Urođeni imunološki odgovor na post i ponovno hranjenje u bubrezima zebrice

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Zongzhen Liao, Dihang Lin, Jirong Jia, Ran Cai, Yang Yu i Wensheng Li *

Državna ključna laboratorija za biokontrolu, Ključna laboratorija za vodene ekonomske životinje provincije Guangdong, Centar za istraživanje inženjerske tehnologije provincije Guangdong za zdrav uzgoj važnih ekonomskih riba, Škola prirodnih nauka, Univerzitet Sun Yat-Sen, Guangdžou 510275, Kina;

liaozzh@mail2.sysu.edu.cn (ZL); lindihang2018@sibcb.ac.cn (DL); jiajr3@mail.sysu.edu.cn (JJ); Alan6382@163.com (RC); yuyang65@mail2.sysu.edu.cn (YY)

* Dopisivanje: lsslws@mail.sysu.edu.cn

Cistanche je vrlo dobar za funkciju bubrega

Abstract: Životinje dobivaju hranjive tvari i energiju kroz hranjenje kako bi postigle ravnotežu između rasta i zdravlja organizma. Kada dođe do promjene u sticanju nutrijenata, stanje rasta se mijenja i može uzrokovati promjene u unutrašnjem imunološkom sistemu. Kompenzacijski rast (CG), specifičan fenomen rasta, uključuje pitanje da li promjene u rastu mogu biti praćene promjenama urođenog imuniteta. Zebra (Danio rerio), dobro poznati modelni organizam ribe, može poslužiti kao odgovarajući model. U ovoj studiji, zebra je bila podvrgnuta 3 sedmice gladovanja i ponovnog hranjenja u periodu od 3 do 7 dana. Utvrđeno je da se CG može postići kod zebrice. Osjetljivost zebrice na Streptococcus agalactiae se povećala nakon gladovanja. Osim toga, broj melanomakrofagnih centara se povećao nakon gladovanja, a udio ozlijeđenih tubula se povećao nakon ponovnog hranjenja 3 i 5 dana, respektivno. Nadalje, thebubrezizebrice koje su patile od gladovanja bile su pod oksidativnim stresom, a aktivnost nekoliko antioksidativnih enzima povećana je nakon gladovanja, uključujući katalazu, glutation peroksidazu i superoksid dismutazu. Gladovanje je utjecalo na parametre urođenog imuniteta. Dodatno, aktivnost alkalne fosfataze i lizozima se povećala nakon gladovanja. Ekspresija mRNA gena povezanih s imunitetom kao što je il-1 bila je povišena u različitoj mjeri nakon gladovanja sa ili bez izazivanja lipopolisaharida (LPS). Ova studija je pokazala da na funkciju urođenog imunološkog sistema u zebrice može uticati status uhranjenosti.

Ključne riječi: urođeni imuni sistem; bubreg; oksidativni stres; kompenzacijski rast; zebra

1. Uvod

Osnovne životne aktivnosti zavise od snabdijevanja organizma energijom. Stanje hranljivih sastojaka životinjskog tela može uticati na funkcionisanje imunog sistema [1,2]. Kompenzacijski rast (CG) je period brzog rasta nakon faze suzbijanja rasta, što može biti uzrokovano nedostatkom hrane i drugim faktorima okoline [3,4]. Ovaj fenomen je prvi put zabilježen kod sisara, a na kraju je pronađen kod ptica [3] i teleosta [5]. CG je podijeljen u dvije faze: kataboličku fazu i hiperanaboličku fazu [6]. Jedan od osnovnih obrazaca CG je post i ponovno hranjenje. Nakon ponovnog hranjenja, ribe mogu doživjeti djelomičnu, potpunu, prekomjernu ili nikakvu kompenzaciju [4]. Poseban režim ishrane CG smatra se potencijalnim načinom za poboljšanje efikasnosti proizvodnje kod uzgojenih vrsta [7].

Urođeni imuni odgovor je prva granica odbrane domaćina, štiteći organizme od patogena. Kod riba, organi imunog sistema uključuju timus,glavabubreg, kaudalni bubreg, škrge, jetra,i crijeva [8,9]. Širok spektar tipova ćelija učestvuje u nespecifičnim ćelijskim odbrambenim odgovorima u ribama, uključujući monocite/makrofage, nespecifične citotoksične ćelije i granulocite (neutrofile). Imunometabolizam je interakcija između imunoloških i metaboličkih procesa [10]. Metabolički status riba može uticati na njihovu imunološku funkciju. Kod ljudi, stanje ishrane utiče na broj imunih ćelija i njihovu aktivnost [11]. Utvrđeno je da na funkciju imunog sistema kod miševa može uticati njihovo metaboličko stanje [12–14]. Intermitentno gladovanje kod karasa (Carassius auratus) promijenilo je crijevne bakterijske zajednice i povećalo aktivnost superoksid dismutaze (SOD) i lizozima [15]. Gladovanje također mijenja ekspresiju gena urođenih imunoloških odgovora u jetri lososa [16]. Osim toga, studije o efektima metaboličkog stanja na imuni sistem mogu se naći i kod drugih teleosta [17–19]. Međutim, uticaj metaboličkog stanja na imuni sistem kod teleosta je još uvek slabo shvaćen. Oksidativni stres može ograničiti funkcionalnost urođenog imunog sistema i inducirati komponente kao što su receptori slični naplati [20,21]. U međuvremenu, gladovanje može povećati proizvodnju ROS i uzrokovati autofagiju [22,23]. Bilo bi vrijedno istražiti da li oksidativni stres posreduje u odnosu između gladovanja i imuniteta.

