citokrom P450 3A i 2B6 u bubregu u razvoju: Implikacije za nefrotoksičnost ifosfamida. Pediatr. Nefrol. 2005, 20, 872–885. [CrossRef] [PubMed]
7. Lowenberg, D.; Thorn, CF; Desta, Z.; Flockhart, DA; Altman, RB; Klein, TE PharmGKB sažetak: Ifosfamidni putevi, farmakokinetika i farmakodinamika. Pharmacogenet. Genom. 2014, 24, 133. [CrossRef] [PubMed]
8. MacAllister, SL; Martin-Brisac, N.; Lau, V.; Yang, K.; O'Brien, PJ Akrolein i kloroacetaldehid: Ispitivanje ćelijskih i bezćelijskih biomarkera toksičnosti. Chem. Biol. Interakcija. 2013, 202, 259–266. [CrossRef]
9. Kim, J.; Shin, M. Integrativni model predviđanja toksičnosti izazvane više organa lijekovima koristeći podatke o ekspresiji gena. BMC Bioinform. 2014, 15, S2. [CrossRef]
10. Alexander-Dann, B.; Pruteanu, LL; Oerton, E.; Sharma, N.; Berindan-Neagoe, I.; Módos, D.; Bender, A. Razvoj u toksikonomici: Razumijevanje i predviđanje toksičnosti izazvane jedinjenjem iz podataka o ekspresiji gena. Mol. Omics 2018, 14, 218–236. [CrossRef]
11. An, YR; Kim, JY; Kim, YS Izgradnja prediktivnog modela za procjenu toksičnosti više organa. Mol. Cell Toxicol. 2016, 12, 1–6. [CrossRef]
12. Binotto, G.; Trentin, L.; Semenzato, G. Ifosfamid i ciklofosfamid: Učinci na imunološki nadzor. Oncology 2003, 65, 17–20. [CrossRef]
13. Schwerdt, G.; Gorđani, N.; Benešić, A.; Freudinger, R.; Wollny, B.; Kirchhoff, A.; Gekle, M. Kloroacetaldehid- i akrolein indukovana smrt ćelija proksimalnih tubula ljudi. Pediatr. Nefrol. 2006, 21, 60–67. [CrossRef]
14. Ensergueix, G.; Palet, N.; Joly, D.; Levi, C.; Chauvet, S.; Trivin, C.; Augusto, JF; Boudet, R.; Aboudagga, H.; Touchard, G.; et al. Nefrotoksičnost ifosfamida kod odraslih pacijenata. Clin. Kidney J. 2020, 13, 660–665. [CrossRef]
15. Dechant, KL; Brogden, RN; Pilkington, T.; Faulds, D. Ifosfamide/mesna. Pregled njegove antineoplastične aktivnosti, farmakokinetičkih svojstava i terapijske efikasnosti kod raka. Drugs 1991, 42, 428–467. [CrossRef]
16. Pronk, LC; Schrijvers, D.; Schellens, JHM; De Bruijn, EA; Planting, A.; Locci-Tonelli, D.; Groult, V.; Verweij, J.; Van Oosterom, AT Studija I faze o docetakselu i ifosfamidu kod pacijenata sa uznapredovalim solidnim tumorima. Br. J. Cancer. 1998, 77, 153–158. [CrossRef] [PubMed]
17. Skinner, R. Hronična nefrotoksičnost ifosfamida kod djece. Med. Pediatr Oncol. 2003, 41, 190–197. [CrossRef]
18. Sharp, P.; Vilano, JS Laboratorijski štakor; CRC Press: Boca Raton, FL, SAD, 2012.
19. Cheung, MC; Jones, RL; Judson, I. Akutna toksičnost jetre s ifosfamidom u liječenju sarkoma: prikaz slučaja. J. Med. Case Rep. 2011, 5, 180. [CrossRef]
20. Cui, Y.; Paules, RS Upotreba transkriptomike u razumijevanju mehanizama toksičnosti izazvane lijekovima. Pharmacogenomics 2010, 11, 573–585. [CrossRef]
21. Snouber, LC; Jacques, S.; Monge, M.; Legallais, C.; Leclerc, E. Transkriptomska analiza efekta ifosfamida na MDCK ćelije kultivisane u mikrofluidnim biočipovima. Genomics 2012, 100, 27–34. [CrossRef] [PubMed]
22. Dirven, HA; Megens, L.; Oudshoorn, MJ; Dingemanse, MA; van Ommen, B.; Van Bladeren, PJ Konjugacija glutationa citostatskog lijeka ifosfamida i uloga ljudskih glutation S-transferaza. Chem. Res. Toxicol. 1995, 8, 979–986. [CrossRef]
23. Jeelani, R.; Jahanbakhsh, S.; Kohan-Ghadr, HR; Thakur, M.; Khan, S.; Aldhaheri, SR; Yang, Z.; Andreana, P.; Morris, R.; Abu-Soud, HM Mesna (2-merkaptoetan natrijum sulfonat) funkcioniše kao regulator mijeloperoksidaze. Slobodni Radic. Biol. Med. 2017, 110, 54–62. [CrossRef]

24. Alnahdi, A.; John, A.; Raza, H. N-acetil cistein ublažava oksidativni stres i redoks neravnotežu zavisnu od glutationa uzrokovanu tretmanom visoke glukoze/visoke palmitinske kiseline u Rin-5F ćelijama pankreasa. PLOS ONE 2019, 14, e0226696. [CrossRef]

25. Zhang, L.; Pagano, JS IRF-7, novi regulatorni faktor interferona povezan sa latencijom Epstein-Barr virusa. Mol. Cell Biol. 1997, 17, 5748–5757. [CrossRef]
26. Pagano, JS Virusi i limfomi. N. Engl. J. Med. 2002, 347, 78–79. [CrossRef]
27. Romieu-Mourez, R.; Solis, M.; Nardin, A.; Goubau, D.; Baron-Bodo, V.; Lin, R.; Massie, B.; Salcedo, M.; Hiscott, J. Različite uloge regulatornog faktora IFN (IRF)-3 i IRF-7 u aktivaciji antitumorskih svojstava ljudskih makrofaga. Cancer Res. 2006, 66, 10576–10585. [CrossRef]
28. Ning, S.; Pagano, JS; Barber, GN IRF7: Aktivacija, regulacija, modifikacija i funkcija. Genes Immun. 2011, 12, 399–414. [CrossRef]
29. Chen, PG; Guan, YJ; Zha, GM; Jiao, XQ; Zhu, HS; Zhang, CY; Wang, YY; Li, HP Swine IRF3/IRF7 ublažava upalne odgovore putem TLR4 signalnog puta. Oncotarget 2017, 8, 61958. [CrossRef]
30. Stout-Delgado, HW; Yang, X.; Walker, WE; Tesar, BM; Goldstein, DR Starenje narušava regulaciju IFN regulatornog faktora 7 u plazmacitoidnim dendritskim ćelijama tokom aktivacije TLR9. J. Immunol. Res. 2008, 181, 6747–6756. [CrossRef]