Zebrafish (Danio rerio) područje široko primijenjen model u proučavanju imuniteta i bolesti. Urođeni imuni sistem zebrice počinje da se razvija prvog dana embriogeneze, a adaptivni imuni sistem je odsutan do 4-6 nedelja nakon oplodnje. Ovo čini zebricu odličnim modelom za proučavanje urođenog imunološkog sistema [9]. Bubreg je primarni limfoidni organ kod zebrice [24]. Havcr1 gen kodira transmembranski tubularni protein tzvmolekula oštećenja bubrega-1 (KIM-1) [25]. KIM-1 je indikator oštećenja tkiva u bubregu, a prekomjerna ekspresija KIM-1 uzrokuje ozljedu bubrega kod zebrice [26]. Utvrđeno je da gladovanje može promijeniti metaboličko stanje kod zebrica [27]. Post je doveo do smanjene potrošnje kiseonika i sadržaja lipida i glikogena u jetri. Također je povećao aktivnost 8-oksidacije i glukoneogeneze u jetri. U međuvremenu, reaktivne kisikove vrste (ROS) su učestvovale u CG kod zebrice [28]. ROS, proizvedeni u jetri, bili su neophodni za CG kod zebrica jer su inducirali AMPK put. U ovoj studiji usvojili smo strategiju posta i ponovnog hranjenja kako bismo istražili obrazac CG kod zebrica. Streptococcus agalactiae izazvao je tešku sepsu i meningitis kod zebrica i mogao je zaraziti više od 30 vrsta riba [29]. Odabrali smo Streptococcus agalactiae i lipopolisaharide (LPS) za injekcije kako bismo istražili utjecaj CG na urođeni imuni sistem, u kombinaciji sa promjenama u parametrima vezanim za imunitet i ekspresijom gena.

2. Materijali i metode

2.1. Zebrafish, režimi hranjenja i tjelesna težina

Odrasle zebrice korišćene u eksperimentu kupljene su na Yuehe Fish-Bird-Flow marketu (Guangdžou, Kina) i aklimatizovane dve nedelje. Sav uzgoj ribe obavljen je u eksperimentalnoj stanici za uzgoj ribe na Univerzitetu Sun Yat-sen, provincija Guangdong, Kina. Svi eksperimenti na životinjama izvedeni su u skladu sa smjernicama i odobrenjem Komiteta za njegu i korištenje životinja Univerziteta Sun Yat-Sen. Tokom eksperimentalnog perioda pH se kretao od 7,8 do 7,9, rastvoreni kiseonik od 6,95 do 7,23 mg/L, a temperatura vode od 26,5 do 28 oC. Koncentracije amonijaka-N i nitratnog azota održavane su niže od 0.2 i 0.{{20}}05 mg/L, respektivno. Salinitet vode bio je 0,2 ppt. Zebrafish je održavan u ciklusu od 12:12-h svjetlo-tamno. Kako bi se istražile promjene tjelesne težine tokom posta i ponovnog hranjenja, tjelesna težina je snimana jednom sedmično. Početna tjelesna težina zebrice u eksperimentu bila je 0,35 ± 0,06 g, a bile su stare oko 3 mjeseca. Zebrice su nasumično razdvojene u rezervoare od 24 L, a svaki rezervoar je sadržavao 30 riba. Ponuđena im je komercijalna dijeta dva puta dnevno uz zasićenje hrane. Režimi hranjenja za svaki eksperiment su prikazani u tabeli 1. Nakon tretmana, zebrice su anestezirane predoziranjem MS-222 (Sigma, Burlington, MA, SAD) i žrtvovane. Zatim je bubreg uklonjen u Eppendorfovu epruvetu i odmah stavljen u tečni azot. Uzorak je prebačen iz tečnog azota i pohranjen na -80 oC.

2.2. Streptococcus agalactiae Challenge

Zebrice koje su bile podvrgnute postu i ponovnom hranjenju bile su izazvane Streptococcus agalactiae. Soj Streptococcus agalactiae je ljubazno obezbijedio profesor Anxing Li, Škola prirodnih nauka Univerziteta Sun Yat-sen [30]. Zebrice u svakoj grupi su dalje podijeljene u četiri male grupe, sa po 15 riba u svakoj manjoj grupi. Zebra u tri od ovih grupa je anestezirana sa 80 mg/L MS-222 i intraperitonealno je ubrizgana sa 5 uL koji sadrži 5 × 106 jedinica koje formiraju kolonije Streptococcus agalactiae. Preostalim zebricama je ubrizgano 5 uL PBS-a. Sve zebrice su posmatrane 4 dana bez hranjenja. Zabilježena je stopa mortaliteta.

2.3. LPS Injection

Zebrice koje su bile podvrgnute postu i ponovnom hranjenju (F24, S24 i F21R3) bile su izazvane LPS-om (Sigma, Burlington, MA, SAD). LPS prah je otopljen u sterilnoj vodi do konačne koncentracije od 1 mg/mL. Prije upotrebe, 1 mg/mL LPS je razrijeđen PBS, a konačna koncentracija je bila 20 ug/mL. Zebrice u svakoj grupi bile su podijeljene u dvije male grupe, a u svakoj manjoj grupi bilo je 12 riba. Ribama u dvije grupe davan je LPS i PBS. Zebrice su anestezirane sa MS-222 i intraperitonealno ubrizgane sa 5 uL 20 ug/mL LPS ili PBS. Nakon 3 h, zebrice su anestezirane i žrtvovane. Nakon toga, bubreg je uklonjen i držan na -80 oC.

2.4. Histopatologija

Zebrice su držane uz prihranjivanje 14 dana nakon gladovanja 21 dan. Uzorci su uzeti 21., 24., 28. i 35. dana. Nakon žrtvovanja, bubrezi zebrice su uklonjeni i uronjeni u 4% formaldehida. Zatim su bubrezi podvrgnuti parafinskom rezu. Preseci su obojeni hematoksilin-eozinom (HE) (Beyotime, Šangaj, Kina) i posmatrani svetlosnim mikroskopom (Olympus, Tokyo, Japan). Da bi se kvantifikovala promjena ozlijeđenih tubula i melano-makrofagnih centara (MMC), snimljeno je 5 slika koje se ne preklapaju sa svakog slajda. Područja ozlijeđenih tubula i cijeli uzorak mjereni su pomoću Cellsens softvera (Olympus, Tokio, Japan). Iz svake slike izračunat je udio ozlijeđenih tubula dijeljenjem površine ozlijeđenih tubula s površinom cijelog uzorka. Količina MMC-a je izbrojana na svakoj slici, a zatim podijeljena s površinom cijelog uzorka. Zatim su izračunate promjene nagiba MMC-a sa grupom F21 kao standardom.

2.5. Related Biochemical Parameter Assay

Sadržaj malondialdehida (MDA) i dušikovog oksida (NO) i enzimske aktivnosti SOD, alkalne fosfataze (ALP), katalaze (CAT), glutation peroksidaze (GSH-Px) i lizozima u bubrezima mjereni su odgovarajućim komercijalnim setovima u skladu sa protokolima proizvođača. ukratko,bubreziuklonjeni sa zebrice stavljeni su u tečni dušik i pohranjeni na -80 oC. Prije testiranja, svaki bubreg je izvađen i napravljen u homogenat u prethodno hladnom PBS-u sa disruptorom tkiva.Homogenat bubregacentrifugirano na 4 oC i 12,000× g 10 min i supernatant je uzet kaobubregekstrakt za detekciju. Sadržaj MDA detektovan je kompletom za analizu peroksidacije lipida MDA (Beyotime, Šangaj, Kina), a detekcija je zasnovana na reakciji boje između MDA i tiobarbiturne kiseline. Korišćena talasna dužina je 535 nm. Sadržaj NO mjeren je Griessovim reagensnim sistemom (Promega, Madison, WI, SAD). Griessov reagensni sistem se zasniva na reakciji nitrita sa sulfanilamidom i N-1-naftil etilendiamin dihidrokloridom u kiselim uslovima. Sadržaj NO je izračunat pomoću standarda natrijum nitrita i normalizovan na sadržaj proteina. Apsorpcija je mjerena pomoću filtera na 490 nm. Aktivnost lizozima je otkrivena pomoću kompleta za ispitivanje lizozima (Thermo Fisher, Waltham, MA, SAD) prema protokolu proizvođača. Ekstrakt bubrega inkubiran je sa ćelijskim zidom Micrococcus lysodeikticus konjugovanim s fluoresceinom. Fluorescencija je izmjerena nakon 45 min inkubacije na 37 oC, na talasnim dužinama ekscitacije i emisije od 485 i 535 nm. Vrijednost lizozima je izračunata putem standardne krive i normalizirana na sadržaj proteina. Enzimske aktivnosti SOD, ALP, CAT i GSH-Px odvojeno su detektirane pomoću kompleta za analizu tipa SOD, kompleta za analizu alkalne fosfataze, kompleta za analizu katalaze i kompleta za ispitivanje glutation peroksidaze (Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kina). Jedinica aktivnosti SOD je definirana kao količina SOD koja odgovara 50 posto inhibicije stope redukcije nitro plavog tetrazolijuma po mg proteina u sistemu od 1 mL. Korišćena talasna dužina je 570 nm. Jedinica aktivnosti ALP definirana je kao volumen enzima koji je reagirao sa supstratom kako bi proizveo 1 mg fenola za 30 minuta na 37 oC i normaliziran na sadržaj proteina. Korišćena talasna dužina je 490 nm. CAT aktivnost je bazirana na potrošnji vodikovog peroksida. Korišćena talasna dužina je 405 nm. Aktivnost GSH-Px mjerena je brzinom katalizatorske reakcije između vodikovog peroksida i GSH. Oduzimanjem neenzimske reakcije, jedinica GSH-Px aktivnosti je definisana kao smanjenje koncentracije GSH od 1 mol/L u svakom sistemu. Korišćena talasna dužina je 405 nm. Koncentracija proteina je izmjerena pomoću BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Šangaj, Kina). Korišćena talasna dužina je 570 nm.

2.6. ROS Production

Sadržaj ROS-a ububregodređen je fluorescentnom sondom 2/,7/- diklorofluorescein diacetatom (DCF-DA) (Sigma, Burlington, MA, SAD) kao što je prethodno opisano [28]. Ukratko, bubreg izvađen iz zebrice stavljen je u prethodno ohlađeni 100 uL PBS-a i pretvoren u homogenat sa disruptorom tkiva. Nakon centrifugiranja od 10 minuta sa 10,000 × g na 4 oC, 20 uLbubregekstraktje dodan u 96-jažice crne mikroploče, i 25 uM DCF-DA je dodano u svaku jažicu. Mikroploča je inkubirana na 37 oC 30 min. Fluorescencija je izmjerena u čitaču ploča sa više oznaka (PerkinElmer Victor X5, Waltham, MA, SAD) sa ekscitacionim i emisionim filterima postavljenim na 485 i 535 nm. Sadržaj proteina u ekstraktu bubrega mjeren je kompletom BCA Protein Assay Kit. Sadržaj ROS za svaki uzorak izračunat je normalizacijom vrijednosti fluorescencije na sadržaj proteina. Koncentracija proteina je izmjerena pomoću BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Šangaj, Kina). Korišćena talasna dužina je 570 nm.

2.7. Test respiratornog pucanja

Zebrice koje su bile podvrgnute postu i ponovnom hranjenju (F24, S24 i F21R3) korištene su za mjerenje respiratorne aktivnosti. Protokol za analizu respiratornog praska je izveden prema ranije objavljenoj metodi [31,32]. Ukratko,bubrezisu odvojeni od anestezirane zebrice i stavljeni u {{0}} mikroploče sa 100 uL Dulbecco-ovog modificiranog Eagleovog medijuma (DMEM)/F-12. Nakon inkubacije ploče u trajanju od 30 minuta na 28 oC, 100 uL DMEM/F-12 koji sadrži DCF-DA, dimetilsulfoksid (DMSO) i forbol miristat acetat (PMA) (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) je dato dodati u svaki otkriveni bunar. U međuvremenu, 100 uL DMEM/F-12 koji sadrži DMSO dodano je u svaku kontrolnu jažicu. Konačne koncentracije različitih otopina bile su sljedeće: 500 ng/mL DCF-DA, 0,2 posto DMSO i 200 ng/mL PMA. Fluorescencija je izmjerena u čitaču ploča sa više oznaka sa ekscitacionim i emisionim filterima postavljenim na 485 i 535 nm. Fluorescencija svakog bunara

mjeren je odmah nakon dodavanja rastvora u bunar i svakih 15 minuta nakon toga tokom 150 min. Vremenska tačka za poređenje vrednosti fluorescencije bila je 150 min. Vrijednosti fluorescencije neinducirane kontrolne grupe su oduzete od fluorescencije

vrijednosti pojedinačnih grupa izazvanih PMA. Izračunate su normalizirane vrijednosti fluorescencije. Ove normalizirane vrijednosti fluorescencije su sortirane u tri kolone.

2.8. Ekstrakcija RNK i PCR u realnom vremenu

Zamrznutibubrezimljeveni su u TRIzolu (Omega, Norcross, GA, USA) i ukupna RNK je odvojena prema protokolu [33]. Nakon digestije sa DNase1 (NEB, Ipswich, MA, SAD), cDNK je proizveden RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) sa Random Hexamer Primerom. qRT-PCR je postavljen u 10 uL reakcionih smjesa koje sadrže 5 uL 2× SYBR Green qPCR Master Mixa (Bike, Houston, TX, USA). Svi uzorci su rađeni u duplikatu i normalizirani na ekspresiju eEF1a1a. Sekvence oligonukleotidnih prajmera korišćenih u ovoj studiji opisane su u Dodatnoj tabeli S1. Relativna mRNA kvantifikacija mete u odnosu na referencu određena je korištenjem 2-AACT metode [34].

2.9. Statistička analiza

Kvantitativni podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD. Statističke analize su obavljene pomoću SPSS verzije 24 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Statistička poređenja između dve grupe vršena su pomoću Studentovog t-testa ili neparametarskog testa, u zavisnosti od rezultata testa normalnosti. Analize za više grupa sa normalnom distribucijom rađene su korišćenjem jednosmerne ANOVA, a ostale su izvedene korišćenjem neparametarskih testova. Svi statistički podaci i metode mogu se provjeriti u tabeli S2.

3. Rezultati

3.1. Promjene tjelesne težine i antibakterijskih svojstava Zebrafish tokom posta i hranjenja

Potpuni kompenzacijski rast je ostvaren kod zebrice. Nakon gladovanja od 7 do 14 dana, zebrice su izgubile najmanje 15 posto tjelesne težine. Nakon 14 dana ponovnog hranjenja, tjelesna težina zebrice u grupi koja je gladovala dostigla je onu u kontrolnoj grupi (Slika 1A-C). Nakon posta i ponovnog hranjenja, kako bi se istražila otpornost zebrica na patogene, intraperitonealno im je ubrizgan Streptococcus agalactiae. Zebrafish u grupi koja je gladovala imala je povećanu stopu mortaliteta u odnosu na kontrolnu grupu. Sa produženjem prihranjivanja, stopa smrtnosti je nastavila da opada (slika 1D).

Slika 1. Model kompenzacijskog rasta zebrice. A do C: promjena tjelesne težine zebrice tokom posta i ponovnog hranjenja. (A) Zebrice su gladne 7 dana i hranjene 28 dana. (B) Zebrice su postile 14 dana i hranjene 21 dan. (C) Zebrice su gladne 21 dan i hranjene 14 dana. n=21–22. (D) Stopa preživljavanja zebrica kojima je intraperitonealno ubrizgan S. agalactiae; F: hranjenje; S: gladovanje; R: ponovno hranjenje. n=3, *: p < {{10}}.05,="" **:="" p="">< 0.01;="" ***:="" p=""><>

3.2. Morfološke promjene bubrega zebrice tokom posta i hranjenja

Thebubregje glavno imunološko tkivo zebrica. Gladovanje je izazvalo morfološke promjene ububrezi. Nakon 21 dana gladovanja, bubreg je pokazao očigledne morfološke promjene. Utvrdili smo da se više ozlijeđenih tubula sa hijalinskim kapljicama pojavilo nakon ponovnog hranjenja 3 i 5 dana. Ova situacija se popravila nakon 7 dana. Osim toga, uočeno je da je broj melanomakrofagnih centara (MMC) ububregpovećan nakon gladovanja (Slika 2A-C). Uz ponovno hranjenje, ovaj simptom je spašen. Ekspresija mRNA havcr1 se povećala nakon gladovanja (slika 2D), što pokazuje da gladovanje može uzrokovatibubregpovreda.

Slika 2. Morfološke promjene ububrezizebrice tokom posta i ponovnog hranjenja. (A) HE-bojenjebubregkod zebrica tokom posta i ponovnog hranjenja. Crni trokut označava ozlijeđene tubule. Crvena strelica označava MMC-ove. Crvena zvijezda označava kapljice hijalina. (B) Statistička analiza udjela ozlijeđenih tubula ububreg. (C) Statistička analiza MMC-a u bubrezima. n=3–4. (D) Relativna ekspresija mRNA gena havcr1 ububregzebrice tokom posta i ponovnog hranjenja. n {{0}}–10. F: hranjenje; S: gladovanje; R: ponovno hranjenje. *: p <>

3.3. Oksidativni stres je izazvan tokom posta i hranjenja

Sadržaj MDA je značajno povećan nakon gladovanja 21 i 24 dana i smanjen nakon 3 dana ponovnog hranjenja (Slika 3A). Međutim, sadržaj ROS se smanjio sa 24 dana gladovanja i oporavio se hranjenjem za 7 dana (Slika 3B). Sadržaj NO se povećao nakon 21 dana gladovanja (Slika 3C). Aktivnost antioksidativnih enzima, uključujući SOD, GSH-Px i CAT, povećana je nakon gladovanja. Aktivnosti GSH-Px i CAT brzo su opadale i oporavile se 3. dana ponovnog hranjenja. Iako je aktivnost SOD-a opala s prihranjivanjem, ona je i dalje bila viša od one u kontroli (Slika 4).

Slika 3. Oksidativni stres u bubrezima zebrice tokom posta i ponovnog hranjenja. (A) Sadržaj MDA u bubrezima. (B) Promjena ROS u bubregu. (C) Sadržaj NO u bubrezima. F: hranjenje; S: gladovanje; R: ponovno hranjenje. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

Slika 4. Aktivnost enzima u antioksidativnim sistemima ububrezizebrice tokom posta i ponovnog hranjenja. (A) Aktivnost SOD u bubrezima. (B) Aktivnost GSH-Px u bubrezima. (C) Aktivnost CAT-a u bubrezima. F: hranjenje; S: gladovanje; R: ponovno hranjenje. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

3.4. Na urođeni imunološki sistem bubrega zebrice uticali su post i hranjenje

Aktivnost ALP se povećala u bubrezima nakon gladovanja i smanjila nakon ponovnog hranjenja (Slika 5A). Sa dohranjivanjem u trajanju od 7 dana, nije bilo značajne razlike između grupe za prihranjivanje i kontrolne grupe. Aktivnost lizozima u bubrezima pokazala je sličan trend kao ALP, koji se povećavao natašte (Slika 5B). Brzo je opao nakon ponovnog hranjenja. Reakcija na respiratorni udar u bubrezima nije pokazala značajne promjene u različitim grupama, ali je odgovor bio veći u grupi koja je gladovala i hranila se (Slika 5C). Ekspresija mRNA proinflamatornog citokina il-1 pokazala je značajno povećanje u svim grupama na gladovanju, ali je brzo opala nakon ponovnog hranjenja (Slika 6A). Ekspresija mRNA tgfb1a i tgfb1b pokazala je isti trend kao il-1 (Slika 6E,F). Međutim, ekspresija mRNA nfkb1 značajno se povećala tek nakon 24 dana gladovanja i smanjila se nakon ponovnog hranjenja 3 dana. Ekspresija mRNA nfkb2 pokazala je trend sličan onom kod nfkb1 (slika 6B, C). Gen arg2 kodira arginazu II, koja je povezana sa proinflamatornim odgovorom. Osim toga, ekspresija mRNA arg2 se značajno povećala u svim grupama na gladovanju i smanjena je nakon ponovnog hranjenja (slika 6D). Nakon izazivanja zebrice koja je prošla post i ponovno hranjenje, odgovor je bio jači u grupi koja je postila. Ekspresija mRNA il-1 i mmp9 u grupi liječenoj LPS natašte bila je značajno veća od one u kontrolnim grupama koje su tretirane LPS ili su se hranile (slika 7).

Slika 5. Parametri urođenog imunog sistema ububrezizebrice tokom posta i ponovnog hranjenja. (A) Aktivnost ALP u bubrezima zebrice tokom posta i ponovnog hranjenja. (B) Aktivnost lizozima ububregzebrice tokom posta i ponovnog hranjenja. (C) Reakcija na respiratorni udar bubrega kod zebrice nakon gladovanja i hranjenja. (C1) Vrijednost fluorescencije/proteina bubrega u različito vrijeme. (C2) Vrijednosti fluorescencije/proteinabubregu 150 min. (C3) Normalizacija vrijednosti fluorescencije/proteina bubrega na 150 min. F: hranjenje; S: gladovanje; R: ponovno hranjenje. n=12. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0.01;="" ***:="" p=""><>

Slika 6. Relativna ekspresija mRNA gena povezanih sa imunitetom u bubrezima zebrice tokom posta i ponovnog hranjenja. (A–F):il-1, nfkb1, nfkb2, arg2, tgfb1a i tgfb1b. F: hranjenje; S: gladovanje; R: ponovno hranjenje. n=8–1{{10}}. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0.01;="" ***:="" p=""><>

Slika 7. Relativna ekspresija mRNA gena povezanih s imunitetom ububrezizebrice izazvane sa 5 uL 20 ug/mL LPS-a nakon posta i ponovnog hranjenja. (A–C) il-1 , mmp9 i nfkb1. F: hranjenje; S: gladovanje; R: ponovno hranjenje. n=8–12. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

4. Diskusija

U ovoj studiji otkrili smo da se potpuni CG može ostvariti kod zebrica nakon različitog trajanja gladovanja. Čak i nakon 3 sedmice gladovanja, tjelesna težina zebrice je nakon dvije sedmice dostigla masu kontrolne grupe. Ovaj rezultat je u skladu s prethodnim radom [28]. Studije su pokazale da gladovanje i ponovno hranjenje utiču na metaboličko stanje zebrice [27,28]. Kod uzgojenih vrsta, značaj CG je u tome što poboljšava efikasnost proizvodnje. Za uzgojene vrste je važno da zadrže antibakterijska svojstva tokom posta i hranjenja. Tokom ovog procesa, zebra ima potencijal da pati od patogena. Prijavljeno je da gladovanje nije uticalo na imuni odgovor kod inficiranih Piaractus mesopotamicus [18]. Nažalost, post je podstakao osjetljivost zebrica na S. agalactiae. Istovremeno, gladovanje je pod uticajem biohemijskih parametara i ekspresije mRNA urođenog imunog sistema.

Kod zebrice, limfni čvorovi su odsutni, a bubreg je primarni limfoidni organ, ekvivalentan koštanoj srži sisara [24]. Kod odraslih zebrica, bubreg je glavno mjesto hematopoeze [35]. Populacije u srži bubrega sadrže mnoge tipove hematopoetskih ćelija, uključujući makrofage, neutrofile i limfocite [36,37]. Pravilna funkcija bubrega važna je za urođeni imuni sistem zebrica. U ovoj studiji uočili smo neke morfološke promjene u bubrezima zebrica podvrgnutih gladovanju. Taloženje MMC-a u bubrezima značajno se povećalo nakon gladovanja. Ranije je utvrđeno da gladovanje može uzrokovati taloženje melanomakrofaga (MM) u bubrezima i slezeni kod riba [38]. MMC se uglavnom pojavljuju u bubrezima, jetri i slezeni i difuzni su i manje strukturirani u bubrezima [39]. Smatra se da MMC funkcionišu iu imunološkoj odbrani i normalnim, neimunološkim, fiziološkim procesima. Primarna funkcija MMC-a je fagocitoza. Smatra se da MMC mogu učestvovati i u urođenim i u adaptivnim imunološkim odgovorima. Dodavanje MMC-a nakon gladovanja može biti posljedica hemofagocitoze i čišćenja staničnih ostataka. Osim toga, u prvim danima prihranjivanja uočena je struktura hijalinskih kapljica. Smatra se da prisustvo hijalinskih kapljica uglavnom ukazuje na alfa2u-globulin u tubularnim epitelnim ćelijama [40]. Osim toga, u modelu histiocitnog sarkoma, neoplastični histiociti proizvode lizozim, a lizozim se akumulirao u tubularnim epitelnim stanicama [41]. Ukratko, do stvaranja hijalinskih kapljica dolazi jer bubreg ne može probaviti protein koji se nakuplja u tubularnim epitelnim stanicama. Nivo KIM-1 (kodiran sa havcr1) može ukazivati ​​na strukturno oštećenje tubula [42]. Nakon gladovanja, ekspresija mRNA havcr1 značajno se povećala i smanjila s ponovnim hranjenjem. Možemo predvidjeti da je funkcija bubrega poremećena postom, a prihranjivanjem se funkcija bubrega oporavlja. Međutim, zahtjevi su opterećujući na početku prihranjivanja.

Fagocitoza je važan proces odbrane urođenog imunološkog sistema riba. Oksidativni stres će ograničiti imuni odgovor [20]. Antioksidativna odbrana uglavnom zavisi od enzima. SOD, GPx i katalaza su važne komponente antioksidativnih sistema [43]. SOD posreduje u konverziji superoksidnog anjona i H2O2. Katalaza učestvuje u detoksikaciji H2O2 u vodu. GPx katalizira hidroperokside (npr. H2O2 i lipidne hidroperokside) u H2O oksidacijom glutationa (GSH) u glutation disulfid (GSSH) [43–45]. MDA je jedan od glavnih proizvoda oksidacije lipida i proizvodi se od polinezasićenih masnih kiselina (PUFA) kemijskim reakcijama i reakcijama kataliziranim enzimima. ROS može peroksidirati PUFA-e kako bi stvorio MDA. Sadržaj MDA je biomarker koji se obično koristi za procjenu oksidativnog stresa [46]. U ovom radu, iako je smanjen sadržaj ROS, sadržaj MDA u bubrezima je značajno povećan, a takođe je povećana aktivnost svih enzima koji pripadaju antioksidativnom sistemu. Detekcija ROS-a je prolazni odgovor. Promjena aktivnosti enzima antioksidansa rezultat je dugotrajnog gladovanja. Suprotni trendovi između ROS i antioksidativnih enzima mogu biti posljedica činjenice da normalni procesi stanične aktivnosti proizvode ROS, dok produženo gladovanje dovodi do smanjene ćelijske aktivnosti. Ovaj rezultat je pokazao da je gladovanje uzrokovalo oksidativni stres u bubrezima na kroničan način. Trajni oksidativni stres može uzrokovati oštećenje tvari u stanicama kao što su lipidi i proteini i konačno dovesti do apoptoze i akumulacije oksidiranih molekularnih agregata [20]. U teleostima je prijavljeno da je gladovanje izazvano sadržajem MDA u jetri i crijevima i povećalo aktivnost antioksidativnih enzima [47–49]. Ovi rezultati su implicirali da iako je antioksidativni sistem bio aktiviran, nije bio dovoljan da se ukloni šteta uzrokovana gladovanjem. U međuvremenu, oksidativni stres može aktivirati veliki raspon faktora transkripcije, kao što su NF-kB, Nrf2 i HIF-1a. Nakon toga, ovi faktori transkripcije indukuju ekspresiju mnogih citokina i hemokina. Dakle, oksidativni stres može dovesti do kronične upale [44].

Izazvan sa Streptococcus agalactiae, zebrice u grupi koja je gladovala pretrpjela je veću smrtnost od onih u kontrolnoj grupi. U međuvremenu, aktivnost ALP i lizozima se poboljšala gladovanjem. Lizozim je važna komponenta urođenog imunološkog sistema riba i učestvuje u procesu fagocitoze [50]. Prema rezultatima, gladovanje je izazvalo ekspresiju mRNA il-1 , nfkb1, tgfb1a, tgfb1b i arg2. Ove promjene mogu biti uzrokovane oksidativnim stresom. TGFB1 je citokin koji ima i pro- i anti-inflamatorne efekte [51]. Rekombinantni TGFB1 pokazao je imunosupresivnu aktivnost i smanjio ekspresiju proinflamatornih citokina u leukocitima teleosta. Kod zebrice ekspresija tgfb1a je izazvala upalu u jetri [52]. Kronična indukcija tgfb1a aktivirala je upalu, a njegova ekspresija je izazvala fibrozu jetre u ranom hepatocelularnom karcinomu u zebrice. Arginaza je primordijalni enzim i odgovoran je za pretvaranje L-arginina u L-ornitin i ureu. Arginaza ima dva izoenzima (arginazu I i arginazu II) [53,54]. Arginaza II je gen vezan za imunost i utvrđeno je da je povezana s proinflamatornim odgovorima u makrofagima preko mitohondrijske ROS. Ovi podaci su pokazali da gladovanje može izazvati imuni odgovor u bubrezima. Kod miševa je gladovanje smanjilo osjetljivost na LPS i nije utjecalo na ekspresiju il-1 [55]. Međutim, zebrice stimulirane LPS-om pokazale su grubi odgovor na LPS, a ekspresija il-1 i mmp9 bila je značajno veća nego u drugim grupama. Za razliku od miševa, zebrice su postale osjetljivije na LPS nakon gladovanja, tako da gladovanje može umanjiti njihovu sposobnost uklanjanja patogena.

5. Zaključci

U ovoj studiji preliminarno smo istražili uticaj posta i ponovnog hranjenja na urođeni imuni sistem zebrice. Kod zebrice je ostvaren kompenzacijski rast, praćen povećanom osjetljivošću na patogene nakon gladovanja. Oksidativni stres – uzrokovan gladovanjem i molekularnim obrascima povezanim s opasnošću koje proizvode oštećeni bubrežni tubuli – mogao je doprinijeti upali. Potrebno je dalje istraživanje kako bi se istražilo kako gladovanje povećava osjetljivost i kako metaboličko stanje utječe na različite vrste imunoloških stanica.

Dodatni materijali: Sljedeće je dostupno na mreži na https://www.mdpi.com/article/10 .3390/biom11060825/s1, Tabela S1: Lista prajmera korišćenih u ovoj studiji; Tabela S2: Statistički rezultat eksperimenta.

Doprinosi autora: Konceptualizacija, ZL i WL; Kuriranje podataka, JJ; Formalna analiza, ZL i DL; Pribavljanje sredstava, WL; Istraga, ZL, DL, RC i YY; Metodologija, ZL; Nadzor, WL; Pisanje—originalni nacrt, ZL; Pisanje—recenzija i uređivanje, WL Svi autori su pročitali i složili se sa objavljenom verzijom rukopisa.

Finansiranje: Ovaj rad je finansiran od strane Nacionalnog ključnog programa za istraživanje i razvoj Kine (2018YFD0900101), Kineskog istraživačkog sistema poljoprivrede Ministarstva finansija i poljoprivrede (CARS-46) i Programa za kineske izvanredne talente u poljoprivrednim naučnim istraživanjima ({{3 }}) u Wensheng Li.

Izjava institucionalnog odbora za reviziju: Studija je provedena u skladu sa smjernicama Helsinške deklaracije i odobrena od strane Komiteta za njegu i korištenje životinja Univerziteta Sun Yat-Sen.

Izjava o informiranom pristanku: Nije primjenjivo.

Izjava o dostupnosti podataka: Nije primjenjivo.

Sukob interesa: Autori izjavljuju da nemaju sukob interesa.